생체발광균주 Photobacterium phosphoreum의 배양배지 및 최적 저장조건에 관한 연구 Studies on the Culture Media and the Optimal Storage Conditions of Bioluminescent Bacteria Photobacterium phosphoreum원문보기
본 연구에서는 Photobacterium phosphoreum의 배양 및 생체발광을 위한 최적 배지의 개발과 장기저장 후 생체발광능의 회복을 위한 최적의 저장 조건을 확립하고자 하였다. P. phosphoreum을 배양하기 위한 배지로 Luria broth(LB) 배지를 변형한 modified LB(mLB) 배지를 개발하였다. mLB 배지는 Luria broth에 1.5%의 NaCl과 3%의 글리세롤을 보정, 첨가한 배지로, 미생물 생장 및 생체 발광량이 Nutrient broth 배지보다 약 25% 가량 높은 수치를 보여주었으며, 생장 대수기에서 생장 휴지기로 넘어갈 때 생체 발광량이 최고치에 달하였다. 30% 글리세롤을 첨가하여 $-20^{\circ}C$$-70^{\circ}C$ 및 액체질소에 3개월간 보관한 후, 배양하여 생장 및 생체 발광량을 조사한 결과에서는 $-20^{\circ}C$ 보관한 시료가 가장 좋은 결과를 보였다. 항 동결제로 5% adonitol을 첨가하여 동결 건조한 시료는 재 배양 시 adonitol를 첨가하지 않은 시료보다 16시간 이상 짧은 생장 유도기를 보여 주었고, 생체 발광량이 최고조에 달하는 시간도 빠르게 나타났다.
본 연구에서는 Photobacterium phosphoreum의 배양 및 생체발광을 위한 최적 배지의 개발과 장기저장 후 생체발광능의 회복을 위한 최적의 저장 조건을 확립하고자 하였다. P. phosphoreum을 배양하기 위한 배지로 Luria broth(LB) 배지를 변형한 modified LB(mLB) 배지를 개발하였다. mLB 배지는 Luria broth에 1.5%의 NaCl과 3%의 글리세롤을 보정, 첨가한 배지로, 미생물 생장 및 생체 발광량이 Nutrient broth 배지보다 약 25% 가량 높은 수치를 보여주었으며, 생장 대수기에서 생장 휴지기로 넘어갈 때 생체 발광량이 최고치에 달하였다. 30% 글리세롤을 첨가하여 $-20^{\circ}C$$-70^{\circ}C$ 및 액체질소에 3개월간 보관한 후, 배양하여 생장 및 생체 발광량을 조사한 결과에서는 $-20^{\circ}C$ 보관한 시료가 가장 좋은 결과를 보였다. 항 동결제로 5% adonitol을 첨가하여 동결 건조한 시료는 재 배양 시 adonitol를 첨가하지 않은 시료보다 16시간 이상 짧은 생장 유도기를 보여 주었고, 생체 발광량이 최고조에 달하는 시간도 빠르게 나타났다.
Vibrio, Photobacterium, Alteromonas and Xenorhabdus species are capable of emitting light, called bioluminescence. They exist in marine, freshwater and terrestrial environments. Bacterial bioluminescent reaction is that reduced riboflavin phosphates and a long-chain aldehyde are oxidized in the pres...
Vibrio, Photobacterium, Alteromonas and Xenorhabdus species are capable of emitting light, called bioluminescence. They exist in marine, freshwater and terrestrial environments. Bacterial bioluminescent reaction is that reduced riboflavin phosphates and a long-chain aldehyde are oxidized in the presence of molecular oxygen and enzyme luciferase. This experiment aims to develop the proper culture media and to optimize the storage condition for the recovery of bioluminescent activity in Photobacterium phosphoreum. The Luria broth (LB) medium was modified for cultivation of Photobacterium phophoreum, called as modified LB(mLB) medium. The mLB medium is LB fortified with 3% glycerol and 1.5% NaCl. In mLB medium. bacterial growth and bioluminescent activity are 25% higher than those in a Nutrient broth medium. When the cell stocks were stored at $-20^{\circ}C$, $-70^{\circ}C$ and LN2 for 3 months, cell growth and bioluminescent activity of culture after stored at $-20^{\circ}C$ were better than those of other treatments. The highest bioluminescent activity obtained at the late exponential phase in all treatments. When the cell stock was freeze-dried with 5% adonitol as a cryoprotectant, the recovery of cell was better than those of control and freeze-dried cell stock without addition of cryoprotectant.
