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문제 정의
- 본 연구에서는 인산 이용효율이 높은 벼 계통 선발을 위해 담배의 인산수송자 유전자를 벼에 도입하였다.
제안 방법
- 025 g/L FeSO47H2O,5 g/L glucose) 액체배지에서 28℃, 암상태에서 72시간 동안 진탕배양 (250 rpm)하였다. Agrobacterium 배양액을 원심분리 하여 수확한 후 100 pM acetosyringone 이 첨가된 AAM (75 mg/L glycine, 877 mg/L glutamine, 266 mg/L aspartic acid, 50 mg/L casamino acid, 65.5 g/L sucrose, 35 g/L glucose, NH4NO3와 KNO3를 제외하고 2.74 g/L KCI이 첨가된 MS 기본배지, pH 5.2) 액체배지에 10배 희석하여 전 배양한 callus를 30분간 접종하였다. Agrobacteriume 접종한callus100 (M acetosyringone, 2 mg/L 2, 4-D, 10 g/Lucose가 첨가된 N6 배지에 치상하여 21℃, 암상태에서 3일간 배양하였다.
- 전이시켰다. Dig-High Prime Labeling kit (Boenringer Mannheim, Germany)를 이용하여 표지된 담배의 인산 수송자 유전자 탐침과 Dig Nucleic Acid Detection kit (Boenringer Mannheim, Germany)를 이용하여 Southern 분석을 수행하였다
- 2001). 분리한 PT 유전자를 포항공대에서 분양받은 ubiquitin promoter를 갖는 pGA 1611 vector에 재조합하여 (Figure 1) freezing-thawing 방법을 이용하여 A. tumefaciens LBA 4404에 도입하였다 (An et al. 1988).
- 선발된 재분화 벼 식물체에 대한 PCR분석을 통하여 담배 PT 유전자의 삽입여부를 확인하였다. Hong 등 (1993)의 방법에 따라 추출한 벼 genomic DNA와 담배의 인산수송자 유전자 특이적 정방향 primer (5' -TGAGAAAGCTTAGTC ATGGC-3')와 역방향 primer (5"-ACACGAATTCA CAAAACTGC-3X 사용하여 PCR을 실시하였다.
- 5mg/L BA가 첨가된 N6 배지에 옮긴 후 25℃, 암상태에서 배양하였다. 선발배지에서 증식된 callus를 250 mg/Lcarbenicillin, 2 mg/L kinetin, 0.1 mg/L NAA, 20 g/L sorbitol, 50 g/L sucrose가 첨가된 MS (Murashige andSkoog 1962) 재분화 배지에 치상하고 25℃, 연속조명 조건에서 배양하였다. 재분화 배지에서 분화된 식물체를 MS 기본 배지에 옮겨 뿌리를 유도하고, 얻어진 식물체를 pot에 이식하여온 실에서 순화시킨 후 특성을 검정하였다.
- 성숙종자의 영을 제거하고 2% sodium hypochlorite (100 pl Tween 20 첨가)에 50분간 교반하여 표면살균하였으며, 멸균수로 5회 세척한 후 2 mg/L 2, 4-D가 첨가된 N6 (Chu et al. 1975) callus 유도 배지에 15립씩 치상하였다. 25℃, 암조건에서 4주간 배양한 후 단단하면서도 잘 부스러지는 callus를 분리하여 clus 유도배지에 옮겨 3일간 25C, 암조건에서 전 배양하였다.
- 1 mg/L NAA, 20 g/L sorbitol, 50 g/L sucrose가 첨가된 MS (Murashige andSkoog 1962) 재분화 배지에 치상하고 25℃, 연속조명 조건에서 배양하였다. 재분화 배지에서 분화된 식물체를 MS 기본 배지에 옮겨 뿌리를 유도하고, 얻어진 식물체를 pot에 이식하여온 실에서 순화시킨 후 특성을 검정하였다.
- 재분화된 유식물체 내로의 인산수송자 유전자 삽입 여부를 확인하기 위해 genomic DNA를 추출하고 담배의 인산 수송자 유전자 특이적인 primer 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과, 모든 형질전환 식물체에서 예상되는 크기의 1.
