선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 이상에서와 같이 대장균 O157:H7을 비롯한 장관출혈성 대장균은 대규모의 집단발생을 일으킬 뿐 아니라 그 증상도 매우 심각하기 때문에 원인식품인 식육 및 채소류 등에 대한 지속적인 분포조사가 수행되어야 하며, 아울러 분리주에 대한 특성조사가 필요하다. 이에 국내에서는 검출사례가 매우 낮은 장관출혈성태장균을 유통식품 중에서 검출하였으므로 분리주에 대한 분자생물학적 특성을 보고하고자 한다.
- 이러한 단점을 보완하기 위하여 오염원을 파악하고 오염 가능성이 높은 식품을 대상으로 지속적인 분포조사를 실시하여 사전에 식중독의 발생을 방지하는 것이 중요하다. 이에 식품의약품안전청에서는 매년 하절기 특별수거 및 지속적인 모니터링을 실시하여 식품에서 장관출혈성대장균의 오염체계를 감시하여 장관출혈성대장균 특히 대장균 O157:H7로 인한 위해를 사전에 방지하고자 노력하고 있다.
제안 방법
- 7㎕로 하였고, DNA 증폭은 94℃에서 1분간 denaturation, 55℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분간 extension을 1 cycle로 하여 30 cycle을 반응시켰다. 60 MDa plasmid DNA 검출을 위한 반응액은 eae 유전자와 동일하게 만들었으며, prime는 MFS1F와 MFSlR(Table 1)을 사용하였고, DNA 증폭은 94℃에서 40초간 denaturation, 55℃ 에서 30초간 annealing, 72℃ 에서 1분 30초간 extension을 1 cycle로 하여 35 cycle을 반응시켰다. 결과는 ethidium bromide(0.
- DNA 종폭은 95℃ 에서 30초간 denaturation, 55℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분간 extension을 1 cycle로 하여 35 cycle을 반응시켰다. Ethidium bromide(0.5㎕/ml)가 첨가된 0.8% agarose gel에서 전기영동 후 결과를 확인하였다.
- 대조로는 TSB를 DPBS용액으로 5배 농도로 희석한 후 50㎕를 접종하였다. Microplate는 36℃의 CO2 배양기에서 4일간 배양하면서 매일 시험결과를 관찰하였다.
- 이를 100℃로 15분간 가열한 후 원심분리(10,000 rpm, 15분)하여 얻어진 상등액을 주형 DNA로 사용하였다. VT Ⅰ과 VT Ⅱ의 확인을 위한 반응액은 Taq DNA polymerase(5U/㎕) 0.2㎕, 10×PCR buffer 3㎕, 25mM MgCl2 2㎕, dNTPs(l mM) 3㎕, 주형 DNA 6㎕, VT Ⅰ 및 VT Ⅱ primer(Table 1) 각 3㎕, 증류수 10.5㎕를 혼합하여 총량을 36.7㎕로 하였다. DNA 종폭은 95℃ 에서 30초간 denaturation, 55℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분간 extension을 1 cycle로 하여 35 cycle을 반응시켰다.
- 에 의하였다. Vero cell(ATCC CCL-81)과 HeLa cell(ATCC CCL-2)은 각각 5% fetal bovine serum이 첨가된 Dulbecco's modified essential medium(DMEM, Gibco)에 접종하여, 36℃의 CO2배양기에서 3일간 배양한 후 Vero cell과 HeLa cell의 각 부유액 100㎕를 96 well niicroplate에 접종하여 monolayer를 만들었다. VT 생성 3주는 tryptic soy broth(TSB, Difco) 10ml에 각각 접종하여 37℃에서 24시간 진탕 배양 후 배양액을 원심분리(10,000 rpm, 30분)하였고, 상등액을 membrane filter(0.
- 의 방법에 따랐다. eae 유전자를 확인하기 위한 반응액은 Taq DNA polymerase(5U/㎕) 0.2㎕, 10×PCR buffer 3㎕, 25 mM MgCl2 2㎕, dNTPs(lmM) 3㎕, 주형 DNA 6㎕, AE 19, AE 20(Table 1) 각 3㎕, 증류수 10.5㎕를 혼합하여 총량을 30.7㎕로 하였고, DNA 증폭은 94℃에서 1분간 denaturation, 55℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분간 extension을 1 cycle로 하여 30 cycle을 반응시켰다. 60 MDa plasmid DNA 검출을 위한 반응액은 eae 유전자와 동일하게 만들었으며, prime는 MFS1F와 MFSlR(Table 1)을 사용하였고, DNA 증폭은 94℃에서 40초간 denaturation, 55℃ 에서 30초간 annealing, 72℃ 에서 1분 30초간 extension을 1 cycle로 하여 35 cycle을 반응시켰다.
