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문제 정의
- 그러나 현재까지 진행되고 있는 인삼조직배양 연구들은 각 배지성분들 각각의 효과를 독립적으로 조사하는 방법을 사용하였으므로 각 요소들간의 상호효과를 확인할 수 없고 각 요소들의 종합적인 결과를 얻을 수 없었다. 따라서 본 연구의 목적은 다양한 조성의 배지에 인삼을 배양한 후 생장율을 측정하여 각 실험요소들간의 종합적인 효과를 평가할 수 있는 반응표면분석법 (Response Surface Metho- dology : RSM)으로 등고분석과 삼차원 분석을 수행함 2로써 인삼 root의 최적액체배양조건을 확립하는데 있다.
제안 방법
- 3 level - 4 factor에 의해 design된 fractional facto-rial block에 따라 배지를 제조하여 root 0.6 g씩을 100 mL flask에 접종하고 25℃ 암조건 하에서 60 rpm으로 4주간 진탕배양한 뒤 생장율을 측정하였다. Root의 생장율은 인삼 root를 살균된 여과지 (Whatman No.
- Stat-graphics 내의 program중 하나인 Central Composite Design(CCD)을 이용하여 3 level - 4 factor로 design하여 4주간 인삼 root를 배양하고, fresh weight를 종속변수로 하여 측정한 결과는 Table 1과 같다. pH 5.
- Stat-graphics(STSC Inc. Rockville, MD, USA)내의 cen-tral composite design(CCD) program을 이용하여 root 배양배지의 조건인 pH, sucrose 농도, nitrogen 농도, phos-phate 농도 등을 독립변수로 3 level - 4 factor의 fractional fectorial block을 정하였다(IBble 1). 배지의 초기 pH는 최대 7.
- 고려인삼(Rmax ginseng C.A. Meyer)의 씨앗의 외피를 제거한 후 70%(v/v) ethanol로 20초, 4% NaOCl용액(v/ V)으로 15분간 살균하고, 무균수로 5회 세척한 다음 살균된 여과지(Whatman No. 1)위에 올려놓아 물기를 제거하였다. 캘러스를 유도하기 위해서 knifeS.
- 5로 맞추었으며, sucrose 농도는 최대 5%, 최소 1%, 중간값으로 3% 되게끔 첨가였고, nitro-gen 농도는 최고 750 mg/L, 최소 50mg/L, 중간값으로 400mg/L 첨가하였으며, phosphate 농도는 SH배지의 phos-phate 농도를 기준으로 하여, 최고 5/3배, 최소 1/3배, 중간값 1배가 되도록 각각 독립변수의 level을 설정하였다. 배지는 SH배지를 기본으로 하고, 식물생장조절제로 0.5mg/L BAP + 3.0mg/L NAA를 첨가하였다.
- Rockville, MD, USA)내의 cen-tral composite design(CCD) program을 이용하여 root 배양배지의 조건인 pH, sucrose 농도, nitrogen 농도, phos-phate 농도 등을 독립변수로 3 level - 4 factor의 fractional fectorial block을 정하였다(IBble 1). 배지의 초기 pH는 최대 7.0, 최소 4.0, 중간값 5.5로 맞추었으며, sucrose 농도는 최대 5%, 최소 1%, 중간값으로 3% 되게끔 첨가였고, nitro-gen 농도는 최고 750 mg/L, 최소 50mg/L, 중간값으로 400mg/L 첨가하였으며, phosphate 농도는 SH배지의 phos-phate 농도를 기준으로 하여, 최고 5/3배, 최소 1/3배, 중간값 1배가 되도록 각각 독립변수의 level을 설정하였다. 배지는 SH배지를 기본으로 하고, 식물생장조절제로 0.
- 식물조직배양기술을 이용하여 인삼 root를 생산하고자, 식물생장조절물질로 유도된 인삼 root를 사용하여 최적액체배양조건을 RSM을 이용하여 조사하였다. 최적액체배양조건을 배지의 pH, sucrose 농도, nitrogen 농도, phosphate 농도의 3 level - 4 factor의 fractional factorial design에 의하여 조사한 결과, 인삼 root의 생장율은 최저 1.
