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제안 방법
- 5주간 사육한 횐쥐를 12시간 절식시킨 후 에테르로 마취 시켜 적출한 뇌조직을 5 mM EDTA를 함유한 10 mM 인산 완충액 (pH 7.4)을 가하여 빙 냉하에서 마쇄한 균질액(10%, w/v)을 얻어, 600Xg에서 20분간 원심분리(Hi- tachi 20 PR-52)하여 핵 및 미 마쇄 부분을 제거한 상징 액을 얻었다. 이를 lQOOOxg에서 20분간 원심분리하여 미토콘드리 아 분획을 취하였으며, 분리된 상징액을 105, 000 xg에서 1시간 동안 초원심분리하여 시토졸 분획과 마이크로 솜 분획을 취하였다.
- 이를 lQOOOxg에서 20분간 원심분리하여 미토콘드리 아 분획을 취하였으며, 분리된 상징액을 105, 000 xg에서 1시간 동안 초원심분리하여 시토졸 분획과 마이크로 솜 분획을 취하였다. 시 토졸 분획 은 alcohol dehydro- genase(ADH), aldehyde oxidase(AO), xanthine oxidase (XO), superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px) 및 glutathione S-transferase(GST) 활성 도 측정 의 효소원으로 사용하였으며 , 미토콘드리 아 분획은 a!d나wde dehydrogenase]ALDH)와 catalase(CAT) 활성측정에, 마이크로솜 분획은 cytochrome P450(P450) 함량 및/aminopyrine demethylase(AD)오扌 aniline hydro- xylase(AH) 활성측정에 사용하였다.
- 또한 에탄올을 투여한 흰쥐의 뇌조직 중 아세트알데히드 함량이 혈중보다 낮음은 뇌조직 이 아세트알데히드를 산화할 수 있음을 의 미한다(6). 그러나 논란 중에 있는 뇌 에서의 에탄올 대사와 생리적 중요성에 관한 비교.연구는 미비한 실정이다.
- 이상의 조작은 4℃이 하에서 행하였다. 기 포생 성 이 끝난 후 파장 400 - 500 nm에서 흡광도의 차이를 P450 CO complex의 분자흡광계수 91 mM-1 cm〔를 이용하여 P450의 함량을 계산하였다. 마이크로 솜의 P450 함량은 단백질 1 mg당 nmole로 나타내었다.
- 따라서 민간과 한방에서 널리 사용되는 칡을 갈화(Tuer- ariae Flos丿와 갈근CPuerMae Radix)으로 나누어 추출물을 얻은 다음 에탄올을 투여한 횐쥐에게 각각 수준별로 급여함으로써 뇌조직에서 칡추출물이 에탄올의 생화학적 대사에 미치는 영향을 관찰하였다.
- 동결건조한 후 사용하였다. 본 실험에 사용한 실험식이는 갈화와 갈근을 실험동물 체중 kg당 1.2 g(1)과 2.4 g(U) 수준이 되도록 조제하여 5주간 급여하였다. 에탄올투여 량은 Fujii 등(15)의 방법에 의해 25% 에탄올을 체중 kg당 5 g 수준으로 1일 1회 일정시각에 경구투여하였으며 물은 제한없이 공급하였다.
- 4 g(U) 수준이 되도록 조제하여 5주간 급여하였다. 에탄올투여 량은 Fujii 등(15)의 방법에 의해 25% 에탄올을 체중 kg당 5 g 수준으로 1일 1회 일정시각에 경구투여하였으며 물은 제한없이 공급하였다.
- 4)을 가하여 빙 냉하에서 마쇄한 균질액(10%, w/v)을 얻어, 600Xg에서 20분간 원심분리(Hi- tachi 20 PR-52)하여 핵 및 미 마쇄 부분을 제거한 상징 액을 얻었다. 이를 lQOOOxg에서 20분간 원심분리하여 미토콘드리 아 분획을 취하였으며, 분리된 상징액을 105, 000 xg에서 1시간 동안 초원심분리하여 시토졸 분획과 마이크로 솜 분획을 취하였다. 시 토졸 분획 은 alcohol dehydro- genase(ADH), aldehyde oxidase(AO), xanthine oxidase (XO), superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px) 및 glutathione S-transferase(GST) 활성 도 측정 의 효소원으로 사용하였으며 , 미토콘드리 아 분획은 a!d나wde dehydrogenase]ALDH)와 catalase(CAT) 활성측정에, 마이크로솜 분획은 cytochrome P450(P450) 함량 및/aminopyrine demethylase(AD)오扌 aniline hydro- xylase(AH) 활성측정에 사용하였다.