- 에 따라 PCR법으로 실시하였다. 멸균증류수 50㎕를 가한 1.5㎕ 원 심관에 시험균주 한 집락을 취하여 현탁하였다. 이를 100℃로 15분간 가열한 후 원심분리(10,000 rpm, 15분)하여 얻어진 상등액을 주형 DNA로 사용하였다.
- 장관출혈성대장균은 국내에서는 매우 적은 분리율을 보이고 있으며 환자 발생수도 극히 낮은 실정이지만, 1996년부터 일본에서 대규모의 집단발생이 일어남에 따라 이 균으로 인한 식중독 발생을 사전에 방지하기 위하여 분포조사가 지속적으로 수행되고 있다. 본 실험에서는 1997년부터 1999년사이 식육, 햄버거 및 채소류 1,200건의 식품을 대상으로 분포조사를 실시하였으며, 이 결과 분리된 3주의 VT 생성 대장균에 대한 분자생물학적 특성을 조사하였다. 즉, 병원성과 관련된 VT, eae 유전자 및 60 MDa plasmid 유전자를 PCR법에 의하여 각각 검출하였다.
- 1% formaline을 가한 saline 5 ml과 혼합하였다. 이 액 0.5 ml과 H 항혈청 3 방울을 혼합하여 55℃에서 1시간 배양 후 응집의 유무를 관찰하였다.
대상 데이터
- Vero cell과 HeLa cell에 대한 세포독성은 분리주의 세포 배양액을 이용하였다. 대장균 O157:H7 분리주는 vero cell과 HeLa cell에 세포독성을 보였는데, 접종 후 24시간에는 대부분의 cell에서 세포독성이 관찰되었으며, 48시간 후에는 모든 cell이 사멸되었다.
- 표준균주는 Escherichia coli O157:H7 ATCC 43894를 국립보건원에서 분양받아 사용하였다. 시험균주는 1997년부터 1999년 사이 유통 식육과 햄버거 등 식품 품목에서 분리된 대장균 1,700주를 사용하였다.
- 표준균주는 Escherichia coli O157:H7 ATCC 43894를 국립보건원에서 분양받아 사용하였다. 시험균주는 1997년부터 1999년 사이 유통 식육과 햄버거 등 식품 품목에서 분리된 대장균 1,700주를 사용하였다.
이론/모형
- O형은 생균과 사균에 대하여 단가 및 다가 항혈청(Denka Seiken co.)을 이용하여 slide agglutination법에 의하여 실시하였다. H 혈청형을 확인하기 위하여 분리균을 motility GI 배지(Difco)에 접종하여 35℃에서 하룻밤 배양하였다.
- VT Ⅰ과 VT Ⅱ 생성능 확인은 Strockbine8)에 따라 PCR법으로 실시하였다. 멸균증류수 50㎕를 가한 1.
- 75㎍)이었다. 결과판정은 National Committe for Clinical Laboratory Standardization11)에 준하였다.
- 장내 부착과 침투의 역할을 하는 eae 유전자 및 60 MDa plasmid DNA 확인시험은 Fratamico 등9)의 방법에 따랐다. eae 유전자를 확인하기 위한 반응액은 Taq DNA polymerase(5U/㎕) 0.
- 본 실험에서는 1997년부터 1999년사이 식육, 햄버거 및 채소류 1,200건의 식품을 대상으로 분포조사를 실시하였으며, 이 결과 분리된 3주의 VT 생성 대장균에 대한 분자생물학적 특성을 조사하였다. 즉, 병원성과 관련된 VT, eae 유전자 및 60 MDa plasmid 유전자를 PCR법에 의하여 각각 검출하였다. 혈청형 O157:H7 분리주는 햄버거에서 분리된 것으로서 60 MDa plasmid DNA는 확인되었으나, eae 유전자는 검출되지 않았으며 VT Ⅱ를 생성하였다.
- 항생제 감수성시험은 disk diffusion method에 의하여 실시하였다.10) 사용 항생제는 ampicillin(10㎍), carbenicillin (100㎍), ampicillin/sulbactam(10/10㎍), cephalothin(30㎍), gentamycin(10㎍), neomycin(30㎍), streptomycin(10㎍), tobramycin(10㎍), kanamycin(30㎍), amikacin(30㎍), tetracycline(30㎍), minocycline(30㎍), ciprofloxacin(5㎍), norfloxacin(10㎍), chloramphenicol(30㎍), nalidixic acid (30㎍)와 trimethoprim/sulfamethoxazole(1.
