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문제 정의
- 본 논문에서는 전보9)에 이어 부추의 항균성 물질 분리에 있어 항균 활성의 소실 방지와 더불어 효과적인 분리 방법을 확립하기 위한 최적 공정의 제시와 함께 항균물질의 화학구조를 규명하는 데 목적을 두었다.
제안 방법
- 각 분리 단계별로 얻어진 분획에 대하여 Bacillus cereus KCTC 1012를 표준균주로 agar diffusion method에 의하여 항균 활성을 측정하였다.'"''' Bacillus cereus를 600 nm, 흡광도 0.1이 되도록 희석한 일정 농도를 증균 배양하여 plate count agar에 도말한 후 paper disc (0 : 8 mm)에 실험과정에서 분리한 각각의 시료를 30μ1씩 주입하여 35℃, 24시간 배양한 후 항균 활성환의 지름을 측정하였다w
- Chloroform 분획의 항균물질을 분리하기 위하여 박층 크로마토그라피를 이용하였으며 그 결과는 Fig 2와 같다. UV 254 nm 를 조사한 결과 8개의 분리된 층을 얻었고, 이 부분들을 분취하여 용매에 녹여 여과한 후 농축하여 agar diffusion법으로 항균 활성을 측정하였다.
- TLC에서 항균 활성을 나타낸 영역을 취하여 이동상으로 용해하고 0.45 membrane filter로 여과한 후, Sep-Pak Ch로 처리한 시료를 HPLC로 분석하였다. Columne Clg(Finepak, 30X300 mm, Jasco, Japan)을 사용하였고, UV detector 254 nm, 시료 20|a.
- 이후 수용액층을 chloroform, ethylacetate, butanol 순으로 hexane과 동일하게 용매분획하였다. 각 용매분획층을 회전 진공증발기로 건고한 후 건고물의 무게를 측정하고 건 고물 무게의 10배에 해당하는 추출용매로 용해시켜 agar diffusion method로 항균 활성을 평가하였다
- methanol(10 : 1, v/v) 용매로 전개시켰다. 그 후, TLC에 나타난 영역을 각각 취하여 일정량의 chloroform과 methanol 1: l(v/v) 용매에 용출시킨 후 paper disc에 주입, 건조하여 항균 활성을 측정하였다.'"
- 따라서 이 복합물을 분리하는 것은 각 활성기의 전위도 차를 이용하는 것이 대부분이다. 그러므로 유기용매를 이용하여 이 복합물을 분리해서 활성도를 찾는 것은 매우 의미 있는 것으로 판단되어 극성 정도가 다른 용매로 분획을 하여 항균활성을 측정하였다. 그 결과 chloroform 분획에서 모든 균주에 대하여 가장 높은 항균활성환을 나타내었다(Table 1).
- 분자량 5,000 dalton 으로 한외여과하여 여액은 바로- 항균 활성을 측정하는데 사용하고 한외 여과막을 통과하 지 못한 분자량 5,000 dalton 이상의 물질은 증류수를 이용하여여액과 동일한 용량이 되도록 첨가하였다. 분자량 5, 000 dalton 이상에서는 환이 생기지 않았고, 5,000 dalton 이하에서 14 mm의 환이 나타났다.
- 생부추를 원심분리(IQOOOXg, 30min) 하여, glass filter(GF/C)로 여과한 후, 한외 여과막이 부착되어 있는 centrisart를 swing형 원심분리기에서 원심분리(2300Xg, 60 min)하여 여과액과, 상청액에 여과액 용량에 해당하는 증류수를 가하여 항균 활성을 측정하였다.
- 물층으로 분리하였으며 이 과정을 S회 반복하였다. 이후 수용액층을 chloroform, ethylacetate, butanol 순으로 hexane과 동일하게 용매분획하였다. 각 용매분획층을 회전 진공증발기로 건고한 후 건고물의 무게를 측정하고 건 고물 무게의 10배에 해당하는 추출용매로 용해시켜 agar diffusion method로 항균 활성을 평가하였다
- Dry purge에서 2분간 흡수되지 않은 물질과 수분을 제거하였고, 초기 50℃에서 휘발성 물질을 흡착하여 200℃로 승온시켜 탈착하였다. 주요 향기 성분은 standard 화합물과 상응하는 retention time과 mass spectra data와 비교하여 항균 활성물질을 확인하였다
대상 데이터
- 45 membrane filter로 여과한 후, Sep-Pak Ch로 처리한 시료를 HPLC로 분석하였다. Columne Clg(Finepak, 30X300 mm, Jasco, Japan)을 사용하였고, UV detector 254 nm, 시료 20|a.l, 유속은 0.5 ml/minS. 하였다.
