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문제 정의
- HOC1 및 NO 등과 같은 활성 산소류가 병인이 되는 질병에 대하여 타우린이 방어 효과를 나타니고, 지질과산화昌 익제시키므로서 세포므}을 안정화시키는 효과가 있음이 다양한 종류의 실험동물을 대상으로 연구되었으나, 인체를 대상으로 한 연구는 현재까지 매우 드물다. 본 논문에서는 정상 성인여성을 대상으로 타우린보강이 혈중 함산화효소의 활성과 지질과산화물 농도에 미치는 영향을 살펴보고, 혈중 항산화체계와 타우린. 콜레스테롤 및 지방산 조성과의 상관관계를 규명하였디.
- 본 연구팀의 선행연구 결과 2주간의 타우린복용(6g/day)은 정상성인의 혈장 인지질에 함유된 지방산조성에 변화듪 초래하여, 총 SFA의 비율은 유의적으로 감소시킨 반면 총 PUFA비율은 유의적으로 증가시켰고, 타우린복용 4주 후에는 2주 후에 나타난 지방산조성의 변화가 역전되어 보강 전과 비슷한 수준을 나타냈다 物 본 연구에서는 혈장 지방산 조성이 체내 항산화체계에 미치는 영향을 평가하고자 혈중 항산화효소 활성과 혈장 총지실 및 인지질에 함유된 지방산 조싱과의 상관관계를 분석하였다. 그 결과, 혈잠 GSH-Px 활성은 혈장 인지질의 22 : 5跡비율과 유의적인 음의 상관관계를 보였으며(r = -0.
가설 설정
- AA로부터 eicosanoid가 생성되는 반응은 peroxidation.과정으로서 eicosanoid 대사산물이 증가할수록 peroxidation 과정이 촉진됨을 의미하고. 따라서 혈구세포의 eicosanoid 대사산물 수준과 GSH-Px 활성간에 음의 상판관계가 있다는 연구 결과가 제시된 바 있다.
제안 방법
- 제기되고 있다. 첫번째로 조직 손상시 생성이 증가된 HOCHe 체내에서 일차아민과 반움하여 클로라민을 형성하는데. 이때 주로 사용되는 것이 타우린이다.
- 본 논문에서는 정상 성인여성을 대상으로 타우린보강이 혈중 함산화효소의 활성과 지질과산화물 농도에 미치는 영향을 살펴보고, 혈중 항산화체계와 타우린. 콜레스테롤 및 지방산 조성과의 상관관계를 규명하였디..
- Orai이었다. 모든 피검자는 읾일 6g의 타우린을 제번으로 나누어 식사와 식사사이에 물과 함께 복용하도록 하였다. 처음 선정된 총 25명의 대상자 중 1명이 중도에 탈락하여 24명이 2주간의 타우린복용을 끝마쳤고, 二 중 실험을 계속할 의사가 있는 9명은 타우린복용을 2주간 더 연장함으로써 총 4주간의 타우린복묭 프로그램에 참여하였다.
- 모든 피검자는 읾일 6g의 타우린을 제번으로 나누어 식사와 식사사이에 물과 함께 복용하도록 하였다. 처음 선정된 총 25명의 대상자 중 1명이 중도에 탈락하여 24명이 2주간의 타우린복용을 끝마쳤고, 二 중 실험을 계속할 의사가 있는 9명은 타우린복용을 2주간 더 연장함으로써 총 4주간의 타우린복묭 프로그램에 참여하였다. 타우린은 정제 형태로 동아제약연구소에 의해 제공되었고, 실험기간 중 모든 피검자는 일상적인 식사를 하도록 유도하였다.
- 적혈구내 총 superoxide dismutase (SOD) 활성은 Ma-rklund 등어' 및 Sheri 등躅의 방법을 수정하여 SOD에 의한 pyrogallol으] autooxidation 억세정도를 측정하여 평가하였다. 적 혐구 준비 액 0 25ml에 증류수 0.
- 5ml을 취하고 absolute ethanol과 산]loroform 각각 1 0ml을 넣어 세게 흔든 후 2000 X g에서 10분간 원심분리하였다. 상층액 60μ1에 Tris buffer 3ml와 60μ1 pyrogallol율 가하여 잘 섞은 후 420nm에서 5분 동안 흡광도가 증가되는 정도를 측정하였다. SOD효소 1 unit는 pyrogaLlol의 autooxidation을 50% 방해하는데 필요한 효소의 양으로서 산출하였고, specific activity는 i분동안 Img 단백질에 해당하는 효소 unit로 환산하였다.