- 칡추출물이 알코올성 뇌손상에 미치는 영향을 구명하기 위해 알코올을 투여한 흰쥐 에 게 갈화와 갈근을 수준별 (I ■-1.2 g/kg B.W., n : 2.4 g/kg B.W.)로 5주간 급여한 후 칡 열수추출물이 알코올 대사와 유리기 생성 및 제거 효소 활성에 미치는 영향을 관찰하였다. ADH 활성은 갈화 및 갈근추출물 급여 시 에탄올만 투여한 대조군에 비하여 유의적으로 감소한 반면, ALDH 활성은 갈근추출물 급여 군에서 유의적으로 증가하였는데 I수준군의 증가 정도가 현저하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 기본식이는 AIN-93Q4)에 준하여 (Table 1) 조제하였으며, 단백질 급원은 카제인(Teklad Co.)을 공급하였고, 탄수화물 급원으로는 옥수수 전분(두산), 지방 급원으로는 대두유(제일제당)를 사용하였다.
- 실험동물은 4주령 Sprague Dawley계의 수컷 흰쥐 35 마리를 1주일간 기본식이로 적응시킨 후 평균 체중 110 士 10 g인 것을 난괴법에 의해 5군으로 나누어 한 마리씩 분리하여 5주간 사육하였다. 사육실 온도는 18±2℃로 유지하였으며, 조명은 12시간 주기(08 : 00-20: 00)로 조절하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 SAS package# 이용하여 실험군당 평균 土표준편차로 표시하였고 각 군간 평균치의 통계적 유의성은 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple test(28)에 의해 검정하였다.
이론/모형
- ADH 활성은 Bergmeyer(17)의 방법으로 ALDH 활성은 Koivula와 Koivusalo(18)의 방법에 준하여 측정 하였다. AD와 AH 활성은 Imai 등(19)의 방법으로 측정 하여 활성도를 각각 1분당 1 mg 단백질이 생성 하는 포름알데히드의 양과 °-아미노페놀의 양을 nmole로 나타내었다.
- AD와 AH 활성은 Imai 등(19)의 방법으로 측정 하여 활성도를 각각 1분당 1 mg 단백질이 생성 하는 포름알데히드의 양과 °-아미노페놀의 양을 nmole로 나타내었다. AO 활성도는 Rajagopalan 등(20)의 방법으로, XO는 Stirpe 와 D이la(21)의 방법에 준하여 측정하였다.
- AD와 AH 활성은 Imai 등(19)의 방법으로 측정 하여 활성도를 각각 1분당 1 mg 단백질이 생성 하는 포름알데히드의 양과 °-아미노페놀의 양을 nmole로 나타내었다. AO 활성도는 Rajagopalan 등(20)의 방법으로, XO는 Stirpe 와 D이la(21)의 방법에 준하여 측정하였다. SOD 활성 측정은 피로갈롤 자동산화의 억 제정도를 관찰하는 Mark- hind와 Marklund(22)의 방법에 의해 측정하여 피 로갈롤의 자동산화를 50% 억제 하는 정도를 lunit로 나타내 었으며, CAT 활성도는 A此i(23)의 방법으로 기질인 10 mM 과산화수소 용액 및 효소액을 가하여 25℃에서 반응시 켜 240 nml에서 소실되는 과산화수소의 양을 측정하였다.
- AO 활성도는 Rajagopalan 등(20)의 방법으로, XO는 Stirpe 와 D이la(21)의 방법에 준하여 측정하였다. SOD 활성 측정은 피로갈롤 자동산화의 억 제정도를 관찰하는 Mark- hind와 Marklund(22)의 방법에 의해 측정하여 피 로갈롤의 자동산화를 50% 억제 하는 정도를 lunit로 나타내 었으며, CAT 활성도는 A此i(23)의 방법으로 기질인 10 mM 과산화수소 용액 및 효소액을 가하여 25℃에서 반응시 켜 240 nml에서 소실되는 과산화수소의 양을 측정하였다. 또한 Paglia와 Valentine(24)의 방법에 준하여 GSH-Px 활성은 산화형 글루타티온이 NADPH에 의해 환원될 때 흡광도 340 nm에서 NADPH 감소량을 측정하였으며, GST 활성은 Habig 등(25)의 방법에 준하여 2, 4-디 니트로클로로벤젠(DNCB)과 환원형 글루타티온을 기질로 하여 생성된 GSH-DNCB 공액의 분자 흡광도 계수 9.