- 경남 김해시 대동면 산지에서 재배된 부추를 대동농협을 통해 구입하여 -7(yc로 동결 저장하여 사용하였다.
- 분자량 5,000 dalton으로 분리할 수 있는 한외여과막 (Centrisart 13229, Sartorius)을 이용하여 항균물질을 분리하였다. 생부추를 원심분리(IQOOOXg, 30min) 하여, glass filter(GF/C)로 여과한 후, 한외 여과막이 부착되어 있는 centrisart를 swing형 원심분리기에서 원심분리(2300Xg, 60 min)하여 여과액과, 상청액에 여과액 용량에 해당하는 증류수를 가하여 항균 활성을 측정하였다.
이론/모형
- UV 254 nm 를 조사한 결과 8개의 분리된 층을 얻었고, 이 부분들을 분취하여 용매에 녹여 여과한 후 농축하여 agar diffusion법으로 항균 활성을 측정하였다. TLC fraction 6번에서 27.
- 반응을 나타내어 선택하였다. 각 분리 단계별로 얻어진 분획에 대하여 Bacillus cereus KCTC 1012를 표준균주로 agar diffusion method에 의하여 항균 활성을 측정하였다.'"''' Bacillus cereus를 600 nm, 흡광도 0.
- 부추의 항균 활성 물질의 분자구조를 밝히기 위하여 시료를 GC/MS로 측정하였으며, Techmar LSC-2000 (Techmar Co., Cincinnati, USA)를 이용하여 purge and trap method 에 따라 수행하였다. 시료 3 ml 당 40 ml/min, 20분간 질소가스를 이동시켜 포집하였다.
성능/효과
- GC/MS의 결과 부추의 항균물질은 황화합물인 cispropenyl disulfide(Fig. 3), S-methyl methylthiosulphonate (Fig 4), dimethyl disulfide(Fig 5)로 판명되었다. 황화합물은 allium속 식물에서 다량 함유되어 있고, 이것은 미생물 세포 내 주요 단백질과 결합하거나, 호흡에 관여하는 효소의 SH기와 반응한다는 보고가 있다.
- 현재 많은 연구가 진행된 마늘의 경우 항균 작용을 하는 allicin과 이와 유사한 methyl methanethiosulfinate의 항균 활성기작을 살펴보면 thiosulfinate가 세포 내 중요한 단백질인 SH기와 반응해 단백질 활성을 저해하는 것으로 추정되고 있다. Thiosulfinate의 구조 중 -S(O)S-기가 항균 활성을 나타내고, 이것은 아미노산인 cysteine과 쉽게 결합한다는 것이 확인되었다. 기타 마늘의 항미생물 작용에 대한 설명으로는 allicin이 호흡에 관여하는 효소의 SH기와 반응한다.
- 그러므로 유기용매를 이용하여 이 복합물을 분리해서 활성도를 찾는 것은 매우 의미 있는 것으로 판단되어 극성 정도가 다른 용매로 분획을 하여 항균활성을 측정하였다. 그 결과 chloroform 분획에서 모든 균주에 대하여 가장 높은 항균활성환을 나타내었다(Table 1). 이는 산초의 용매 분획에 있어 chlorofom 분획에서 ethylacetate 분획보다 조금 더 항균 활성을 나타내는 것과 일치하였고 항균물질이 chloroform 분획보다는 ethylacetate 분획에서 좀 더 활성을 나타낸다는 결과와는 약간의 차이를 보였다.
- 분자량 5, 000 dalton 이상에서는 환이 생기지 않았고, 5,000 dalton 이하에서 14 mm의 환이 나타났다. 분자량 5,000 이하에서만 항균 활성이 나타나는 것으로 보아 항균물질의 분자량은 5, 000 이하의 저분자 물질임을 알 수 있었다(Fig. 1). 이는 마늘의 항균 물질로 잘 알려진 allicin의 분자량 162, 갓의 항균물질(CzzHeO.
- 그 결과 chloroform 분획에서 모든 균주에 대하여 가장 높은 항균활성환을 나타내었다(Table 1). 이는 산초의 용매 분획에 있어 chlorofom 분획에서 ethylacetate 분획보다 조금 더 항균 활성을 나타내는 것과 일치하였고 항균물질이 chloroform 분획보다는 ethylacetate 분획에서 좀 더 활성을 나타낸다는 결과와는 약간의 차이를 보였다.
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