- 캘러스를 유도하기 위해서 knifeS. 외피를 제거한 씨앗에 작은 상처를 낸 후 0.5mg/L BAP + 3.0mg/L NAAU) 조합으로 식물생장조절제가 첨가된 MS배지에 씨앗을 심어암조건, 25℃에서 3개월간 배양하여 캘러스를 유도시켰다.
- 0 mg/L NAA 조합의 식물생장조절제가 첨가된 SH배지에 옮겨 25℃ 암조건에서 배양하여 약 3개월 후에 root를 얻었다. 이렇게 유도된 인삼 root를 다음의 실험에 사용하였고, 유도된 root의 계대배양에는 0.5mg/L BAP + 3.0mg/L NAA를 첨가한 SH 액체배지를 사용하여 25℃, 암조건으로 진탕배양기 (KSI-200L, 고려기기)에서 60 rpm으로 배양하여 4주간격으로 계대배양 하였다.
- 인삼 root 배양에서 생장율을 증가시키기 위하여 배지 내 pH, sucrose농도, nitrogen농도, phosphate농도를 독립변수로 설정하고, root의 생체중량을 종속변수 Y로 설정하여 다중회기분석을 수행한 결과는 Table 2와 같다. 이 결과를 근거로 하여 90% 유의수준에서 유의성이 있는 독립변수 중 상수, Xi항인 pH, X2항인 sucrose, 교호작용을 나타내지 않는 interaction terms 중 sucrose X nitrogen, 동일한 독립변수간의 교호작용을 나타내지 않는 quadratic terms 중 pH, sucrose항을 채택하여 model식 Y= -1.
대상 데이터
- Lo uis, MO, USA)의 제품을 사용하였고, agar는 Junsei Chem-ical Co.(lbkyo, Japan)의 제품을 사용하였으며, chlorox는 유한양행의 제품을 사용하였다. 또한 sucrose, ethanol 등은 특급시약을 사용하였다.
- 고려인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)의 씨앗은 한국인삼 연초연구원 수원경작시험장에서 분양받아 사용하였다. 캘러스 유도에 사용한 MS 배지는 Murashige와 Skoog의 방법9) 에 따라 각 stock solution을 제조하였고, root 유도에 사용한 SH 배지는 Schenk와 Hilderbrant 방법에 따라 stock solution을 특급시약으로 제조한 후 냉장고에 보관하면서 사용하였다.
데이터처리
- 측정한 생장율을 종속변수로 설정한 후 각 독립변수들 간의 관계를 SAS(SAS Institute Inc. Cary NC, USA)로 다중회기분석 및 분산분석을 실시한 후 유의성이 인정되는 변수만을 채택하여 각 종속변수에 해당하는 model식을 설정하고 이를 RSM에 의하여 등고분석과 3차원 분석을 실시하여 최적조건을 설정하였다.
이론/모형
- Meyer)의 씨앗은 한국인삼 연초연구원 수원경작시험장에서 분양받아 사용하였다. 캘러스 유도에 사용한 MS 배지는 Murashige와 Skoog의 방법9) 에 따라 각 stock solution을 제조하였고, root 유도에 사용한 SH 배지는 Schenk와 Hilderbrant 방법에 따라 stock solution을 특급시약으로 제조한 후 냉장고에 보관하면서 사용하였다. 식물생장조절 제인 6-Benzylaminopurine(BAP), 1- Naphthaleneaceticacid(NAA)는 Sigma Chemical Co.
성능/효과
- 측정한 결과는 Table 1과 같다. pH 5.5, sucrose 3%, nitrogen 400 mg/L, phosphate 80.7 mgl에서 2.33g으로 최대 생장을 하였고, pH 4.0, sucrose 1%, nitrogen 750 mg/ L, phosphate 134.5 mg/L에서 1.00g으로 최소 생장을 하였다. pH 5.
- 33g까지 나타났다. 다중회귀분석으로 구한 model식을 가지고 등고분석과 3차원분석을 수행한 후 독립변수의 최저 또는 최고수준에서 종속변수가 최대치를 나타내지 않는 배지의 pH와 sucrose농도의 변수에 대하여 model식을 편미분한 결과 인삼 root의 최적액체배양조건은 pH 5.6, sucrose 3.8%, nitrogen 50mg/L, phosphate 80.7 mg/L로 예측되었다. 이렇게 결정된 최적조건값들을 model식에 대입하여 얻은 예상치는 2.