- 혈장의 glutathion per oxidase (GSH-Px) 활싱은 Paglia 등蚀 Deagen 등27}의 방법을 수정하여 과산화수소를 기질로 이용한 coupled enzyme 방법으로 측정하였다. 혈장 2C 風에 증류수를 가하여 100μ1로 체운 후, 0.
- coupled enzyme 방법으로 측정하였다. 혈장 2C 風에 증류수를 가하여 100μ1로 체운 후, 0.8ml 반응 혼합물(4.5 mM EDTA, 4.7mM sodium azide를 포함한 0.125M phosphate buffer, pH 7.0과 2.8nmoles NADPH, 49.9 nmoles reduced glutathione, 0.67units glutathione reductase)과 0.1ml의 0.25mM HQ를 가하여 반응을 일으킨 즉시 spectrophotometei'> 이용하여 341nm에서 산화형 glu也thione(GSSG)의 형성에 따른 NADPH의 흡광도가 감소되는 속도를 3분간 측정하였다. 즉, GSH-Px의 존재하에 HQs를 첨가시키면 산화형 glutathione(GSSG)이 생성되고, 반응액내에 존재하는 glutathione reductasee- NADPH에 의해 GSSG가 다시 GSH로 환원되는 속도를 관찰함으로써 GSH-Px의 활성이 산출되었다.
- 25mM HQ를 가하여 반응을 일으킨 즉시 spectrophotometei'> 이용하여 341nm에서 산화형 glu也thione(GSSG)의 형성에 따른 NADPH의 흡광도가 감소되는 속도를 3분간 측정하였다. 즉, GSH-Px의 존재하에 HQs를 첨가시키면 산화형 glutathione(GSSG)이 생성되고, 반응액내에 존재하는 glutathione reductasee- NADPH에 의해 GSSG가 다시 GSH로 환원되는 속도를 관찰함으로써 GSH-Px의 활성이 산출되었다. 효소 lunite 혈장 1ml당 1문동안 산화된 NADPH의 nmole 수로 나타내었고, specific activi匕y는 Img 단백질에 해당하는 효소 unit으로 환산하엱다.
- . 전처리된 시료의 타우린 농도는 ion-exchange chromatography32 에 입각한 아미노산 전용분석기 (Biochrom 20, Pharmacia LKB Biotech, Cambridge, England)를 사용하여 측정하였다. 즉, 여과된 시료 20问를 sample loading capsule을 통해 lithium high performance column (90 x 4.
- 전처리된 시료의 타우린 농도는 ion-exchange chromatography32 에 입각한 아미노산 전용분석기 (Biochrom 20, Pharmacia LKB Biotech, Cambridge, England)를 사용하여 측정하였다. 즉, 여과된 시료 20问를 sample loading capsule을 통해 lithium high performance column (90 x 4.6mm, Pharmacia LKB Biotech)에 주입하였으며, mobile phase로는 0.20M lithium citrate buffer, pH 2.80(34"0, 2분)과 0.30M lithium citrate buffer, pH 3.00(34笆, 12분)을 25ml/h의 유속에서 단계적으로 사용하였다. Column을 통해 분리된 아미노산을 ninhyd- rin시약으로 발색시킨 후 570nm에서 흡광도를 측정하였으며, 각 시료의 타우린함량은 아미노산 표준용액에서 얻어진 타우린 peak의 면적과 비교하므로써 계산하였다.
- 00(34笆, 12분)을 25ml/h의 유속에서 단계적으로 사용하였다. Column을 통해 분리된 아미노산을 ninhyd- rin시약으로 발색시킨 후 570nm에서 흡광도를 측정하였으며, 각 시료의 타우린함량은 아미노산 표준용액에서 얻어진 타우린 peak의 면적과 비교하므로써 계산하였다.
- 083N 2ml 고} phosphotungstic acid 0 3ml에 현탁시켜 다시 3000 x g에서 10분간 원심분리히였다. 침전물에 증류수 5ml과 thio- baibituric acid(TBA)용액 2ml을 가한 후 90~95笆에서 20 룬간 항온 배양시켰다 이를 냉각시킨 후 n-butanol을 가하여 3000 X g에서 1。분간 원심분리하고, 상층액을 취하여 luminescence spectrophotometer(Aminco Bowman Series 2, #FA255, AMINCO, USA)를 이용하여 excitation 파장, 50Qnm과 emission 파장, 553nm에서 형광강도를 측정하였다. 이때 표준물질로는 1, 1, 3, 3-teti-amethoxypi'- opane(Sigma Co.