- 간조직 중의 P450의 함량 측정은 Omura와 Sato(26, 27) 의 방법에 준하여 시험관에 마이크로솜 분획을 넣고 19 K 바늘을 통해 1분간 CO 가스를 발생 시 킨 후 환원제로 디티오니트 나트륨 30 mg을 넣어 잘 혼합한 다음, 1분간 CO 가스를 발생 시켰다. 이상의 조작은 4℃이 하에서 행하였다.
- SOD 활성 측정은 피로갈롤 자동산화의 억 제정도를 관찰하는 Mark- hind와 Marklund(22)의 방법에 의해 측정하여 피 로갈롤의 자동산화를 50% 억제 하는 정도를 lunit로 나타내 었으며, CAT 활성도는 A此i(23)의 방법으로 기질인 10 mM 과산화수소 용액 및 효소액을 가하여 25℃에서 반응시 켜 240 nml에서 소실되는 과산화수소의 양을 측정하였다. 또한 Paglia와 Valentine(24)의 방법에 준하여 GSH-Px 활성은 산화형 글루타티온이 NADPH에 의해 환원될 때 흡광도 340 nm에서 NADPH 감소량을 측정하였으며, GST 활성은 Habig 등(25)의 방법에 준하여 2, 4-디 니트로클로로벤젠(DNCB)과 환원형 글루타티온을 기질로 하여 생성된 GSH-DNCB 공액의 분자 흡광도 계수 9.6 nM4cm-1 를 이용하여 효소활성도를 산출하였다.
- 효소의 활성 도는 bovine serum albumine- 표준 품으로 하여 Lowry 등(16)의 법에 준해 측정한 단백질 mg당 고유 활성도로 나타내었다.
성능/효과
- 1)Puerariae plant water extracts were supplemented in a a diet based on 1.2 g (Ⅰ) or 2.4 g (Ⅱ) raw Puerariae Flos or Radix/kg body weight/day.
- 급여 수준에 따른 차이는 I 수준이 II 수준에 비하여 효과적 이 었으나 유의성은 관찰되지 않았다. 15% 에탄올은 횐쥐 뇌의 ADH 활성을 유의적으로 증가시 켰다는 보고(31)와 같이 본 실험 에서 에탄올 중독된 횐쥐 뇌조직의 증가된 ADH 활성이 칡추출물 급여시 정상화되었으며, 특히 갈근의 효과가 큰 것으로 관찰되었다.
- P450 함량과 AD, AH 활성은 대조군에 비하여 칡 열수추출물 급여시 감소되는 경향이었는데 갈근 급여군의 감소효과가 현저 하게 나타났다. A0와 X0 활성은 갈화 및 갈근추출물 급여군이 대조군에 비하여 감소되었는데 특히 갈근추출물 I수준군에서 현저하게 나타났다. SOD 활성은 칡 열수추출물 급여시 증가하였으며 CAT와 GSH-Px 활성은 에탄올 투여로 증가된 활성이 갈근 열수추출물 I 수준 급여 시 유의적으로 감소되 었고 GST 활성은 갈화 및 갈근 열수추출물 급여 시 유의 적으로 증가되었다.
- )로 5주간 급여한 후 칡 열수추출물이 알코올 대사와 유리기 생성 및 제거 효소 활성에 미치는 영향을 관찰하였다. ADH 활성은 갈화 및 갈근추출물 급여 시 에탄올만 투여한 대조군에 비하여 유의적으로 감소한 반면, ALDH 활성은 갈근추출물 급여 군에서 유의적으로 증가하였는데 I수준군의 증가 정도가 현저하였다. P450 함량과 AD, AH 활성은 대조군에 비하여 칡 열수추출물 급여시 감소되는 경향이었는데 갈근 급여군의 감소효과가 현저 하게 나타났다.
