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문제 정의
- 본 연구는 Agrobacterium 術zogenes의 감염없이 식물호르몬에 의해 유도된 인삼 root의 사포닌 생산에 배지의 조성이 어떠한 영향을 미치는지를 조사하기 위하여 반응표면 분석법 (Response Surface Methodology : RSM)을 이용하여 인삼 root의 사포닌 생산을 위한 최적배양조건을 선정하였다.
제안 방법
- Stat-graphics 내의 프로그램중 하나인 Central Composite Design(CCD)을 이용하여 3 level-4 factor로 design하여 4주간 인삼 root를 배양한 뒤, 생산된 사포닌 함량을 종속변수 로 하여 측정한 결과는 Table 1과 같다. pH 7.
- Stat-graphics(STSC Inc. Rockville, MD, USA)내의 central composite design(CCD) program을 이용하여 root 배양배지의 조건인 pH, sucrose 농도, nitrogen 농도, phosphate 농도 등을 독립변수로 3 level-4 factor의 fractional factorial block을 정하였다(Table 1). 배지의 초기 pH는 최대 7.
- 6 g씩을 100 mL flask에 접종하고 25℃ 암조건 흐}에서 60 rpm으로 4주간 진탕배양한 뒤 사포닌함량을 측정하였다. Total saponine 수포화 n-butanol 추출방법11)으로 추출, 분리하였는데, 배양 한 인삼 root 1g을 취하여 80% methanol로 3회 추출하여 여과, 농축한 후 ethyl ether를 가해 지질 등을 제거한 다음, 물층을 수포화 n-butanol로 4회 추출한 뒤 w-butanol 층을 모아 감압농축시켜 vanillin-H2SO4 비색법12)으로 정량하였다.
- Rockville, MD, USA)내의 central composite design(CCD) program을 이용하여 root 배양배지의 조건인 pH, sucrose 농도, nitrogen 농도, phosphate 농도 등을 독립변수로 3 level-4 factor의 fractional factorial block을 정하였다(Table 1). 배지의 초기 pH는 최대 7.0, 최소 4.0, 중간값 5.5로 맞추었으며, sucrose 농도는 최대 5%, 최소 1%, 중간값으로 3% 되게끔 첨가하였고, nitrogen 농도는 최고 750 mg/L, 최소 50 mg/L, 중간값으로 400 mg/L 첨가하였으며, phosphate 농도는 SH배지의 phosphate 농도를 기준으로 하여, 최고 5/3배, 최소 1/3배, 중간값 1배가 되도록 각각 독립변수의 level을 설정하였다. 배지는 SH배지를 기본으로 하고, growth regulator로 0.
- 식물 조직배양기술을 이용하여 인삼의 주요약리성분인 사포닌을 생산하고자, 식물생장조절물질로 유도된 인삼 root를 사용하여 사포닌 생산을 위한 최적액체배양조건을 RSM으로 조 사하였다. 최적액체배양조건을 배지의 pH, sucrose 농도, nitrogen 농도, phosphate 농도의 3 level-4 factor의 fractional factorial design에 의하여 조사한 결과, 인삼 root의 t 사포닌 함량은 최저 0.
대상 데이터
- 고려인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)의 씨앗은 한국인삼 연초연구원 수원경 작시험 장에서 분양받아 사용하였고, 배지와 growth regulator 및 시약은 모두 전보10)와 동일하게 사용하였다.
데이터처리
- 측정한 사포닌함량을 종속변수로 설정한 후 각 독립변수들 간의 관계를 SAS(SAS Institute Inc. Cary, NC, USA)로 다중회기분석 및 분산분석을 실시한 후 유의성이 인정되는 변수만을 채택하여 각 종속변수에 해당하는 model식을 설정하고 이를 RSM에 의하여 등고분석과 3차원 분석을 실시하여 최적조건을 설정하였다.
성능/효과
- Stat-graphics 내의 프로그램중 하나인 Central Composite Design(CCD)을 이용하여 3 level-4 factor로 design하여 4주간 인삼 root를 배양한 뒤, 생산된 사포닌 함량을 종속변수 로 하여 측정한 결과는 Table 1과 같다. pH 7.0, sucrose 5%, nitrogen 50 mg/L, phosphate 134.5 mg/L에서 0.303%로 최대함량을 나타내었고, pH 4.0, sucrose 1%, nitrogen 750 mg/L, phosphate 26.9 mg/L에서 0.174%로 최소 함량을 나타내었다. pH 7.
- 303%까지 나타났다. 다중회귀분석으로 구한 model식을 가지고 등고분석과 3차원 분석을 수행한 후 독립변수의 최저 또는 최고수준에서 종속 변수가 최대치를 나타내지 않는 phosphate농도 변수에 대하여 model식을 편미분한 결과 인삼 root의 사포닌 함량이 최고치를 나타내는 액체배양조건은 pH 5.5, sucrose 5%, nitrogen 50 mg/L, phosphate 93 mg/L로 예측되었다. 이렇게 결정된 조건값들을 model식에 대입하여 얻은 예상치는 0.
- 000011X42> 얻었다. 다중회기분석 전체에 대한 분산분석(Table 3)을 행한 결과 유의수준을 검정하는 F-value가 99% 수준에서 유의성을 나타내어 다중회기분석에 의하여 선정된 각 변수에 의해 설정된 model식이 99% 수준에서 유의성이 있었음을 알 수 있었다. 위에서 얻은 model식에 대한 반응표면분석법을 수행하여 Fig.
