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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 뇌허혈을 유발한 Mongolian gerbil의 해마체 내 CAl 영역에서의 MAP2 면역조직화학 염색 양상을 지표로 하여 사향이 함유된 우황청심원 대신 천연물로서는 가장 유사생약으로 분류하고 있는 영묘향으로 대체시킨 우횡-청심원, 즉 각각 2종씩의 영묘향 함유 우황 청심 원액 및 사향 함유우황청심원액의 뇌졸중에 대한 효과를 비교·검사하였다.
- 본 연구는 뇌허혈 유발에 따른 뇌조직 손상에 있어서 기존의 처방인 사향 함유 우횡-청심원액과 사향을 영묘향으로 대체한 영묘향 함유 우황청심원액의 뇌조직 보호 효과를 비교 검사한 것이다. 뇌의 전두엽 부분은 뇌허혈 손상에 상당히 민감하여, Mongolian Gerbil의 뇌조직 중 stiiatum, cerebral cortex, hippocampus의 CAI region 등이 여기에 속한다고 보고되어 있으며 (Urban 등, 1989, Araki 등, 1990, Kato 등, 1989), 생화학적으로 허혈에 의한 뇌 조직손상에 따라 산소와 glucose의 공급량이 줄어들고 결과적으로 adenosine tiiphosphate (ATP) 형성을 감소시킨다고 보고된 바 있다.
- 본 연구에서는 대뇌 허혈시 나타나는 신경세포의 손상에 대한 영묘향 함유 처방액, 사향 함유처방액의 영향을 평가하기 위하여 뇌허혈을 유발시킨 mongolian gerbil을 이용하여, 해마체 중 CAl 영역 내 신경세포에 분포하는 MAP2에 대한 면역조직회학법을 수행함으로써 뇌허혈에 따른 신경세포의 구조적 손상을 관찰하고, 뇌허혈에 의해 손상된 조직의 면정에 대해 생존세포가 차지히는 면적의 비율을 비교하였다. 그 결과, 뇌허혈 유발에 띠른 조직 손상에 대한 생존 세포의 비율은 저농도 사향 함유 우황 청심 원액 투여군의 경우 17.
제안 방법
- Mongolian gerbil을 사용하여 경동맥 결찰법으로 대뇌허혈을 유발시켰다. 3% isoflunme을 이용하여 실험동물을 도입 마취시킨 후 농도를 1% 또는 2%로 낮추어 수술 전과정에서 마취를 유지시켰다. 목 부위의 피부를 절개하고 근육을 둔성분리한 후, 경동맥을 미주신경과 주위조직으로부터 분리하고 microaneurysm clip을 사용하여 양측 경동맥을 10분간 폐쇄하였다.
- Image analyser (Metamorph, universal imaging Co.)를 이용하여 면역염색을 한 10장의 조직에서 해마부위를 50배의 배율로 허혈로 손상을 입은 면적을 측정하였다. Sham control과 비교하여 염색성이 현저히 떨어지는 부위를 허혈로 인한 손상을 빋은 영역 (ischemic area)으로 간주하여 그 면적과 이 부위중 MAP2염색성을 나타내는 부위(area of stained fiberg] 총면적을 함께 측정하여 그 비율을 계산하였다.
- Scheme에서 보는 바와 같이 실험동물에 시험약물을 하루에 두 번씩 12시간 간격으로 경구투여하였으며, 투여량은 Table I에서 나타낸 것과 같이 사람에 대한 처방량을 기준으로 하여 저농도 사향함유 우황청심원액 (LM- WHCSW)은 6.37 mg/kg체중, 고농도 사향함유 우황청심원액 (HM-WHCSW)은 67.96 mg/kg체중, 저농도 영묘향 함유 우황청심원액 (LC-WHCSW)은 6.54 mg/kg체중, 고농도 영묘향함유 우황청심원액 (HC-WHCSW>은 82.23 mg/kg체중으로 설정하였다. 정상대조군 및 sham 대조군의 약물 대신에 동량의 생리식 염수를 투여하였으며 , 오전 투여를 하기 전에 대조군 및 투여군의 체중을 측정하였다.