- 000063X2X3를 얻었다. 다중회기분석 전체에 대한 분산분석(Table 3)을 행한 결과 유의수준을 검정하는 F-value도 99.9% 수준에서 유의성을 나타내어 다중 회기분석에 의하여 선정된 각 변수에 의해 설정된 model 식이 99.9% 수준에서 유의성이 있었음을 알 수 있었다. 위에서 얻은 model식에 대한 반응표면분석법을 수행하여 Fig.
- 1~3과 같은 결과를 얻었다. 독립변수 pH를 고정시켜 분석한 결과 pH 5.5일 때, sucrose 4%, nitrogen 50 mg/L 부근에서 반응값이 2.34 g으로 최고 반응값을 나타내 었고, pH 4.0, sucrose 1%, nitrogen 750 mg/L 부근에서 1.20g으로 최저 반응값을 나타내었다(Fig. 1). 독립변수 sucrose를 고정하였을 때에는 sucrose 3%일 때 pH 5.
- 1). 독립변수 sucrose를 고정하였을 때에는 sucrose 3%일 때 pH 5.5, nitrogen 50 mg/L 부근에서 2.26g으로 가장 높은 반응값을 나타내었고, sucrose 1%일때 pH 4.0, nitrogen 750 mg/L 부근에서 1.15 g으로 가장 낮은 반응 값을 보였다(Fig. 2). Nitrogen을 고정시켰을 경우 nitro gen 50 mg/L일때 pH 5.
- 같다. 이 결과를 근거로 하여 90% 유의수준에서 유의성이 있는 독립변수 중 상수, Xi항인 pH, X2항인 sucrose, 교호작용을 나타내지 않는 interaction terms 중 sucrose X nitrogen, 동일한 독립변수간의 교호작용을 나타내지 않는 quadratic terms 중 pH, sucrose항을 채택하여 model식 Y= -1.603614 + 0.761822X1+ 0.936974X2-0.067455X12- 0.120444X22-0.000063X2X3를 얻었다. 다중회기분석 전체에 대한 분산분석(Table 3)을 행한 결과 유의수준을 검정하는 F-value도 99.
- 3). 이상에서 알 수 있듯이 nitrogen 농도가 적을수록 생장은 증가하였고, pH와 sucrose 농도는 중간농도에서 최고 생장을 나타내었고, 그 이상이나 이하의 농도에서는 생산이 감소되는 경향을 나타내었다. 최대 생장율을 보이는 각 독립변수의 최적조건은 nitrogen 50 mg/L, phosphate 80.
- 이상에서 알 수 있듯이 nitrogen 농도가 적을수록 생장은 증가하였고, pH와 sucrose 농도는 중간농도에서 최고 생장을 나타내었고, 그 이상이나 이하의 농도에서는 생산이 감소되는 경향을 나타내었다. 최대 생장율을 보이는 각 독립변수의 최적조건은 nitrogen 50 mg/L, phosphate 80.7 mg/L였고, 중간값에서 최대 반응값을 나타내는 pH와 sucrose는 미분하여 pH 5.6, sucrose 3.8%가 최적 조건임을 알아내었다. 이렇게 결정된 최적조건 값 pH 5.
- 식물조직배양기술을 이용하여 인삼 root를 생산하고자, 식물생장조절물질로 유도된 인삼 root를 사용하여 최적액체배양조건을 RSM을 이용하여 조사하였다. 최적액체배양조건을 배지의 pH, sucrose 농도, nitrogen 농도, phosphate 농도의 3 level - 4 factor의 fractional factorial design에 의하여 조사한 결과, 인삼 root의 생장율은 최저 1.00g에서 최고 2.33g까지 나타났다. 다중회귀분석으로 구한 model식을 가지고 등고분석과 3차원분석을 수행한 후 독립변수의 최저 또는 최고수준에서 종속변수가 최대치를 나타내지 않는 배지의 pH와 sucrose농도의 변수에 대하여 model식을 편미분한 결과 인삼 root의 최적액체배양조건은 pH 5.
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