- 1). 독립변수 nitrogen을 고정하였을 때에는 nitrogen 50 mg/L일때 sucrose 5%, phosphate 99 mg/L 부근에서 0.302%로 가장 높은 사포닌 함량을 나타내었고, nitrogen 750 mg/L일때 sucrose 1%, phosphate 27 mg/L 부근에서 0.197%로 가장 낮은 함량을 보였다(Fig. 2). Phos-phate를 고정시켰을 경우 phosphate 80.
- 1undefined~undefined3과 같은 결과를 얻었다. 독립변수 sucrose 농도를 고정시켜 분석한 결과 sucrose 5%일 때, nitrogen 50 mg/L, phosphate 90 mg/L 부근에서 반응값이 0.306%로 최고 반응값을 나타내었고, sucrose 1%, nitrogen 750 mg/L, phosphate 27 mg/L 부근에서 0.198%로 최저 반응값을 나타내었다(Fig. 1). 독립변수 nitrogen을 고정하였을 때에는 nitrogen 50 mg/L일때 sucrose 5%, phosphate 99 mg/L 부근에서 0.
- 인삼 root 배양에서 사포닌 생산의 최적조건을 결정하기 위하여 배지내 pH, sucrose농도, nitrogen농도, phosphate농도의 4가지 factor# 독립변수로 설정하고, vanillin-leSQ법 (2) 으로 정량한 사포닌 함량을 종속변수 Y로 설정하여 다중회 기분석을 수행한 결과는 Table 2와 같다. 이 결과를 근거로 하여 90% 유의수준에서 유의성이 있는 독립변수 중 상수, X3 항인 nitrogen, X4 항인 phosphate, quadratic terms 중 sucrose, phosphate항을 채택하여 model식 Y=0.167488- 0.000035X3+0.002068X4+0.001812X22-0.000011X42> 얻었다. 다중회기분석 전체에 대한 분산분석(Table 3)을 행한 결과 유의수준을 검정하는 F-value가 99% 수준에서 유의성을 나타내어 다중회기분석에 의하여 선정된 각 변수에 의해 설정된 model식이 99% 수준에서 유의성이 있었음을 알 수 있었다.
- 이상에서 알 수 있듯이 nitrogen 농도가 적을수록 사포닌 함량이 증가하였고, sucrose 농도는 증가할수록 사포닌 함량이 증가하였다. 이를 전보3)에서 보고한 인삼 root의 최적생장조건과 비교해보면, nitrogen의 농도가 낮을수록 생장율이 증가하고 pH와 phosphate농도는 중간농도에서 최고 생장을 나타내어 사포닌생산을 위한 배양 조건과 동일하며, sucrose농도에 있 어서는 중간농도에서 생장율이 가장 높고, 사포닌 생산은 sucrose농도가 높을수록 왕성해지므로 다소 차이가 있으나 전체적으로 인삼 root의 생장과 사포닌 생산이 서로 상관관계가 있음을 알 수 있었다. 최대 사포닌 함량을 나타내는 각 독립변수의 최적조건은 pH 5.
- 3). 이상에서 알 수 있듯이 nitrogen 농도가 적을수록 사포닌 함량이 증가하였고, sucrose 농도는 증가할수록 사포닌 함량이 증가하였다. 이를 전보3)에서 보고한 인삼 root의 최적생장조건과 비교해보면, nitrogen의 농도가 낮을수록 생장율이 증가하고 pH와 phosphate농도는 중간농도에서 최고 생장을 나타내어 사포닌생산을 위한 배양 조건과 동일하며, sucrose농도에 있 어서는 중간농도에서 생장율이 가장 높고, 사포닌 생산은 sucrose농도가 높을수록 왕성해지므로 다소 차이가 있으나 전체적으로 인삼 root의 생장과 사포닌 생산이 서로 상관관계가 있음을 알 수 있었다.
- 이를 전보3)에서 보고한 인삼 root의 최적생장조건과 비교해보면, nitrogen의 농도가 낮을수록 생장율이 증가하고 pH와 phosphate농도는 중간농도에서 최고 생장을 나타내어 사포닌생산을 위한 배양 조건과 동일하며, sucrose농도에 있 어서는 중간농도에서 생장율이 가장 높고, 사포닌 생산은 sucrose농도가 높을수록 왕성해지므로 다소 차이가 있으나 전체적으로 인삼 root의 생장과 사포닌 생산이 서로 상관관계가 있음을 알 수 있었다. 최대 사포닌 함량을 나타내는 각 독립변수의 최적조건은 pH 5.5, sucrose 5%, nitrogen 50 mg/L였고, 중간값에서 최대 반응값을 나타내는 phosphate는 model식을 편미분하여 93 mg/L가 최적 조건임을 알아내었다. 이렇게 결정된 최적 조건값 pH 5.
- 식물 조직배양기술을 이용하여 인삼의 주요약리성분인 사포닌을 생산하고자, 식물생장조절물질로 유도된 인삼 root를 사용하여 사포닌 생산을 위한 최적액체배양조건을 RSM으로 조 사하였다. 최적액체배양조건을 배지의 pH, sucrose 농도, nitrogen 농도, phosphate 농도의 3 level-4 factor의 fractional factorial design에 의하여 조사한 결과, 인삼 root의 t 사포닌 함량은 최저 0.174%에서 최고 0.303%까지 나타났다. 다중회귀분석으로 구한 model식을 가지고 등고분석과 3차원 분석을 수행한 후 독립변수의 최저 또는 최고수준에서 종속 변수가 최대치를 나타내지 않는 phosphate농도 변수에 대하여 model식을 편미분한 결과 인삼 root의 사포닌 함량이 최고치를 나타내는 액체배양조건은 pH 5.
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