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문제 정의
- 약용식물은 보통 약탕기에 달여 음용하기 때문에 본 실험에서도 약용식물에 대한 열수추출을 실시하여 항균활성을 검색하고자 하였다. 약용식물의 추추물의 경우 추출물의 pH가 3.
- 즉 껍질과 과육의 맛은 시고단맛, 과실의 인(仁)은 맵고 쓴맛, 전체적으로는 신맛이 있으며, 옛날부터 우리나라 한의학에서 거담, 자양 및 강장제 등으로 이용되는 생약제로 약리기능이 다양하여 진정, 진해, 해열등의 중추억제작용, 혈압강하작용 및 알콜해독작용이 있다(20). 한편, 현재까지 알려진 오미자의 성분에 관한 연구로는 주로 약리기능을 나타내는 주요 성분으로 알려진 lignan화합물로 gomisin A, B, C, F, G와 deoxyschizandrin, schizandrin, wuweizisu A, B, C, angeloylgomisin H, Q, tigloylgomisin H, benzoylgomisin H 등을 분리 확인하는 연구가 주로 이루어졌고(21-25), 유기산으로 citric acid, malic acid, succinic acid가 보고되었으며(26), 47종류의 휘발성 정유 성분이 확인되었을 뿐이다(27) 본 연구는 천연물로부터 보존활성물질을 탐색하는 과정, 에서 오미자의 보존활성 성분을 분리, 정제를 하여 천연보존료로서의 활용 가능성을 검토하고자 하였다.
제안 방법
- 1차 항균활성 검색결과 강한 항균활성을 나타낸 ethylacetate 분획에 대해 chloroform-methanol을 이동상으로 silicagel column chromatography를 행하였다. silicagel 60 충진된 column에 methanol의 농도를 높여가며 (chloroform : methanol = 100 : 0, 90 : 10, 80 : 20순으로 stepwise elution) 용출하여 용출액의 극성도에 따라 11개의 획분으로 분획한 다음 항균활성을 검색하였다.
- 24시간 전배양한 B. cereus ATCC 14893, B. subtilis ATCC 6633, P. aeruginosa ATCC 9027, S. typhimurium ATCC 14028, E. coli ATCC 27662를 오미자 methanol 추출물 1%를 첨가한 TSB에 접종하여 12시간 배양한 후 생균수를 측정하였다. 생균수의 측정은 시료를 0.
- HPLC를 이용하여 항균성을 보인 subfraction의 성분을 Fig. 2와 같이 분리, 정제하여 순수한 화합물 S-EA5T1 과 S-EA-5-T3를 얻었다.
- 오미자 추출물의 항균성을 paper disk agar diffusion법(19)에 따라 시험균주에 대해 clear zone의 생성유무를 관찰한 결과는 Table 2 와 같다. Methanol 추출물을 n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate, buthanol 및 water층으로 용매분획하여 얻은 분획물을 감압농축하여 용매를 완전히 증발시킨 후 methanol에 30mg/mL의 농도로 녹여 30㎕씩 접종하였다. 그 중 ethyl acetate 분획물에서 대조구에 비해 뚜렷한 생육억제환을 나타내었다.
- 얻었다. Methanol 추출물을 증류수에 현탁시킨 후 n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate, butanol로 극성에 따라 순차적으로 용매분획을 실시하였으며 각각의 용매 추출물과 최종적으로 water층을 분획, 농축하였다. 얻어진 각 분획물들은 membrane filter(Watman, No.
- chromatography를 행하였다. silicagel 60 충진된 column에 methanol의 농도를 높여가며 (chloroform : methanol = 100 : 0, 90 : 10, 80 : 20순으로 stepwise elution) 용출하여 용출액의 극성도에 따라 11개의 획분으로 분획한 다음 항균활성을 검색하였다. 최대 항균활성을 나타낸 fraction을 다시 chloroform: methanol(30 : 1)을 전개용매로 하여 2차 silicagel column chromatography를 행하여 7개의 분획으로 나누었다.