- )를 이용하여 면역염색을 한 10장의 조직에서 해마부위를 50배의 배율로 허혈로 손상을 입은 면적을 측정하였다. Sham control과 비교하여 염색성이 현저히 떨어지는 부위를 허혈로 인한 손상을 빋은 영역 (ischemic area)으로 간주하여 그 면적과 이 부위중 MAP2염색성을 나타내는 부위(area of stained fiberg] 총면적을 함께 측정하여 그 비율을 계산하였다. Sham 대조군에서 관찰되는 신경섬유의 평균염색밀도(mean density of stained Bber)는 허혈을 유도한 투여군에서 관찰되는 평균영역을 측정한 후, 그 평균영역 내에서 염색성을 나타내는 신경섬유들의 면적의 비율을 계산하였다.
- Sham control과 비교하여 염색성이 현저히 떨어지는 부위를 허혈로 인한 손상을 빋은 영역 (ischemic area)으로 간주하여 그 면적과 이 부위중 MAP2염색성을 나타내는 부위(area of stained fiberg] 총면적을 함께 측정하여 그 비율을 계산하였다. Sham 대조군에서 관찰되는 신경섬유의 평균염색밀도(mean density of stained Bber)는 허혈을 유도한 투여군에서 관찰되는 평균영역을 측정한 후, 그 평균영역 내에서 염색성을 나타내는 신경섬유들의 면적의 비율을 계산하였다. Sham 대조군의 평균 염색밀도와 비교하여 허혈 유도 투여군에서 관찰되는 허혈로 인한 손상을 받은 영역에 대한 MAP2염색이 인정되는 영역의 비율을 sham control의 평균 염색밀도에 대한 백분율로 계산하여, 대조군과 투여군 간의 상대적인 치에 데해 t-Test로 유의성을 검증하였다.
- 고정이 끝난 조직은 동일한 고정액에서 4시간동안 처리하여 후고정하고, 4℃에서 20%, 30% sucrose를 포함한 TPBS용액에 차례로 침전시켜 동결 시 조직이 손상되지 않도록 처리했다. Sucrose처리가 끝난 조직은 조직동결처리기를 사용하여 -65℃이하의 dry ice로 신속히 얼리고 cryostat microtome로 두께 40㎛의 절편을 10징씩 제작하였다.
- 대뇌 허혈유발 전 과정에 걸쳐 rectal probe를 사용하여 체온을 측정하고, rectal probe에 연결되어 있는 heating pad를 이용하여 체온을 37℃이상 유지시켰다. sham 대조군은 동일한 방법으로 마취 후 경동맥 결찰에 의한 뇌허혈을 유발시켰으며, 정상대조군에는 마취 및 경동맥 분리를 수행하였으나 경동맥 폐쇄는 하지 않았다. 수술후 마취가 깨어나면 격리시켜 먹이와 물을 자유로이 섭취할 수 있도록 히였다.
- 005% H2O2 과 20분동안 실온에서 반응시킨 후 avidin-biotin complex (1:250)를 이용하여 실온에서 1시간동안 반응을 유도하였다. 각 단계가 끝난 조직은 TPBS를 시용하여 5분간 6번씩 잔류 항체을 제거한 후 다음 단계로 진행하였으며, ABC와 반응이 끝난 조직은 DAB반응고로 실온에서 발색시켰다. 발색이 끝난 조직은 slide glass위에서 완전히 건조시킨 다음, alcohol의 농도를 높이면서 탈수시킨 후 xylene을 거치고 cover glass를 씌워 봉입하였다.