Vibrio, Photobacterium, Alteromonas and Xenorhabdus species are capable of emitting light, called bioluminescence. They exist in marine, freshwater and terrestrial environments. Bacterial bioluminescent reaction is that reduced riboflavin phosphates and a long-chain aldehyde are oxidized in the presence of molecular oxygen and enzyme luciferase. This experiment aims to develop the proper culture media and to optimize the storage condition for the recovery of bioluminescent activity in Photobacterium phosphoreum. The Luria broth (LB) medium was modified for cultivation of Photobacterium phophoreum, called as modified LB(mLB) medium. The mLB medium is LB fortified with 3% glycerol and 1.5% NaCl. In mLB medium. bacterial growth and bioluminescent activity are 25% higher than those in a Nutrient broth medium. When the cell stocks were stored at $-20^{\circ}C$, $-70^{\circ}C$ and LN2 for 3 months, cell growth and bioluminescent activity of culture after stored at $-20^{\circ}C$ were better than those of other treatments. The highest bioluminescent activity obtained at the late exponential phase in all treatments. When the cell stock was freeze-dried with 5% adonitol as a cryoprotectant, the recovery of cell was better than those of control and freeze-dried cell stock without addition of cryoprotectant.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
최근에는 수질 검사나 의료진단 분야에서 생체발광 시스템의 활용 연구가 활발하게 진행되고 있으며(10), 식품분야에서도 식품의 질과 저장성을 분석하는데 활용하고 있다(11, 12). 따라서 본 연구에서는 생체발광미생물 중의 하나인 P- phosphoreumi: 이용한 환경오염 측정 biosensor의 개발이 산업화될 시, 균주의 수급에 영향을 미치는 균주의 배양배지 및 장기저장의 최적 조건을 확립하고자 하였다.
장기저장을 위한 최적 저장 조건을 확립하기 위해 항 동결제를 첨가하는 방법을 연구하였다. 냉동시 세포보호를 위하여 항동결제로 10% adonitol을 균 배양액과 1:1로 혼합하여 최종 농도 5%로 하여 동결 건조한 시료와 첨가치 않은 시료를 상온에서 3주간 보관한 후, 배지에 녹여 배양하며 균 생장과 생체 발광 능을 비교한 결과, adonitol을 첨가한 균은 생장 유도기에서생장 대수기로 넘어가는데 10시간 걸린 데 반하여, adonitol을첨가시키지 않은 균은 26시간으로 생장 유도기 시간이 두 배 이상 늘어나 회복되는데 많은 시간이 소요되는 것을 알 수 있었다(Fig.
제안 방법
A)를이용하여 600nm에서 흡광도를 측정하였다. 배지 비교실험에서균체량의 측정은 5 ml의 배지에 -7ITC에 보관 중인 E pho- sphoreitm을 접종하여 하룻밤 배양하여 생장 대수기 상태에 있는 배양액 500"/를 500 ml의 배지에 접종하여 48시간 동안 2CPC에서 진탕 배양(180rpm)하며, 2 시간 간격으로 흡광도를 측정하였고, 생체 발광량의 측정은 매 8 시간마다 배양액 1 ml를 luminometer tube(Rohren-Tubes No. 55.476, 5 ml, Sarstedt Co., Ger.)에 취하여 Luminometer(LUMAT LB 9507, EG & G Berthold, Ger.X 사용하여 생체 발광량을 측정하였다.
)에 취하여 Luminometer(LUMAT LB 9507, EG & G Berthold, Ger.X 사용하여 생체 발광량을 측정하였다. 생체 발광량의 단위는 RLU(Relative Light Units)로, 10초당 1.
각 온도별로 냉동 보관한 시료를 50 ml mLB 배지에 50 ul 씩 접종하여 48시간 동안 180 rpm, 20℃에서 배양하며, 균체량과 생체 발광량을 측정하여 비교하였다. 상온에서 3주간 저장한 동결건조 시료는 mLB 배지 1 ml를 첨가하여 완전히 녹인 다음, 30% 글리세롤을 함유한 -70℃보관 균주를 대조 군으로 하여 처리 전 균체량을 기준으로 동일한 균체량을 환산하여 50 ml의 mLB 배지에 접종하여 배양하며 균체량과 생체 발광량을 비교 분석하였다.
균체량의 측정은 분광 광도계(DU 650, Beckman, U.S.A)를이용하여 600nm에서 흡광도를 측정하였다. 배지 비교실험에서균체량의 측정은 5 ml의 배지에 -7ITC에 보관 중인 E pho- sphoreitm을 접종하여 하룻밤 배양하여 생장 대수기 상태에 있는 배양액 500"/를 500 ml의 배지에 접종하여 48시간 동안 2CPC에서 진탕 배양(180rpm)하며, 2 시간 간격으로 흡광도를 측정하였고, 생체 발광량의 측정은 매 8 시간마다 배양액 1 ml를 luminometer tube(Rohren-Tubes No.