- 활성이 높게 나타난 ethyl acetate층은 감압증류한 후, 여러 가지 chromatography를 이용하여 분리, 정제한 다음, MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT 및 2D NMR등을이용하여 항균활성물질의 구조를 동정하였다, 그 결과 오미자의 약리기능을 나타내는 주요성분인 lignan계통의 화합물인 gomisin C로 추정되는 compound를 분리하였고, 다른 하나는 오미자의 정유성분인 trimethylcitrate로 동정하였다. 또한 오미자추출물의 균증식도와 분쇄육의 저장성에 미치는 효과를 검토하기 위하여 식품보장실험을 수행하였다. 그 결과 Salmonella typhimurium에 의해 문제시되는 식품에 천연보존료로서의 이용가능성을 시사하였다.
- coli ATCC 27662를 오미자 methanol 추출물 1%를 첨가한 TSB에 접종하여 12시간 배양한 후 생균수를 측정하였다. 생균수의 측정은 시료를 0.1% peptone 용액으로 희석한 후 pour plate method(28)로 TSA에 접종하여 24시간 배양한 후 형성된 colony수를 측정하였다.
- 하였다. 약용식물의 추추물의 경우 추출물의 pH가 3.0~7.0까지 폭넓게 나타나기 때문에, 각 균주에 대한 항균효과가 초기 pH에 의해 나타나는 것을 방지하기 위해 추출물의 pH를 7.0정도로 보정한 후 항균활성을 측정하였다. 오미자 추출물의 항균성을 paper disk agar diffusion법(19)에 따라 시험균주에 대해 clear zone의 생성유무를 관찰한 결과는 Table 2 와 같다.
- 오미자 열매로부터 항균활성물질을 분리하기 위하여 methanol 조추출물의 용매분획의 항균력을 측정하였다. 항균활성을 나타낸 methanol 조추출물은 다시 여러 가지 용매로 순차적으로 분배하여 n-hexan증, dichloromethane층, ethyl acetate층, buthanol층과 water층을 얻은 다음, 이들 분배층에 대해 항균화성을 검색한 결과, ethyl acetate층에서 가장 활성이 높게 나타났다.
- 오미자 추출물이 분쇄육의 저장성에 미치는 효과를 검토하기 위하여 분쇄육에 24시간 배양시킨 S. typhimurium을 104/mL 정도로 인위적으로 오염시킨 다음 오미자 추출물 1%, 3%, 5%를 각각 첨가하여 성형한 후 4℃에서 12일간 저장하면서 3일 간격으로 생균수를 측정하여 pour plate method(28)로 대조구와 비교하였다.
- silicagel 60 충진된 column에 methanol의 농도를 높여가며 (chloroform : methanol = 100 : 0, 90 : 10, 80 : 20순으로 stepwise elution) 용출하여 용출액의 극성도에 따라 11개의 획분으로 분획한 다음 항균활성을 검색하였다. 최대 항균활성을 나타낸 fraction을 다시 chloroform: methanol(30 : 1)을 전개용매로 하여 2차 silicagel column chromatography를 행하여 7개의 분획으로 나누었다. 이 중 항균성이 강하게 나타난 분획을 다시 silica coated TLC를 사용하여 (hexane : ethyl acetate = 50 : 50) 4개의 획분으로 분리하였으며 이중 R치가 0.
- 이 혼합액을 petri dish(87×15mm)에 8mL씩 부어 평판배지를 만들어 항균활성 실험용 plate를 만들었다. 항균활성 확인실험을 위해 멸균된 8mm paper disc(항생물질검정용 Toyo Roshi Kaisha, Ltd.)를 실험용 plate 표면 위에 올려놓고 항균활성을 확인하고자 하는 시험용액을 30㎕ 흡수시켜 세균은 37℃, 효모는 30℃ incubator에서 24~48시간 동안 배양한 후 disk주위의 생육저해환 생성유무로 항균력을 측정하였다.