- 목 부위의 피부를 절개하고 근육을 둔성분리한 후, 경동맥을 미주신경과 주위조직으로부터 분리하고 microaneurysm clip을 사용하여 양측 경동맥을 10분간 폐쇄하였다. 경동맥 폐쇄로 인한 뇌로의 혈액공급 차단효과를 확인하기 위해, 경동맥 폐쇄후 opthal-moscope를 사용하여 middle cerebral artery의한 분지인 opthahnic artery의 굵기가 감소하는지 확인하였다. 대뇌 허혈유발 전 과정에 걸쳐 rectal probe를 사용하여 체온을 측정하고, rectal probe에 연결되어 있는 heating pad를 이용하여 체온을 37℃이상 유지시켰다.
- 4M phosphate buffer(Lana's fixative)를 관류시켜 뇌를 고정하였다. 고정이 끝난 조직은 동일한 고정액에서 4시간동안 처리하여 후고정하고, 4℃에서 20%, 30% sucrose를 포함한 TPBS용액에 차례로 침전시켜 동결 시 조직이 손상되지 않도록 처리했다. Sucrose처리가 끝난 조직은 조직동결처리기를 사용하여 -65℃이하의 dry ice로 신속히 얼리고 cryostat microtome로 두께 40㎛의 절편을 10징씩 제작하였다.
- 3, arrowheads). 뇌허혈로 인한 MAP2의 염색성의 변회는 주로 해마의 CAl 부위에서 현저히 나타났으며, 따라서, 뇌허혈 유발에 따라 손상된 뇌초직 중 생존한 신경섬유의 면적 비율은 해마체의 CAl 지역을 대상으로 측정하였다.
- 경동맥 폐쇄로 인한 뇌로의 혈액공급 차단효과를 확인하기 위해, 경동맥 폐쇄후 opthal-moscope를 사용하여 middle cerebral artery의한 분지인 opthahnic artery의 굵기가 감소하는지 확인하였다. 대뇌 허혈유발 전 과정에 걸쳐 rectal probe를 사용하여 체온을 측정하고, rectal probe에 연결되어 있는 heating pad를 이용하여 체온을 37℃이상 유지시켰다. sham 대조군은 동일한 방법으로 마취 후 경동맥 결찰에 의한 뇌허혈을 유발시켰으며, 정상대조군에는 마취 및 경동맥 분리를 수행하였으나 경동맥 폐쇄는 하지 않았다.
- 3% isoflunme을 이용하여 실험동물을 도입 마취시킨 후 농도를 1% 또는 2%로 낮추어 수술 전과정에서 마취를 유지시켰다. 목 부위의 피부를 절개하고 근육을 둔성분리한 후, 경동맥을 미주신경과 주위조직으로부터 분리하고 microaneurysm clip을 사용하여 양측 경동맥을 10분간 폐쇄하였다. 경동맥 폐쇄로 인한 뇌로의 혈액공급 차단효과를 확인하기 위해, 경동맥 폐쇄후 opthal-moscope를 사용하여 middle cerebral artery의한 분지인 opthahnic artery의 굵기가 감소하는지 확인하였다.
- 투여를 시작하고 7일째 되는 날 오전투여를 마친 후 4시간 후세 뇌 허혈을 유도하기 위한 수술을 실시하였고, 수술이 끝난 동물은 약 12시간이 경과한 후 약물의 투여를 재개하였다. 수술 후 5일이 경과한 후 오전투여를 마치고 약 3~4시간 후에 희생시켜 심장을 통해 고정액을 주입하여 뇌를 고정하였다(Scheme 1).
- mouse에서 생산된 MAP2(microtubule associated protein2) 항혈청 (Sigma, 1:80000)을 이용하여 4℃에서 12시긴동안 반응시켰다. 일차항체와 빈응이 끝난 조직은 이차항체인 rabbit anti-mouse IgG(vector, 1:200)로 실온에서 1시간 처리하고, 이어서 avidin-biotin complex(Elite kit, Vector, 1:250)4 실온에서 30분간 반응시켰다. 처리가 끝난 조직은 다시 Biotinylated tyramine 1 μl/ml PBS+0.