성능/효과
- C). 3주의 VT 생성 분리주예서 eae 유전자는 검출되지 않았으며, 혈청형 O157:H7 분리주만이 60 MDa plasmid DNA가 검출되었다. 이 결과로 VT 생성 분리주는 eae 유전자 및 60 MDa plasmid DNA가 검출되지 않아 질병 유발능은 약한 것으로 추정되었다.
- PCR에 의한 VT 검출결과 VT Ⅰ은 475bp, VT Ⅱ는 863bp에서 각각 검출되었다. VT를 생성하는 것으로 확인된 분리주의 혈청형을 확인한 결과 O157:H7, O26:H4 및 O55: H12로 각각 확인되었다. 혈청형 O157:H7 분리주는 VT Ⅱ를 생성하였고, 혈청형 O26 분리주는 VT Ⅰ과 VT Ⅱ를 생성하였다.
- 대장균 O157:H7 분리주는 ampicillin과 streptomycin에 내성을 보였으나 carbenicillin, ampicillin/sulbactam, cephalothin, gentamycin, neomycin, streptomycin, tobramycin, kanamycin, amikacin, tetracycline, minocycline, ciprofloxacin, norfloxacin, chloramphenicol, nalidixic acid와 trimethoprim/sulfamethoxazole에는 감수성을 나타냈다. 혈청형 O26:H4 분리주는 ampicillin, carbenicillin, cephalothin, neomycin, tetracycline 과 trimethoprim/ sulfamethoxazole에 내성을 보였으나, ampicillin/sulbactam, gentamycin, streptomycin, tobramycin, kanamycin, amikacin, minocycline, ciprofloxacin, norfloxacin, chloramphenicol, nalidixic acid에는 감수성을 나타냈다.
- 22-24) Yatsuyanagi 등24)에 의하면 60 MDa plasmid DNA와 eae 유전자는 사람에게 설사, 출혈성대장염, 용혈성요독증후군을 유발하는 VT의 기작에 중요한 역할을 한다고 하였으며, Beutin 등25)도 VT의 생성이 확인되더라도 60 MDa plasmid나 eae 유전자가 없는 경우 이러한 유전자를 보유하고 있는 대장균에 비하여 사람에게 병원성을 적게 나타내는 것으로 설명하고 있다. 본 실험에서는 확인된 3주에서 eae 유전자는 확인되지 않았으며 혈청형 O157:H7 분리주만이 60 MDa plasmid DNA를 보유하고 있어 eae 유전자나 plasmid DNA를 포함하는 대장균보다 병인유발능력이 약할 것으로 추정되었다.
- 인접한 일본에서의 장관출혈성대장균 발생과 관련하여 식생활습관이 유사하고 인적·물적 교류가 많은 우리나라에서도 대장균 O157:H7에 대한 주의가 촉구되어 왔고, 식품위생분야에서도 국내 유통식품에 대한 오염실태 조사가 필요함을 인지하여 식품의약품안전청에서는 1996년부터 식육 및 햄버거 등 유통식품에 대하여 검사하기 시작하였다. 식품 중 오염실태를 조사하는 과정에서 수입쇠고기 및 국내 유통쇠고기에서 대장균 O157:H7과 대장균 O26:H4가 검출되었다. 국내에서는 대장균 O157:H7로 인한 집단발생 사례는 없으나, 1994년, 1998년과 1999년 환자로부터 O157:(H7)이 검출되어 국내에서도 이 균에 의한 환자가 발생될 수 있다는 사실을 보여 주었다.
- 혈청형 O55:H12는 ampicillin, carbenicillin, cephalothin, tetracycline, minocycline(30㎍), chloramphenicol, kanamycin 과 trimethoprim/sulfamethoxazole에는 내성이 확인되었으나, ampicillin/sulbactam, streptomycin, amikacin, tetracycline, minocycline, chloramphenicol에 각각 감수성을 보였다. 이 결과 항생제에 대한 다재내성의 특성을 확인하여 항생제 내성균의 문제점을 암시하였다.
- 3주의 VT 생성 분리주예서 eae 유전자는 검출되지 않았으며, 혈청형 O157:H7 분리주만이 60 MDa plasmid DNA가 검출되었다. 이 결과로 VT 생성 분리주는 eae 유전자 및 60 MDa plasmid DNA가 검출되지 않아 질병 유발능은 약한 것으로 추정되었다.
- 장내부착과 침투인자인 eae 유전자는 1,087 bp에서 검출되었으며(Fig. 1. B) 60 MDa plasmid DNA는 166 bp에서 각각 확인되었다(Fig.1. C). 3주의 VT 생성 분리주예서 eae 유전자는 검출되지 않았으며, 혈청형 O157:H7 분리주만이 60 MDa plasmid DNA가 검출되었다.
