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문제 정의
- 따라서, 본 연구는 세포조직배양법에 의해 인삼을 배양하여 단시간내에 다량의 인삼과 사포닌을 생산하고자" in vitro에서 유도된 인삼 root의 생장과 사포닌생산에 미치는 배지와 생장 조절물질의 영향을 조사하여, 인삼 root의 배양에 적합한 배양조건을 규명하고자 하였다.
제안 방법
- 컬럼은 carbohydrate 컬럼Wters Assoc., Milford, MA, USA; 7.8 mmX300 mm)을 사용하였고 용출용매는 한 등18))의 방법을 변형하여 초기 35분간은 acetonitrile과 water 를 20:80 비율의 isocratic 상태로 사용하였고 그 후는 acetonitrile과 water의 비율이 30:70°] 되도록 gradient elution을 하였다. 진세노사이드 표준품은 한국인삼연초연구원에서 분리한 표준품을 사용하였다.
- 사포닌은 수포화 n-butanol 추출방법16)으로 추출, 분리하였는데, 배양한 인삼 root 1g을 취하여 80% methanols. 3회 추출하여 여과, 농축한 후 ethyl ether를 가해지질 등을 제거한 다음, 물층을 수포화 n-butanol로 4회 추출한 뒤 n- butaimol층을 모아 감압농축시켜 vanillin-H2SO4 비색법17)으로 정량하였다.
- 인삼 root의 생장과 사포닌 생산에 가장 효과적인 배지를 선택하기 위하여 White, SH, half-strength SH, B-5, MS 등 5종의 배지를 사용하여 비교 실험하였다. 각 배지별로 40 mg 배지에 인삼 root 0.6 g(1.5%)씩을 접종하여 1주일 간격으로 4주동안 생장율을 측정하였고, 4주째에 사포닌을 정량하였다. Fig.
- 고려인삼 씨앗의 외피를 제거한 후 70%(v/v) ethanol로 20 초, 4% NaOCl 용액 (v/v)으로 15분간 살균하고, 무균수로 5회 세척한 다음 살균된 여과지(Whatman No. 1)위에 올려놓아 물기를 제거하였다. 캘러스를 유도하기 위해서 외피를 제거한 씨앗에 작은 상처를 낸 후 0.
- 본 실험에서는 인삼 root의 배양에 효과적인 생장조절제를 결정하기 위해 발근에 효과적인 auxin류 중에서 IBA와 NAA 를, 싹유도에 효과적인 cytokinin류 중에서 kinetin과 BAR 그리고 gibberellin중 GA3를 사용하여, 각각을 조합한 뒤 SH 배지에서 비교실험을 하였다. 실험에 사용한 조합으로는 2.
- 사포닌 정량분석에 사용한 방법과 동일하게 사포닌을 추출한 후, HPLC용 methanol에 녹이고 10)1/씩 HPLC(Waters, Model 600 pump, Milford, MA, USA)에 주입하여 분석하 였다. 컬럼은 carbohydrate 컬럼Wters Assoc.
- 식물조직배양기술을 이용하여 사포닌 함량이 높은 인삼 root를 생산하고자, 인삼 root의 성장과 미치는 배지와 식물생장조절물질의 영향을 조사하였다. 인삼 root를 여러 종류의 배지에 배양하였을 때, 인삼 root의 생장과 사포닌 생산은 SH배지에서 가장 우수하였고, SH배지에 배양시, 접종 후 약 10일 후에 생체중량이 초기접종량의 2배가 되었다.
- 0 mg/ LBAP15)의 효과를 측정하였다. 이 조건들 중에서 root 생장 이 가장 좋은 조합을 선택하여 적정농도 결정 실험을 하였다.
- 인삼 root 배양에 알맞은 배지를 선택하기 위해서 MS, SH, half-strength SH, B-5, 12) White^배지 각각에 인삼 root를 0.6 g씩 접종한 후, 7일 간격으로 root의 생장율을 측 정하였고, 4주 배양 후에 사포닌의 패턴과 함량을 측정하였다.
- 1 mg/L kinetin첨가가 효과적이며, 뿌리 형성의 효과적인 성분이 NAA라고 보고한 이와 이19)의 보고와도 비슷한 결과이다. 인삼 root 배양에 적합한 생장조절물질의 조합을 BAP+NAA로 결정한 뒤 이 조합의 적정농도를 결정하기 위해 각 농도별로 적정농도 결정실험을 수행하였다. NAA는 0-6.