- 23 mg/kg체중으로 설정하였다. 정상대조군 및 sham 대조군의 약물 대신에 동량의 생리식 염수를 투여하였으며 , 오전 투여를 하기 전에 대조군 및 투여군의 체중을 측정하였다. 투여를 시작하고 7일째 되는 날 오전투여를 마친 후 4시간 후세 뇌 허혈을 유도하기 위한 수술을 실시하였고, 수술이 끝난 동물은 약 12시간이 경과한 후 약물의 투여를 재개하였다.
- 준비된 조직은 endogenous peroxidase의 활성도를 떨어뜨리기 위하여 3%의 H2O2가 들어있는 TPBS에서 30분간 반응시킨 후 1%의 normal rabbit serum과 0.3%의 Triton-X가 들어있는 TPBS에서 1시간동안 처리하였다. mouse에서 생산된 MAP2(microtubule associated protein2) 항혈청 (Sigma, 1:80000)을 이용하여 4℃에서 12시긴동안 반응시켰다.
- 정상대조군 및 sham 대조군의 약물 대신에 동량의 생리식 염수를 투여하였으며 , 오전 투여를 하기 전에 대조군 및 투여군의 체중을 측정하였다. 투여를 시작하고 7일째 되는 날 오전투여를 마친 후 4시간 후세 뇌 허혈을 유도하기 위한 수술을 실시하였고, 수술이 끝난 동물은 약 12시간이 경과한 후 약물의 투여를 재개하였다. 수술 후 5일이 경과한 후 오전투여를 마치고 약 3~4시간 후에 희생시켜 심장을 통해 고정액을 주입하여 뇌를 고정하였다(Scheme 1).
- 허혈 유발후 5일이 경과한 실험동물을 Isoflurane(5%)으로 심미취시킨 후 흉강을 열고 대동맥을 통해 고정엑을 관류시켜 뇌를 고정하였다. 고정액을 주입하기 전 calcium free tyrode용익 50 ml을 주입하여 조직도로부터 혈액을 완전히 제거한 후 4% paraformaldehyde 및 0.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 시험물질은 광동제약 주식회사에서 공급받은 영묘향 함유 처방현턱액과 사향 함유 처방액으로서 조성은 표 1과 같다. 제공받은 시험약물은 현탁액 상태로서 본 실험에서는 경구투여시 현탁액을 그데로 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 실험동물은 Mongolian Gerbil 체중 140~180 g)이며 각각의 실험동물들은 약 1주일간 순회저응시킨후 건강한 동물을 선택하여 온도 23 ± 3℃, 상대습도 50 ± 10%, 배기 10-12회, 형광등 명암 12hi- cycle, 조도 150-160 Lux의 환경에서 사육하였다.
- 표 1과 같다. 제공받은 시험약물은 현탁액 상태로서 본 실험에서는 경구투여시 현탁액을 그데로 사용하였다.
데이터처리
- Sham 대조군에서 관찰되는 신경섬유의 평균염색밀도(mean density of stained Bber)는 허혈을 유도한 투여군에서 관찰되는 평균영역을 측정한 후, 그 평균영역 내에서 염색성을 나타내는 신경섬유들의 면적의 비율을 계산하였다. Sham 대조군의 평균 염색밀도와 비교하여 허혈 유도 투여군에서 관찰되는 허혈로 인한 손상을 받은 영역에 대한 MAP2염색이 인정되는 영역의 비율을 sham control의 평균 염색밀도에 대한 백분율로 계산하여, 대조군과 투여군 간의 상대적인 치에 데해 t-Test로 유의성을 검증하였다.