- 항균활성을 나타낸 methanol 조추출물은 다시 여러 가지 용매로 순차적으로 분배하여 n-hexan증, dichloromethane층, ethyl acetate층, buthanol층과 water층을 얻은 다음, 이들 분배층에 대해 항균화성을 검색한 결과, ethyl acetate층에서 가장 활성이 높게 나타났다. 활성이 높게 나타난 ethyl acetate층은 감압증류한 후, 여러 가지 chromatography를 이용하여 분리, 정제한 다음, MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT 및 2D NMR등을이용하여 항균활성물질의 구조를 동정하였다, 그 결과 오미자의 약리기능을 나타내는 주요성분인 lignan계통의 화합물인 gomisin C로 추정되는 compound를 분리하였고, 다른 하나는 오미자의 정유성분인 trimethylcitrate로 동정하였다. 또한 오미자추출물의 균증식도와 분쇄육의 저장성에 미치는 효과를 검토하기 위하여 식품보장실험을 수행하였다.
대상 데이터
- 0×250mm, 10 ㎛, C18)을 사용하였다. 또한, Prep- HPLC는 Waters Delta Prep 4000(Waters. Co. USA)을 사용하였으며, NMR은 JNMLA 400 spectrometer(600MHz, JEOL Co., Japan)를, Mass Spectrometer는 JEOL AX505WA (JEOL Co., Japan)를 사용하였다,
- 본 실험에 사용한 오미자(schizandra, chinensis B.)는 서울경동시장에서 구입하여 풍건한 후 마쇄하여 추출용 시료로 사용하였다.
- HPLC는 Waters Co. 제품(Waters 510 Solvent delivery system, M-486 Tunable Absorbance detector)을 사용하였으며, column은 μBondapak(Waters. Co. USA 4.6×150 mm, 5 ㎛ 와 10.0×250mm, 10 ㎛, C18)을 사용하였다. 또한, Prep- HPLC는 Waters Delta Prep 4000(Waters.
- 항균성 실험에 사용한 균주는 Micrococcus luteus ATCC 19113, Bacillus cereus ATCC 14893, Bacillus subtilis ATCC 6633, Listeria monocytogenes ATCC 19184, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Escherichia coll ATCC 27662, Candida albicans ATCC 10231, Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763을 국립보건원에서 분양 받아 3회 계대배양하여 사용하였으며, 배지는Nutrient agar, Brain Heart Infusion agar와 YM agar 배지를사용하였다.
이론/모형
- 오미자추출물의 항균성 검색은 paper disk agar diffusion 법(19)에 따라 실험용 균주의 slant로부터 각 균주를 2백금이씩 취해 멸균한 50mL Nutrient broth(Difco) 생육배지에 접종하여 세균은 37℃, 효모는 30℃ Water bath에서 24시간동안 전배양 하였다. 균주가 배양된 생육배지를 Gram 양성세균은 Nutrient agar(Difco), Gram 음성세균은 Brain Heart Infusion agar(Difco), 효모는 YM agar(Difco) 배지 500mL에 각각 혼합하였다.
성능/효과
- Compound S-EA-5-T3는 미황색의 오일성 물질로 UVvisible spectrum의 결과 360nm에서 최대흡수피크가 관찰되었다. 1H-NMR spectrum 분석결과 1.34(3H, s, -HO-C-CH3) 3.67(6H, s, -OCH3×2), 4.51(3H, s, -OCH3), 4.86(6H, s, -OCH3×2), 5.41(3H, s, -OCH3), 6.10(1H, s, aromatic CH), 7.40(1H, s, aromatic CH)의 chemical shift를 나타내었으며 (Fig. 6), 13C-NMR spectrum의 결과 30개의 탄소 peak가 관측되었다(Fig. 7). 따라서 이 화합물은 Ikeya 등(25)과 손 등(26)이 보고한 gomisin C로 추정되었으며 이들 data와 매우 유사하였다.
- 1H-NMR spectrum의 결과는 Fig. 3과 같으며 δ2.61(2H, d, H-a), δ2.67(2H, d, H-b), δ3.38(1H, m, H-c), δ3.68(3H, m, H-d), δ3.76(3H, m, H-e)에서 proton이 관찰되었으며, 13C-NMR spectrum의 결과 44ppm(s. Cl), 49ppm(s. C2), 52ppm(s. C3), 5ppm(s. C4), 53ppm(s. C5), 75ppm(s. C6), 172ppm(s. C7), 175ppm(s. C8), 176ppm(s. C9)에서 9개의 탄소 peak가 관측되었으며 (Fig. 4), MS spectrum을 분석한 결과는 Fig. 5와 같았다. 그 밖에 DEPT(distorsionless enhancement by polarizaion transfer) 135에서 75ppm(C6)의 peak가나타나지 않으므로 6번 탄소가 4차 탄소임을 알 수 있으며 C1 과 C2가 음의 peak로 겹쳐 나타남으로서 이 두 탄소는 methylene 탄소임을 알 수 있었다.