- 인삼 root 배양에 적합한 생장조절제를 선택하기 위해 다음의 5가지 생장조절제 조합(2.0 mg/L IBA7) 2.0 mg/L IBA+ 0.1 mg/L Kinetin10) 0.5 mg/L BAP+3.0 mgL NAA11)0.2 mg/L Kinetin+ 2.0 mg/L NAA,14) 1.0 mg/L GA3 +1.0 mg/ LBAP15)의 효과를 측정하였다. 이 조건들 중에서 root 생장 이 가장 좋은 조합을 선택하여 적정농도 결정 실험을 하였다.
- 인삼 root를 살균된 여과지 (Whatman No.l)위에 놓고, 수분을 제거한 뒤 무게를 측정하여 생체중량으로 나타내었다.
- 인삼 root의 생장과 사포닌 생산에 가장 효과적인 배지를 선택하기 위하여 White, SH, half-strength SH, B-5, MS 등 5종의 배지를 사용하여 비교 실험하였다. 각 배지별로 40 mg 배지에 인삼 root 0.
대상 데이터
- Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였고, agar는 Junsei Chemical Co.(Tbkyo, Japan)의 제품을 사용하였으며, chlorox는 유한양행의 제품을 사용하였다. 또한 sucrose, ethanol 등은 특급시약을 사용하였다.
- 고려인삼GZwiac ginseng CA Meyer)의 씨앗은 한국인삼연 초연구원 수원시험장에서 분양받아 사용하였다. 캘러스 유도에 사용한 MS 배지는 Murashige와 Skoog의 방법9)에 따라 각 stock solution을 제조하였고, root 유도에 사용한 SH 배지는 Schenk와 Hilderbrant 방법10))에 따라 stock solution을 특급시약으로 제조한 후 냉장고에 보관하면서 사용하였다.
- 본 실험에서는 인삼 root의 배양에 효과적인 생장조절제를 결정하기 위해 발근에 효과적인 auxin류 중에서 IBA와 NAA 를, 싹유도에 효과적인 cytokinin류 중에서 kinetin과 BAR 그리고 gibberellin중 GA3를 사용하여, 각각을 조합한 뒤 SH 배지에서 비교실험을 하였다. 실험에 사용한 조합으로는 2.0 mg/L IBA,7) 2.0mg/L IBA+0.1 mg/L kinetin,10) 0.5mg/L BAP+3.0 mg/L NAA,11) 0.2 mg/L kinetin+2.0 mg/L NAA, 14)1.0 mg/L GA3+LO mg^L BAP15)이었다. Fig.
- 8 mmX300 mm)을 사용하였고 용출용매는 한 등18))의 방법을 변형하여 초기 35분간은 acetonitrile과 water 를 20:80 비율의 isocratic 상태로 사용하였고 그 후는 acetonitrile과 water의 비율이 30:70°] 되도록 gradient elution을 하였다. 진세노사이드 표준품은 한국인삼연초연구원에서 분리한 표준품을 사용하였다.
이론/모형
- 고려인삼GZwiac ginseng CA Meyer)의 씨앗은 한국인삼연 초연구원 수원시험장에서 분양받아 사용하였다. 캘러스 유도에 사용한 MS 배지는 Murashige와 Skoog의 방법9)에 따라 각 stock solution을 제조하였고, root 유도에 사용한 SH 배지는 Schenk와 Hilderbrant 방법10))에 따라 stock solution을 특급시약으로 제조한 후 냉장고에 보관하면서 사용하였다. 식물생장 조절제인 6-Benzylaminopurine(BAP), 1-Naphthaleneacetic acid(NAA)는 Sigma Chemical Co.
성능/효과
- 1.0 mg/L GA3+LO mg/L BAP조합의 경우 4주 배양 후 무게가 0.99 g으로 1.7배의 생장에 그쳐 가장 낮은 효과를 보였다. 인삼 root의 생장은 0.