- AH 활성은 대조군에 비하여 갈화추출물 및 갈근추출물 급여시 각각 약 50%와 63%정도 감소되었다. 반면 추출물 급여 수준이나 부위 별에 따른 유의 적 인 영 향은 관찰되 지 않았다.
- ADH 활성은 갈화 및 갈근추출물 급여 시 에탄올만 투여한 대조군에 비하여 유의적으로 감소한 반면, ALDH 활성은 갈근추출물 급여 군에서 유의적으로 증가하였는데 I수준군의 증가 정도가 현저하였다. P450 함량과 AD, AH 활성은 대조군에 비하여 칡 열수추출물 급여시 감소되는 경향이었는데 갈근 급여군의 감소효과가 현저 하게 나타났다. A0와 X0 활성은 갈화 및 갈근추출물 급여군이 대조군에 비하여 감소되었는데 특히 갈근추출물 I수준군에서 현저하게 나타났다.
- A0와 X0 활성은 갈화 및 갈근추출물 급여군이 대조군에 비하여 감소되었는데 특히 갈근추출물 I수준군에서 현저하게 나타났다. SOD 활성은 칡 열수추출물 급여시 증가하였으며 CAT와 GSH-Px 활성은 에탄올 투여로 증가된 활성이 갈근 열수추출물 I 수준 급여 시 유의적으로 감소되 었고 GST 활성은 갈화 및 갈근 열수추출물 급여 시 유의 적으로 증가되었다.
- SOD와 함께 활성산소종에 대응하여 뇌세포의 노화를 방어 하는데 중요한 역할을 하는 CAT 활성은 갈화와 갈근 추출물 급여시에 탄올군에 비하여 유의 적 으로 감소되었는데, CAT 활성에 칡의 부위별이나 수준별에 따른 유의적인 변화는 관찰되지 않았다. Aragon 등(42)은 흰쥐의 뇌 에서 과산화수소의 존재와 생성을 확인하였고 CAT 에 의해 생성된 아세트알데히드가 에탄올의 신경약리학적 활성 에 중추적 역할을 한다고 보고하였다.
- 뇌조직 중의 P450 함량은 대조군에 비하여 갈화 및 갈근추출물 급여 군 모두에서 감소되는 경향을 보였는데 , 갈근추출물 I군의 감소 정도는 유의적 이었다. 뇌조직의 P450 은 에탄올 및 약물과 같은 이물질뿐만 아니라 내적 물질대사에도 중요한 역할을 하며 NADPH-P450 환원제와 mixied function oxidase계를 이룬다(34).
- 또 다른 유리기 생성 효소계인 AD의 활성 역시 대조군에 비하여 갈화와 갈근추출물 I급여군에서 유의적인 감소를 보였으며 갈근추출물 I군의 감소효과가 현저하게 나타났다. AH 활성은 대조군에 비하여 갈화추출물 및 갈근추출물 급여시 각각 약 50%와 63%정도 감소되었다.
- 또한 뇌조직 에 다량 존재하는 다가불포화지방산으로 인한 과산화적 손상으로부터 뇌를 보호하는 주 기전인 GSH-Px 활성은 갈근추출물 I수준군이 가장 낮았으며, 다른 실험군은 유의적이지는 않으나 대조군에 비하여 감소되는 경향이 었다. 이는 에탄올 투여로 인하여 감소된 SOD 활성 에 대한 보상효과(45)로 GSH-Px 활성이 증가된 것으로 생각되는데, 갈근추출물 I급여군은 에탄올에의 해 증가된 GSH-Px 활성이 회복되는 것으로 보아 칡 추출물 특히, 적정량의 갈근 열수추출물은 에탄올 독성으로부터 뇌조직을 보호할 수 있을 것으로 사료된다.
- 본 실험 결과 뇌조직 중 ADH 활성은 대조군에 비하여갈 화 및 갈근추출물 급여 시 유의 적 인 감소를 나타내 었는데 갈근추출물이 갈화추출물에 비하여 에탄올 투여 에 따른 활성 억제효과가 큰 것으로 나타났다. 급여 수준에 따른 차이는 I 수준이 II 수준에 비하여 효과적 이 었으나 유의성은 관찰되지 않았다.