- 또한 오미자추출물의 균증식도와 분쇄육의 저장성에 미치는 효과를 검토하기 위하여 식품보장실험을 수행하였다. 그 결과 Salmonella typhimurium에 의해 문제시되는 식품에 천연보존료로서의 이용가능성을 시사하였다.
- Methanol 추출물을 n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate, buthanol 및 water층으로 용매분획하여 얻은 분획물을 감압농축하여 용매를 완전히 증발시킨 후 methanol에 30mg/mL의 농도로 녹여 30㎕씩 접종하였다. 그 중 ethyl acetate 분획물에서 대조구에 비해 뚜렷한 생육억제환을 나타내었다. Dichloromethane 분획물에서도 약간의 항균력이 나타났으나 n-hexane과 water 분획물에서는 항균력이 전혀 나타나지 않았다'
- 대조구에 비해 B. cereus ATCC 14893, B. subtilis ATCC 6633, P. aeruginosa ATCC 9027, S. typhimurium ATCC 19184, E. coli ATCC 27662는 각각 2.82, 4.79, 2.42, 4.63, 2.68의 log cycle 감소현상을 보여 성장 억제효과가 뚜렷이 관찰되었으며, 특히 B. subtilis ATCC 6633와 S. typhimurium ATCC 19184는 성장 억제효과가 현저하게 차이가 나타났다. 이 결과는 이 등(29)이 보고한 오미자 1% 첨가구 TSB와 동일하게 HCI을 이용하여 pH를 조정한 TSB에 Listeria monocytogenes의 성장을 비교한 결과 pH 조정구는 대조구와 유사한 성장을 나타낸 반면 오미자 1% 첨가구는 뚜렷한 성장 억제현상을 나타내었다고 보고한 결과와 비슷한 경향을 나타냈다.
- typhimurium의 성장을 검사한 결과를 Table 5에 나타냈다. 오미자 1%, 3%, 5% 첨가구의 경우 대조구에 비해서 저장 12일간 각각 1.65, 1.97, 2.86의 log cycle의 감소하는 경향을 나타내어 육제품에 오염되는 S. typhimurium의 성장을 억제하고 저장성을 증진시키기 위한 보존제로서 가능성을 시시하였다.
- 그 밖에 DEPT(distorsionless enhancement by polarizaion transfer) 135에서 75ppm(C6)의 peak가나타나지 않으므로 6번 탄소가 4차 탄소임을 알 수 있으며 C1 과 C2가 음의 peak로 겹쳐 나타남으로서 이 두 탄소는 methylene 탄소임을 알 수 있었다. 이상의 결과로 이 화합물은 오미자의 정유성분인 citrate에 methyl가 3개 치환된 trimethylcitrate로 동정하였으며, 그 구조는 Fig. 10에 나타내었다. Compound S-EA-5-T3는 미황색의 오일성 물질로 UVvisible spectrum의 결과 360nm에서 최대흡수피크가 관찰되었다.
- 항균활성을 나타낸 methanol 조추출물은 다시 여러 가지 용매로 순차적으로 분배하여 n-hexan증, dichloromethane층, ethyl acetate층, buthanol층과 water층을 얻은 다음, 이들 분배층에 대해 항균화성을 검색한 결과, ethyl acetate층에서 가장 활성이 높게 나타났다. 활성이 높게 나타난 ethyl acetate층은 감압증류한 후, 여러 가지 chromatography를 이용하여 분리, 정제한 다음, MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT 및 2D NMR등을이용하여 항균활성물질의 구조를 동정하였다, 그 결과 오미자의 약리기능을 나타내는 주요성분인 lignan계통의 화합물인 gomisin C로 추정되는 compound를 분리하였고, 다른 하나는 오미자의 정유성분인 trimethylcitrate로 동정하였다.
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