- 투여 기간중에 나타니는 실험동물의 체중변화를 알아보기 위해서, 7일째의 수술하기 전 체중과 12일째의 체중을 투여 시작일의 체중에 대한 백분율로 계산하여 대조군과 부여군 간의 차이를 t-TestX 분석하였다.
이론/모형
- Mongolian gerbil을 사용하여 경동맥 결찰법으로 대뇌허혈을 유발시켰다. 3% isoflunme을 이용하여 실험동물을 도입 마취시킨 후 농도를 1% 또는 2%로 낮추어 수술 전과정에서 마취를 유지시켰다.
성능/효과
- 5% 로 나타났다. Sham 대조군에서 나타나는 생존 신경 섬유가 차지하는 면적과 통계칙적인 비교 결과, 저농도 사향 함유 우횡청심원액을 제외한 시험약물 투여군, 즉 고농도 사향함유 우황청심원액 투여군 (P<0.01), 저농도 및 고농도 영묘향 함유 우황청심원액 투여군 (P<0.05) 모두 유의한 신경세포 생존율을 보였다.
- 비교하였다. 그 결과, 뇌허혈 유발에 띠른 조직 손상에 대한 생존 세포의 비율은 저농도 사향 함유 우황 청심 원액 투여군의 경우 17.3%, 고농도 사향 함유 우황 청심 원액 투여군은 37.8%, 저농도 영묘향 함유 우황청심원액 투여군은 27.8%, 고농도 영묘향 함유 우황청심원액 투여군은 35.5% 등으로 나타났으며, Sham 대조군과 t-Test 방법을 이용한 통계학적 비교 결과, 저농도 사향 함유 우황 청심 원액을 제외한 시험약물 부여군, 즉 고농도 사향 함유 우황 청심 원액 투여군 (P<0.01), 저농도 및 고농도 영묘향 함유 우황 청심 원액 부여군 (P<0.05) 모두 유의한 신경섬유 생존율을 보였다. 따라서, 이들 약물은 뇌허혈 유발에 따른 mongolian gerbil의 뇌조직 손상에 대하여 신경세포를 예방 또는 보호하는 효괴를 가진다고 할 수 있다.
- 또한, 시험 약물 투여 시작일, 시험약물 투여 7일째인 뇌허혈 유발 수술 직전 및 시험약물 투여 12일째인 실험기간 종료 후에 측정한 체중의 변화를 비교한 결과, 고농도 사향 함유 우황청심원액와 저농도 및 고농도 영묘향 함유 우황청심원액 투여군은 허혈 유발로 인해 일어나는 체중의 감소를 효과적으로 억제하는 것으로 나타났으며, 저농도 사향 함유 우황 청심 원액 투여군에서는 허혈로 인한 체중감소를 억제하지 못한 것으로 관찰되었다. 따라서, 저농도 사향 함유 우황 청심 원액을 제외한 모든 시험약물, 즉 고농도 사향 함유 우황 청심 원액과 저농도 및 고농도 영묘향 함유 우황청심원액은 mongolian gerbil에 데한 뇌허혈 손상을 보호 또는 예방하는 효과를 가진 것으로 나타났다.
- 따라서, 이들 약물은 뇌허혈 유발에 따른 mongolian gerbil의 뇌조직 손상에 대하여 신경세포를 예방 또는 보호하는 효괴를 가진다고 할 수 있다. 또한, 시험 약물 투여 시작일, 시험약물 투여 7일째인 뇌허혈 유발 수술 직전 및 시험약물 투여 12일째인 실험기간 종료 후에 측정한 체중의 변화를 비교한 결과, 고농도 사향 함유 우황청심원액와 저농도 및 고농도 영묘향 함유 우황청심원액 투여군은 허혈 유발로 인해 일어나는 체중의 감소를 효과적으로 억제하는 것으로 나타났으며, 저농도 사향 함유 우황 청심 원액 투여군에서는 허혈로 인한 체중감소를 억제하지 못한 것으로 관찰되었다. 따라서, 저농도 사향 함유 우황 청심 원액을 제외한 모든 시험약물, 즉 고농도 사향 함유 우황 청심 원액과 저농도 및 고농도 영묘향 함유 우황청심원액은 mongolian gerbil에 데한 뇌허혈 손상을 보호 또는 예방하는 효과를 가진 것으로 나타났다.