0 ml)에 700 ul 씩을 넣고 글리세롤 300 ult 넣어 잘 혼합한 다음, -2(TC, -70℃ 및 액체질소에 12주간 보관하였다. 동결건조는 배 양액 300 ul를 2.0 ml screw cap tube에 담은 후, -7(FC에서 1시간 동안 동결한 다음, 동결건조기 (FDU-540, EYELA, Japan)를 사용하여 4시간 동안 동결건조 하였다. 동결 건조 후, 10분간 질소가스를 충전하여 상온에 3주간 저장하였다.
본 연구에서는 Luria broth(LB) 배지에 P. phosphoreum의 일반적인 배양 배지인 NB 배지와 동일하게 탄소원으로 글리세롤을 0.3% 농도로 첨가하고, 해양미생물인 P. phosphoreum 의 생장에 필요한 Na+을 조건에 맞추어 1.5% 보정, 첨가하였다. 이러한 mLB배지에서 균의 생장 및 생체 발광량을 NB 배지와 비교 분석한 결과, 생장 유도기 및 대수기에서 동일한 성장 양상을 보였으며, 생장 대수기에서 생장 휴지기로 넘어갈 때, mLB 배지에서 더 높은 세포 생장을 보여 주었고, 이에 따라 생체 발광량의 최고치는 mLB 배지에서 NB 배지에서 보다 25% 높은 값을 나타내었다(Fig.
생체 발광량을 측정하여 비교하였다. 상온에서 3주간 저장한 동결건조 시료는 mLB 배지 1 ml를 첨가하여 완전히 녹인 다음, 30% 글리세롤을 함유한 -70℃보관 균주를 대조 군으로 하여 처리 전 균체량을 기준으로 동일한 균체량을 환산하여 50 ml의 mLB 배지에 접종하여 배양하며 균체량과 생체 발광량을 비교 분석하였다.
2% D-glucose를 포함하는 yeast extract 고체배지나 Basal medium 에서는 흰색의 colony를 형성하는 특징을 가지고 있다(15). 특히 생체 발광현상을 보이는 종들을 배양하기 위하여 Luminescence medium(LM)을 사용하는데, BM에 0.3%(v/v) 글리세롤과 0.5% yeast extract, 0.5% 트립톤, 0.1% CaCQ를 첨가한다 (16).
대상 데이터
P. phosphoreum을 배양하기 위한 배지로는 Nutrient Broth (NB) 배지와 modified LB(mLB) 배지를 사용하였다. NB 배지 조성 은 liter 당 12.
균주는 생 체 발광현상을 나타내는 해 양미 생물인 Photobacterium phosphoreum (KCTC 2852)를 사용하였다.
동결 건조 후, 10분간 질소가스를 충전하여 상온에 3주간 저장하였다. 또한, 동결 건조 과정에서 항 동결제로서 adonitol(최종농도 5%)을 사용하였다.
성능/효과
동결건조 시킨 시료에서도 생체 발광량은 생장 대 수기에서 생장 휴지기로 넘어갈 때 최고조에 달하는 양상을 보여주어, 생체발광은 저장 방법에 관계없이 세포 생장 곡선 상에서 일정한 양상을 보여주었다. Adonitol을 첨가한 시료에서 생체 발광량이 최고도에 달한 시점 역시 생장 대수기에서 생장휴지기로 넘어가는 접종 후 24시간 후로, 대조군으로 사용한 -70℃ 보관 30% 글리세롤 첨가 시료와 adonitol을 첨가치 않은 시료에 비하여 빠르게 나타났다.
첨가하는 방법을 연구하였다. 냉동시 세포보호를 위하여 항동결제로 10% adonitol을 균 배양액과 1:1로 혼합하여 최종 농도 5%로 하여 동결 건조한 시료와 첨가치 않은 시료를 상온에서 3주간 보관한 후, 배지에 녹여 배양하며 균 생장과 생체 발광 능을 비교한 결과, adonitol을 첨가한 균은 생장 유도기에서생장 대수기로 넘어가는데 10시간 걸린 데 반하여, adonitol을첨가시키지 않은 균은 26시간으로 생장 유도기 시간이 두 배 이상 늘어나 회복되는데 많은 시간이 소요되는 것을 알 수 있었다(Fig. 3). 동결건조 시킨 시료에서도 생체 발광량은 생장 대 수기에서 생장 휴지기로 넘어갈 때 최고조에 달하는 양상을 보여주어, 생체발광은 저장 방법에 관계없이 세포 생장 곡선 상에서 일정한 양상을 보여주었다.