- 즉, 병원성과 관련된 VT, eae 유전자 및 60 MDa plasmid 유전자를 PCR법에 의하여 각각 검출하였다. 혈청형 O157:H7 분리주는 햄버거에서 분리된 것으로서 60 MDa plasmid DNA는 확인되었으나, eae 유전자는 검출되지 않았으며 VT Ⅱ를 생성하였다. 혈청형 O26:H4 분리주는 VT Ⅰ과 VT Ⅱ를 생성하였으며, eae 유전자 및 plasmid DNA 유전자는 보유하고 있지 않았다.
- 대장균 O157:H7 분리주는 ampicillin과 streptomycin에 내성을 보였으나 carbenicillin, ampicillin/sulbactam, cephalothin, gentamycin, neomycin, streptomycin, tobramycin, kanamycin, amikacin, tetracycline, minocycline, ciprofloxacin, norfloxacin, chloramphenicol, nalidixic acid와 trimethoprim/sulfamethoxazole에는 감수성을 나타냈다. 혈청형 O26:H4 분리주는 ampicillin, carbenicillin, cephalothin, neomycin, tetracycline 과 trimethoprim/ sulfamethoxazole에 내성을 보였으나, ampicillin/sulbactam, gentamycin, streptomycin, tobramycin, kanamycin, amikacin, minocycline, ciprofloxacin, norfloxacin, chloramphenicol, nalidixic acid에는 감수성을 나타냈다. 혈청형 O55:H12는 ampicillin, carbenicillin, cephalothin, tetracycline, minocycline(30㎍), chloramphenicol, kanamycin 과 trimethoprim/sulfamethoxazole에는 내성이 확인되었으나, ampicillin/sulbactam, streptomycin, amikacin, tetracycline, minocycline, chloramphenicol에 각각 감수성을 보였다.
- 혈청형 O26:H4 분리주는 ampicillin, carbenicillin, cephalothin, neomycin, tetracycline 과 trimethoprim/ sulfamethoxazole에 내성을 보였으나, ampicillin/sulbactam, gentamycin, streptomycin, tobramycin, kanamycin, amikacin, minocycline, ciprofloxacin, norfloxacin, chloramphenicol, nalidixic acid에는 감수성을 나타냈다. 혈청형 O55:H12는 ampicillin, carbenicillin, cephalothin, tetracycline, minocycline(30㎍), chloramphenicol, kanamycin 과 trimethoprim/sulfamethoxazole에는 내성이 확인되었으나, ampicillin/sulbactam, streptomycin, amikacin, tetracycline, minocycline, chloramphenicol에 각각 감수성을 보였다. 이 결과 항생제에 대한 다재내성의 특성을 확인하여 항생제 내성균의 문제점을 암시하였다.
후속연구
- 2차오염을 방지하기 위하여 가열한 음식과 가열처리하지 않은 음식을 같이 놓지 않도록 하며, 감염된 사람 특히, 어린이는 손을 비누로 깨끗하게 씻어서 감염이 퍼질 위험성을 줄여야 한다. 또 적당한 수준의 chlorine이 처리된 물이나 다른 오염되지 않는 물을 마시는 등의 주의를 기울인다면 대장균 O157:H7에 의한 감염 및 전파는 방지할 수 있을 것이다.
- 이상에서와 같이 대장균 O157:H7을 비롯한 장관출혈성 대장균은 대규모의 집단발생을 일으킬 뿐 아니라 그 증상도 매우 심각하기 때문에 원인식품인 식육 및 채소류 등에 대한 지속적인 분포조사가 수행되어야 하며, 아울러 분리주에 대한 특성조사가 필요하다. 이에 국내에서는 검출사례가 매우 낮은 장관출혈성태장균을 유통식품 중에서 검출하였으므로 분리주에 대한 분자생물학적 특성을 보고하고자 한다.
- 또한 여러 가지 병원인자를 동시에 검출하는 multiplex PCR법을 이용하여 신속하고 간단하게 유전자를 확인하고 있어, 많은 실험실에서 사용되고 있다. 최근에는 대장균 O157:H7을 비롯하여 verotoxirr을 생성하는 장관출혈성대장균을 신속검출하기 위 한 키트가 상업화되어 시판되고 있으며, 국내에서도 신속검출법에 관한 연구가 수행되고 있으므로 앞으로는 식품 중에서 신속·간단하게 장관출혈성대장균을 검출할 수 있을 것으로 기대된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.