- 2는 1주일 간격으로 4주간 인삼 root의 생장율을 측정한 결과로 배지별로 다소 차이는 있으나 모든 배지에서 배양 2주째 생장율이 2배이 상이 되어 배양초기의 dou bling time이 2주 이내라는 것을 알 수 있었다. MS배지를 제외한 모든 배지의 경우 2주째의 무게가 1.32〜L.38 g으로 2.2~2.3배의 성장을 하였으며, MS배지의 경우 doubling time이 가장 느린 것으로 나타났다. 모든 종류의 배지에서 인삼 root는 생장 초기 즉, 배양 1~2주에 급격히 생장하였 고, 3~4주째에는 1~2주에 비해 생장율이 다소 떨어져 전 구간을 통해 볼 때 S자 형태의 생장곡선을 나타내었으며, doubling time은 약 10일정도 되는 것으로 나타났다.
- 인삼 root 배양에 적합한 생장조절물질의 조합을 BAP+NAA로 결정한 뒤 이 조합의 적정농도를 결정하기 위해 각 농도별로 적정농도 결정실험을 수행하였다. NAA는 0-6.0 mg/L, BAP는 0, 0.5로 농도를 변화시켜 실험한 결과, 4.0 mg/L NAA 단독 처리구에서 2.64 g으로 가장 높은 생장율을 나타내었고 0.5 mg/L BAP 단독 처리구에서 0.94 g으로 가장 낮은 생장율을 나타내었다 (Fig. 6). 사포닌함량은 BAP 0.
- 배양에 사용한 배지는 White, SH, half-strength SH, B-5 및 MS로 각 배지별 인삼 root 의 진세노사이드 패턴은 다소 차이가 있었다. SH와 White배 지에서 배양한 root의 경우 총진세노사이드 함량이 0.49%로 가장 높게 나타났고 half-strength SH배지의 경우 0.19%로 가장 낮은 함량을 나타내었으며, SH배지의 경우 Re의 함량이 0.18%로 가장 높았으나 White배지의 경우 R0이 0.23%로 가장 높은 함량을 나타내어 두 배지간에 차이를 나타내었다. 이 결과로 보아 인삼 root의 생장과 사포닌 생산에 있어서 SH배지가 가장 적합한 것으로 사료된다.
- 인삼 root를 여러 종류의 배지에 배양하였을 때, 인삼 root의 생장과 사포닌 생산은 SH배지에서 가장 우수하였고, SH배지에 배양시, 접종 후 약 10일 후에 생체중량이 초기접종량의 2배가 되었다. 각 배지별로 배양한 인삼 root의 진세노사이드 패턴과 함량은 다소 차이가 있었는데, SH배지와 White지에서 성장한 인삼 root의 총진세노사이드 함량이 가장 높았다. 생장조절물질 에 있어서는 4.
- 이 역시 인삼 root 배양에 중요하게 작용되는 것으로 생각된다. 결론적으로 인삼 root 배양에는 nitrate 형태의 질소비가 높고, 비타민이 상대적으로 많은 SH배지가 가장 적합하였다.
- 5). 그러나 생장율을 고려한 총사포닌 함량은 0.5 mgL BAP+3.0 mg/L NAA에서 4.69 mg%로 가장 높은 함량을 나타내었다. Wshikawa와 Furuy/는 인삼모상근 배양에서 2.
- 3배의 성장을 하였으며, MS배지의 경우 doubling time이 가장 느린 것으로 나타났다. 모든 종류의 배지에서 인삼 root는 생장 초기 즉, 배양 1~2주에 급격히 생장하였 고, 3~4주째에는 1~2주에 비해 생장율이 다소 떨어져 전 구간을 통해 볼 때 S자 형태의 생장곡선을 나타내었으며, doubling time은 약 10일정도 되는 것으로 나타났다. Fig.
- 0 mg/L까지 높일수록 효과적이었고, BAP 혼합처리 시 그 효과가 저하됨을 알 수 있었다. 사포닌 생성은 0.5 mg/L BAP 단독처리시 가장 효과적이었고, NAA 농도가 높 아질수록 사포닌함량이 줄어들었다.이는 인삼캘러스 배양에 서 NAA 4.