대상 데이터
- 연세대학교에 재학중인 학무생과 대학원생 중 질병이 없고 건강한 여학생으로 연구에 협조할 의사가 있는 25명을 연구대상자로 선정하였다. 연구대상자의 평균 니-이는 23.
- 타우린보강을 실시하기 직전, ■电강 후 2주 및 4주가 되는 날 아침 공복시 혈액을 채취하였으며, 채취한 혈액은 2, 000 X g에서 10분 간 원심분리시켜 혈장을 분리한 후 모든 생화학적 분석이 이루어질 때까지 -70纪에서 냉동 보관하였다. 혈장을 분리하고 남은 혈구세포는 0.
데이터처리
- 모든 분석수치는 mean ± SEM으로 韮시하였으며 , 타우린 복용을 실시하기 직전과 2주 또는 4주 후의 혈중 항산화 효소 활성 및 MDA농도 값의 차이는 paired Atest에 의해 p <0.05, p<0.01 生는 p <0.001 수준에서 유의성 이부를 검증하였다、또한 혈중 항산화효소 활성 및 MDA 농도와 혈장 타우린 또는 콜리]스테롤농도긴-의 상관관계, 그리고 혈중 지방산조성과 항산화효소활성 또는 MDA농도와의 상관관계는 Pearson correlation test에 의해 p < 0, 05, p < 0.01 또는 p < 0.001 수준에서 유의성 여무를 검증하였다
이론/모형
- 혈장 및 적혐구의 단백실함량은 Lcwry 등의 방법劉에 의해 정 량하였으며 , 단백질 표준물질로는 bovine serum albumin을 사용하였다.
- 혈장의 malondialdehyde(MDA)농도는 Buckingham匆의 방법을 이용하여 측정하였다. 혈장 50μ1에 0.
- : 1. 니、N으로 지 짚을 추출하였으며 , 인지질 성분을 분리하기 위하여 thin layei chi'omatography(TLC)< 이용하였다 혈장의 총지칠과 인지질분획에 포함된 지방산 조성을 분석하기 위해서 Lepage 등"의 방법에 준하여 지방산을 methylation시긴 후 일정량을 fused-sillica bonded capillary column(Omega wax 320, Supelco, USA; 30cm x 0.32mm)과 flame ionization detector가 부착된 gasliquid chi'omatogi'aphy(GLC, Hewlett Packard 5890A, USA) 기기에 주입시켰으며, internal standard로는 heptadecaenoic acid(HA, 17 : 0, Nu Check Prep. Inc , USA) 를 사용하였다. GLC의 oven 온도는 200℃로, injection port 및 detection port의 온도는 260P로 각각 조징하였으뗘, carrier gas로 사용된 헬륨의 유속은 Iml/minS, 二丄 리고 split rati。는 10 : 1로 조절하였다.
- 혈장의 콜레스테롤농도는 효소비색법33'을 이용한 상업용 kit(Eiken Chemical Co., Japan)를 사용하여 측정하였다.
성능/효과
- 적혈구의 총SOD활성은 타우린보강 전보다 보강 2주 후에 감소되는 경향을 보였으며, 보강 4주 후에도 계속적인감소 양상을 나타냈으나 통계적으로 유의한 차이는 아니었다. 혈장의 GSH-Px활성은 타우린보강 2주 후 보강 전보다도 유의적으로 감소하였으나(p<0.
- 지질과산화 지표로 사용되는 혈장 MDA농도는 적혈구 내 총 SOD활성과 마찬가지로 티우린보강 2주 후 보강 전보다도 감소하는 경향을 모였으나, 통계직으로 유의한 수준은 아니었다(Table 1). 일반적으로 다가불포화지방산의 섭취가 많은 상태에서 또는 만성질환시 항산화영양소를 보충 섭취하는 경우 지질과산화지표인 MDA수준이 혈액 및 조직에서 감소하는 것으로 알려져 있디、본 연구결과에서 타우린의 지질과산화 저해효과가 유의적으로 나타나지 않은 것은 본 연구가 건강한 성인을 대상으로 함에 따라 체내의 항산화 체계가 타우린보강을 실시하기 전에 이미 양호한 수준이었기 때문인 것으로 사려된다.