3). 동결건조 시킨 시료에서도 생체 발광량은 생장 대 수기에서 생장 휴지기로 넘어갈 때 최고조에 달하는 양상을 보여주어, 생체발광은 저장 방법에 관계없이 세포 생장 곡선 상에서 일정한 양상을 보여주었다. Adonitol을 첨가한 시료에서 생체 발광량이 최고도에 달한 시점 역시 생장 대수기에서 생장휴지기로 넘어가는 접종 후 24시간 후로, 대조군으로 사용한 -70℃ 보관 30% 글리세롤 첨가 시료와 adonitol을 첨가치 않은 시료에 비하여 빠르게 나타났다.
의 몇몇 straine 4℃에서도 성장은 가능한 특성 때문이다(18). 따라서 3개월 정도의 중단기 저장에서는 세포의 생장을 억제하며, 저온 피해를 최소화 할 수 있는 -20℃ 저장이 최적 저장조건으로 사료된다.
-7CPC와 액체질소 저장에서는 생장 대수기의 시간이 비슷한 것으로 나타났으나, 생체 발광량은 균체량이 많은 -70℃ 저장 시료에서 좀 더 높은 수치를 나타내었다. 본 실험 결과, 액체배양액을 냉동상태로 3개월 저장 시, -20℃ 저장이 -70℃ 저장이나 액체질소에서의 저장보다 균 활성 유지, 생장 유도기의 단축 및 생체발광량에서 보다 좋은 결과를 보였다. 이러한 결과는 저온에서의 세포의 피해가 적은 것에 기인하는 것으로 사료된다.
본 실험에서는 P. phosphoreurrr을 장기간 저장 후, 배양 시 최적의 생체 발광능을 가질 수 있는 저장 온도를 찾고자, P. phosphoreum 배양액을 일반적인 방법에 따라 글리세롤을 30% 첨가하여 -20℃, -70℃, 액체질소에서 12주간 보관하였다가, mLB 배지에서 48시간 동안 진탕 배양하며, 균 생장 및 생체 발광량을 비교 분석한 결과, 생장 유도기는 -2UC에 보관되었던 시료가 약 10시간으로 가장 짧았고, -70℃와 액체질소에 보관되었던 시료들은 약 14시간으로 -20℃에 보관 시 생장 유도기를 4시간 정도 단축시키는 결과를 보여주었다. 생체 발광량 역시 균 생장과 비례하여 생장 대수기에서 생장 휴지기에 접어들 때 최고치를 보였는데, -2CFC에 보관 시 최고조에 이른 시간이 빨리 오며 더 높은 수치를 보여주었다(Fig.
1). 생체 발광량은 생장 대수기에서 균체 생장에 따라 증가하기 시작하여 생장 휴지기로 넘어갈 때에 최고조에 달하였고, 그 이후에는 급격히 감소하였다. 이상의 결과, P.
5% 보정, 첨가하였다. 이러한 mLB배지에서 균의 생장 및 생체 발광량을 NB 배지와 비교 분석한 결과, 생장 유도기 및 대수기에서 동일한 성장 양상을 보였으며, 생장 대수기에서 생장 휴지기로 넘어갈 때, mLB 배지에서 더 높은 세포 생장을 보여 주었고, 이에 따라 생체 발광량의 최고치는 mLB 배지에서 NB 배지에서 보다 25% 높은 값을 나타내었다(Fig. 1). 생체 발광량은 생장 대수기에서 균체 생장에 따라 증가하기 시작하여 생장 휴지기로 넘어갈 때에 최고조에 달하였고, 그 이후에는 급격히 감소하였다.
생체 발광량은 생장 대수기에서 균체 생장에 따라 증가하기 시작하여 생장 휴지기로 넘어갈 때에 최고조에 달하였고, 그 이후에는 급격히 감소하였다. 이상의 결과, P. phosphoreum을 위한 배지로 mLB 배지가 활용될 수 있는 가능성을 보여 주었다. 또한 NB 배지와의 제조 단가의 비교에서는, mLB 배지가 NB 배지 제조단가의 46.
후속연구
3%의 생존율을 보여 탈지 우유만을 사용한 대조군에 비하여 생존율이 높아, 본 실험의 결과와 유사한 결과를 나타내고 있다. 현재 진행되고 있는생체발광균주 P. phosphoreum을 이용한 환경오염 측정용 biosensor의 개발이 산업화되면, 산업현장으로의 정기적인 균주의 수급은 본 연구가 많은 도움을 주리라 사료된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.