- 비율을 나타낸 것이다. 면역염색의 양상은 Fig. 3에서 보는 바와 같으며, MAP2면역염색성은 섬유모양로 관찰되었다 (Fig. 3, arrowheads). 뇌허혈로 인한 MAP2의 염색성의 변회는 주로 해마의 CAl 부위에서 현저히 나타났으며, 따라서, 뇌허혈 유발에 따라 손상된 뇌초직 중 생존한 신경섬유의 면적 비율은 해마체의 CAl 지역을 대상으로 측정하였다.
- 4). 시험약물의 투여는 뇌허혈 유발을 위한 경동맥 결찰 수술 7일 전부터 수술 후 5일까지 12일 동안 매 12시간마다 1회씩 경구투여로 수행되었으며, 그 결과, 뇌허혈 유발에 따라 손상된 해마체 CAl 영역 내에서 생존한 신경섬유가 차지하는 비율은 각각 저농도 사향 함유 우황청심 원액 투여군의 경우 17.3%, 고농도 사향 함유 우황청심원액 투여군은 37.8%, 저농도 영묘향 함유 우황청심원액 투여군은 27.8%, 고농도 영묘향 함유 우황청심원액 투여군은 35.5% 로 나타났다. Sham 대조군에서 나타나는 생존 신경 섬유가 차지하는 면적과 통계칙적인 비교 결과, 저농도 사향 함유 우횡청심원액을 제외한 시험약물 투여군, 즉 고농도 사향함유 우황청심원액 투여군 (P<0.
- 2). 이러한 체중감소로 볼 때 고농도 사향 함유 우황청심원액, 저농도 및 고농도 영묘향 함유 우황청심원액 투여군은 허혈 유발로 인해 일어니는 체중의 감소를 효과적으로 억제하는 것으로 나타났으며 , 사향 함유 우황청심원액 투여군에서는 허혈로 인한 체중감소를 억제하지 못한 것으로 관찰되었다.
- 정상대조군의 경우, 측정된 CAl 지역의 면적에 대해 생존한 신경섬유가 차지하는 면적의 비율은 86.3% 인데 반하여, 경동맥 결찰이 수행되었던 Sham 대조군의 경우, 생존 신경섬유가 차지하는 면적의 비율이 14.4%로서 뇌 허혈 유발 수술에 따라 해미체의 CAl 지역 내에 분포하는 대부분의 신경섬유가 소실되는 것으로 나타났다 (Table Ⅱ, Fig. 4). 시험약물의 투여는 뇌허혈 유발을 위한 경동맥 결찰 수술 7일 전부터 수술 후 5일까지 12일 동안 매 12시간마다 1회씩 경구투여로 수행되었으며, 그 결과, 뇌허혈 유발에 따라 손상된 해마체 CAl 영역 내에서 생존한 신경섬유가 차지하는 비율은 각각 저농도 사향 함유 우황청심 원액 투여군의 경우 17.
- 투여시작 후 7일(허혈 유발일) 째에 나타니는 체중 변화는 각 실험군간에 있어 유의성있는 차이를 나타내지 않았으나, 12일 (허혈유발후 5일) 후에 관찰한 실험동물의 체중은 sham 대조군과 저농도 사향 함유 우황청심원액 (LM- WHCSW, 6.54 mg/kg) 투여군의 경우, 초기체중에 대해 각각 18.4%, 17.6%의 체중감소율을 보였다 (P<0.05). 그러나 고농도 사향 함유 우황청심원액 (HM-WHCSW, 82.
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