- 타우린보강 전, 보강 2주 및 4주 후의 결과들을 합하여 혈중 항산화체계와 혈장 타무린농도 또는 콜리스테돌 놈도와의 상관관계를 분석한 결고k 적혈구의 SOD활성 및 혈장 GSH-Px활성 모두 혈장의 타우린 또는 콜레스테롤 농도와 유의적인 상관관계를 나타내지 못하였다(Table 2). 한편, 지짙과산화믈의 농도를 나타내는 혈장 MDA농도는 혈장 타우린 농도외는 유의적인 음의 상관관계를 나타냈으며 (r= T).
- 상관관계를 나타내지 못하였다(Table 2). 한편, 지짙과산화믈의 농도를 나타내는 혈장 MDA농도는 혈장 타우린 농도외는 유의적인 음의 상관관계를 나타냈으며 (r= T). 2004, p<0 05), 반대로 혈장 콜레스테롤농도와는 양의 상관관계를 나타냈으나 이 경우 통계적으로 유의한 수준은 아니었다(r = 0.
- 한편, 본 연구결과에서 혈중 타우린농도와 MDA 농도 간에 유의적인 음의 상관관계가 나타난 것에 대한 해석을 내리는데 있어서 티우린의 항산화효과와는 무관하게 타우린이 혈장지 질농도를 감소시 키 므로서 간접 적 으로 지 질과산화물농도를 저하시켰을 기능성 또한 배제할 수 없는 것으로 사료된다.
- 대조군에 비해 간 조직의 지질과산화물 수준이 증가하였고. GSH-Px 및 GSH transferase 활성이 유의하게 감소함을 관찰하였다. 이와 같은 결과들은 고콜리스테롤혈증 상황에서 체내 항산화 기능이 저해될 수 있음을 제시하며, 역으로 당뇨병과 같은 만성잘한의 경우 합병증으로 고지혈증이 동반되고 조직의 MDA농도가 증가하게 된다.
- 상관관계를 분석하였다. 그 결과, 혈잠 GSH-Px 활성은 혈장 인지질의 22 : 5跡비율과 유의적인 음의 상관관계를 보였으며(r = -0.2623, p <0.05), 혈장 총 지질에 함유된 22 - 0(r = 0.2892. p<0.05) 및 20 : 4o6 (arachidonic acid, AA, r = 0.2939, 0.05) 조성과는유의적인 양의 상관관계를 나타냈다. 한편 적혈구의 SOD 활성은 혈장 인지질의 지방산조성과 유의적인 상관관계를 나타내지 않았다.
- 체내 함산화체계와 혈장 지방산 대사지표와의 상관관계를 평가한 결과 혈장 GSH-Px활성은 통계적으로 유의적인 수준은 아니었으나 혈장내 但3 계 및(06계 지방산의 elongation 및 desaturation 지표와 양의 상관관계를 보인 반면, 적혈구의 SOD활싱은 다가불포화지방산의 elongation 및 desaturation지표와 일반적으是 음의 상관관계 경향을 나타냈다(Table 3).
후속연구
- 한편 본 연구에서 arachidonic acid(AA)가 PUFA이면서도 GSH-Px 활성과 양의 상관관계를 나타낸 점은 AA가 체내에서 lipoxygenase및 cyclooxygenase의 촉매작용에 의해 다양한 생리활성을 지닌 風c曲anoid들을 합성하는데 이용되는 것과 관련이 있을 것으로 추측된다. AA로부터 eicosanoid가 생성되는 반응은 peroxidation.
- 서로 다르게 보고되고 있다. 예를들어 체내 PUFA 섭취가 증가한 경우, 조직의 과산화물 생성이 증가하고 증가된 과산화물로부터 세포를 보호하기 위해 항산화효소의 활성이 증가하였음이 보고된 한편, 如" 비타민 E와 같은 항산화 영양소가 보충되는 경우 항산화효소의 활성이 증가하여 체내 지질과산화물 수준이 감소했다는 보고도 있다, '⑼ 이처럼 아직까지 일련의 환경적인 변화에 대한조직내 항산화물질, 지질과산화물, 그리고 항산화체계의 상호관계에 대한 연구 결과가 일판되게 정립되어 있지 못하므로 앞으로 이 분야에 대한 체계적인 연구가 요청되며, 아울러 산화 스트레스에 의한 다양한 질병상황에서 타우린의 항산화활성 유무가 인체를 대상으로 규명되어져야 할 것으로 생각된다.
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