- 45 g으로 가장 낮았다. 사포닌함 량은 SH배지에서 0.23%로 가장 높았고 half-strength SH배 지에서 0.1%로 가장 낮은 함량을 나타내었으며, 인삼 root의 생장과 사포닌생산을 종합적으로 판단하기 위해 fresh weight와 사포닌함량을 곱한 값인 총사포닌함량 역시 SH배지 에서 4.67 mg%로 가장 높았고, half-strength SH에서 1.90 mg%로 가장 낮았다. 이 결과는 Agrobacterium rhizogenes 에 의해 형질전환된 인삼모상근 배양시 MS배지에서 배양 35일 후에 3배의 성장과 l%(dry wt>의 사포닌함량을 보여 가장 효과적이었다는 황 등6)의 보고와는 차이가 있는 결과이다.
- 6). 사포닌함량은 BAP 0.5 mgl, 단독 처리구에서 0.26%로 가장 높은 사포닌을 생성하였고 6.0 mg/L NAA 단독 처리구에서 0.07%로 가장 낮은 함량을 나타내었다(Fig.7). 생장율과 사포닌함량을 종합한 총사포닌 함량은 NAA 4.
- 7). 생장율과 사포닌함량을 종합한 총사포닌 함량은 NAA 4.0 mg/L 단독 처리구에서 5.59 mg%로 가장 높은 함량을 보였으며 NAA 6.0 mg/L에서 1.81 mg%로 가장 낮은 함량을 나타내었다. 적정농도 결정실험 결과, root의 생장에는 NAA 농도를 4.
- 각 배지별로 배양한 인삼 root의 진세노사이드 패턴과 함량은 다소 차이가 있었는데, SH배지와 White지에서 성장한 인삼 root의 총진세노사이드 함량이 가장 높았다. 생장조절물질 에 있어서는 4.0 mg/L NAA를 함유한 SH배지에서 성장한 인삼 root의 생장이 가장 우수하였고, 사포닌 함량은 0.5 mg/L BAP 처리구에서 가장 높았다. 이러한 결과들은 인삼 root 배양에 의해 사포닌을 단기간에 생산할 수 있는 가능성을 제시하고 있다.
- 23%로 가장 높은 함량을 나타내어 두 배지간에 차이를 나타내었다. 이 결과로 보아 인삼 root의 생장과 사포닌 생산에 있어서 SH배지가 가장 적합한 것으로 사료된다.
- 이에비해 MS배지의 질소원의 형태비는 nitrate: ammonium=2 :1로 SH배지보다 nitrate형태의 질소원의 비율이 상대적으로 낮다. 이상에서 알 수 있듯이 인삼 root 배양은 총질소량의 영향을 받기보다는 고농도의 nitrate 형태의 질소비를 갖는 배지에서 더 효과적이라는 것을 알 수 있다. 또한 SH배지는 다른 배지에 비해 비타민류와 같은 유기영양분의 함량이 높은데, myo-inositol의 경우 다른 배지에 비해 10배나 많은 양이 함유되어 있다.
- 식물조직배양기술을 이용하여 사포닌 함량이 높은 인삼 root를 생산하고자, 인삼 root의 성장과 미치는 배지와 식물생장조절물질의 영향을 조사하였다. 인삼 root를 여러 종류의 배지에 배양하였을 때, 인삼 root의 생장과 사포닌 생산은 SH배지에서 가장 우수하였고, SH배지에 배양시, 접종 후 약 10일 후에 생체중량이 초기접종량의 2배가 되었다. 각 배지별로 배양한 인삼 root의 진세노사이드 패턴과 함량은 다소 차이가 있었는데, SH배지와 White지에서 성장한 인삼 root의 총진세노사이드 함량이 가장 높았다.
- 7배의 생장에 그쳐 가장 낮은 효과를 보였다. 인삼 root의 생장은 0.5 mg/L BAP+3.0 m^L NAA 에서 2.04 g으로 가장 높았고, 사포닌함량은 1.0 mg/L GA3+1.0 mg/L BAP에서 0.28%로 가장 높았다(Fig. 5). 그러나 생장율을 고려한 총사포닌 함량은 0.
- 81 mg%로 가장 낮은 함량을 나타내었다. 적정농도 결정실험 결과, root의 생장에는 NAA 농도를 4.0 mg/L까지 높일수록 효과적이었고, BAP 혼합처리 시 그 효과가 저하됨을 알 수 있었다. 사포닌 생성은 0.
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