- 있다. 본 실험 결과 에탄올 투여로 감소된 SOD의 활성은 갈화와 갈근추출물 급여 시 회복되는 경향이 었으며 , 특히 갈근 I수준군의 활성 증가가 유의적인 것으로 관찰 되 므로써 에탄올이 SOD의 활성 감소를 유도하여 뇌 조직에 가하는 산화적 스트레스는 적정 량의 갈근추출물 급여 시 완화될 수 있을 것으로 사료된다.
- 에탄올 투여 에의하여 간의 P450계의 많은 기질들은 중추신경계에 영향을 미치며, 뇌의 P450은 비록 소량이지만 생리적 중요성을 지니는 것은 기질 특이성과 시토크롬의 특징 때문(35) 인 것으로 알려져 있다. 본 실험결과 에탄올은 P450을 통하여 유리기 생성을 유도하여 신경독성을 유발할 것이며갈화 및 갈근 열수추출물 급여 시 그 함량이 다소 감소됨으로써 독성이 완화될 것으로 사료된다.
- 뇌 조직의 ALDH는 마이크로 몰몰 단위의 낮은 농도의 아세트알데히드와 포합하여 뇌의 정상적 기능을 저해할 수 있음이 보고(32)되어 있다. 본 실험에서 ALDH 활성은 갈근추출물군 I군에서 가장 높게 나타났으며 , 갈화 추출물 군의 활성도 유의적이지는 않았으나 대조군에 비하여 증가하는 경향이 었다. 이는 에탄올 투여 시 뇌조직 의 ALDH 활성이 유의적으로 감소되 었다는 Spivak 등(33) 의 보고로 보아 에탄올에 의해 감소된 ALDH활성이 칡 추출물 급여시 증가됨으로써 아세트알데히드의 전환에 효과적일 것으로 사료된다.
- 에탄올 투여 시 XO 활성은 증가되는데이는 에탄올이 잔틴탈수소효소가 XO로의 전환뿐만 아니라 퍼 옥시 솜아실보효소 산화제의 활성 증가로 산화적 스트레스를 가한 때문(41)으로 알려져 있다. 본 실험에서 XO 의 활성이 칡추출물을 급여한 모든 군에서 감소되 었는데갈근추출물 I군의 감소 정도가 현저한 것으로 나타났다.
- 셀렌 비의존성 효소인 GST 활성은 칡 열수추출물 급여 시 유의적인 활성 증가를 관찰할 수 있었으며 , 갈근추출물 I급여군의 활성 증가가 현저하였다. 독성물질의 친전자성 체 에 환원형 글루타티온을 포합시 키며 형글루타티온티오에스테르 형 성반응을 촉매하여 무독화한다고(46) 알려 진 GST가 비록 과산화수소를 분해 할 수 없으나 셀렌이 결핍된 조직의 과산화물 분해 에 이용되므로써 뇌 조직 중의 GST 활성이 감소된 것으로 사료된다.
- 및 OH를 생성한다(38). 에탄올 대조군에 비 하여 AO 활성은 갈근추출물 I군만 유의적 으로 감소되 었고 갈화 I수준 급여군은 활성 감소 정도가 유의적이지는 않았다.
- 경향이 었다. 이는 에탄올 투여로 인하여 감소된 SOD 활성 에 대한 보상효과(45)로 GSH-Px 활성이 증가된 것으로 생각되는데, 갈근추출물 I급여군은 에탄올에의 해 증가된 GSH-Px 활성이 회복되는 것으로 보아 칡 추출물 특히, 적정량의 갈근 열수추출물은 에탄올 독성으로부터 뇌조직을 보호할 수 있을 것으로 사료된다.
- 이와 같이 에탄올 중독된 흰쥐 에게 갈화 및 갈근의 열수 추출물 급여시 뇌조직의 에탄올 대사효소계는 활성화되 었으며, 특히 갈근추출물이 갈화추물물보다 활성효과가 큰 것으로 나타났다.
후속연구
- 이상의 결과에서 갈화 및 갈근 열수추출물 급여는 뇌 조직 중의 에탄올 대사효소계의 활성을 촉진시 켰으며 , 유리기 제거 효소의 활성을 억제하고 항산화효소계를 활성화하여 에탄올 투여에 인한 뇌조직 의 산화적 스트레스를완화시킬 수 있을 것으로 사료된다.
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