대상 데이터
- 농촌진흥청 호남농업 시험장에서 분양받은 동진벼를 실험에 사용하였다.
- 담배 의 인산수송자 유전자가 도입 된 A. tumefaciens LB A 4404와 공동배양한 벼의 callus를 약 3주간 배양하였다. 그 결과 많은 callus에서 증식이 억제되고 갈변화하는 증상을 보였으나, 일부 callus는 왕성하게 증식하거나 또는 갈변된 callus의 일부 세포로부터 callus가 출현하여 빠른 속도로 증식 하였다.
- 실험에 사용된 담배의 고친화도 인산수송자 (phosphate transporter, PT) 유전자는 감자의 인산수송자 유전자를 탐침으로 이용하여 담배의 cDNA library로부터 분리하였다 (Baek et al. 2001). 분리한 PT 유전자를 포항공대에서 분양받은 ubiquitin promoter를 갖는 pGA 1611 vector에 재조합하여 (Figure 1) freezing-thawing 방법을 이용하여 A.
이론/모형
- 유전자의 삽입여부를 확인하였다. Hong 등 (1993)의 방법에 따라 추출한 벼 genomic DNA와 담배의 인산수송자 유전자 특이적 정방향 primer (5' -TGAGAAAGCTTAGTC ATGGC-3')와 역방향 primer (5"-ACACGAATTCA CAAAACTGC-3X 사용하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응액 25 pl의 조성은 10 mM Tris-HCl, pH 8.
- PCR을 통하여 형질전환 식물체의 genomic DNA로 부터 증폭한 DNA 단편을 1% agarose gel에서 전기영동한 후, capillary transfer 방법 (Southern 1975)을 이용하여 나일론 막에 전이시켰다. Dig-High Prime Labeling kit (Boenringer Mannheim, Germany)를 이용하여 표지된 담배의 인산 수송자 유전자 탐침과 Dig Nucleic Acid Detection kit (Boenringer Mannheim, Germany)를 이용하여 Southern 분석을 수행하였다
성능/효과
- tumefaciens LB A 4404와 공동배양한 벼의 callus를 약 3주간 배양하였다. 그 결과 많은 callus에서 증식이 억제되고 갈변화하는 증상을 보였으나, 일부 callus는 왕성하게 증식하거나 또는 갈변된 callus의 일부 세포로부터 callus가 출현하여 빠른 속도로 증식 하였다.
- 그 결과, 모든 형질전환 식물체에서 예상되는 크기의 1.7 kb 단편이 증폭되었지만, 대조 식물체에서는 아무런 band도 출현하지 않았다 (Figure 4A). Lane 1은 인산수송자 유전자가 재조합된 binary vector에서 증폭된 단편이며, lane 3, 4, 5, 6, 7은 형질전환한 벼로부터 증폭된 DNA 단편이다.
- 담배의 인산수송자 유전자를 탐침으로 사용하여 PCR 증폭DNA 단편에 대한 Southern blot 분석을 실시한 결과 pGA- PT 재조합 DNA나 형질전환 식물체 모두에서 1.7 kb의 band 가 검출되었다 (Figure 4B). 이것은 선발된 식물체에 담배의 인산 수송자 유전자가 안정적으로 도입되었음을 나타내는 결과이다.
후속연구
- 따라서 본 연구 결과 얻은 인산수송자 형질전환 벼 계통은 인산 흡수 효율이 높은 벼 품종의 개발에 활용할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 인산수송자 유전자는 오염된 내륙수의 정화에 이용 가능한 식물종 개발에도 활용할 수 있을 것으로 생각된다.
- 기대된다. 또한 인산수송자 유전자는 오염된 내륙수의 정화에 이용 가능한 식물종 개발에도 활용할 수 있을 것으로 생각된다.
- 이것은 인산 수송자의 발현에 따른 인산 과다 흡수에 의한 길항작용으로 K, Fe, Zn, Cu 등의 결핍에 따른 증상이 아닌가 사료되나 이에 대한 추후 연구가 필요하리라 생각된다.
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