옥수수수염에 함유되어 있는 maysin 및 유사 flavonoid 물질의 분리 및 정제법을 확립하여 신품종 육성의 기초적인 자료를 제공하고자 본 시험을 수행하였으며 얻어진 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. Preparative $C_{18}$ 컬럼에서 10% MeOH에 용출된 물질은 neochlorogenic acid, chlorogenic acid 및 4-caffeoylquinic acid였으며 30% MeOH로 용출된 물질은 rhamnosyl isoorientin이었고 maysin은 50%의 MeOH에서 용출되었다. 2. Silicic acid 컬럼으로 maysin 조추출물의 1차 정제시 100% ethyl acetate 500$m\ell$로 컬럼에 흡착되어 있는 maysin을 용출시켰으며, 이때 수거된 maysin의 순도는 75% 이상에 해당하였고, $C_{18}$ 컬럼($\frac{1}{2}$$\times$43")으로 maysin의 2차 정제시 maysin의 순도는 95% 이상에 달하였다. 3. FAB-MS에 의한 maysin의 분자량은 577M＋H m/z이고, fragmentation으로 보아 431M＋H m/z은 rhamnose에 해당하였고, $^1$H 및 $^{13}$C NMR에 의한 spectrum을 확인한 결과 분리한 물질이 maysin임을 확인할 수 있었다. 있었다.
옥수수수염에 함유되어 있는 maysin 및 유사 flavonoid 물질의 분리 및 정제법을 확립하여 신품종 육성의 기초적인 자료를 제공하고자 본 시험을 수행하였으며 얻어진 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. Preparative $C_{18}$ 컬럼에서 10% MeOH에 용출된 물질은 neochlorogenic acid, chlorogenic acid 및 4-caffeoylquinic acid였으며 30% MeOH로 용출된 물질은 rhamnosyl isoorientin이었고 maysin은 50%의 MeOH에서 용출되었다. 2. Silicic acid 컬럼으로 maysin 조추출물의 1차 정제시 100% ethyl acetate 500$m\ell$로 컬럼에 흡착되어 있는 maysin을 용출시켰으며, 이때 수거된 maysin의 순도는 75% 이상에 해당하였고, $C_{18}$ 컬럼($\frac{1}{2}$$\times$43")으로 maysin의 2차 정제시 maysin의 순도는 95% 이상에 달하였다. 3. FAB-MS에 의한 maysin의 분자량은 577M＋H m/z이고, fragmentation으로 보아 431M＋H m/z은 rhamnose에 해당하였고, $^1$H 및 $^{13}$C NMR에 의한 spectrum을 확인한 결과 분리한 물질이 maysin임을 확인할 수 있었다. 있었다.
This study was carried out to isolate and identify the maysin and related flavonoid analogues in corn silks. Silks were covered with silk bag to prevent pollination and were sampled at 3-5 days after silking. The silks were filled with 100% MeOH and stored at $0^{\circ}C$ until analysis. ...
This study was carried out to isolate and identify the maysin and related flavonoid analogues in corn silks. Silks were covered with silk bag to prevent pollination and were sampled at 3-5 days after silking. The silks were filled with 100% MeOH and stored at $0^{\circ}C$ until analysis. The MeOH extracts of corn silks were filtered and concentrated at 35-4$0^{\circ}C$. The ${CH}_2$${Cl}_2$ was added on the concentrated aqueous solution to remove the chlorophyll and lipids. The Cis open column (25mm$\times$54 cm) was washed and activated with serial treatment of 500$m\ell$ of 100% MeOH(twice)longrightarrow75% MeOH longrightarrow50% MeOHlongrightarrow30% MeOHlongrightarrow100% $H_2$O(2 times). The concentrated aqueous solution was applied to the $C_{18}$ column and washed with $H_2O$ several times to remove the sugars and water soluble pigments. Neochlorogenic acid, chlorogenic acid and 4-caffeoylquinic acid were eluted with 10% MeOH, and rhamosyl isoorientin was eluted with 30% MeOH, but maysin was eluted with 50% MeOH from the $C_18$ open column. Collected fractions were analyzed with HPLC by using revers-phase Ultras-phere $C_{18}$ column (4.6$\times$250mm, 5$\mu\textrm{m}$) and $H_2$O (10% MeOH containing 0.1% $H_3$${PO}_4$)/MeOH (100% MeOH containing 0.1% H$_3$PO$_4$) linear gradient from 20% to 90% MeOH for 35 minutes, a flow rate of 1 $m\ell$/min and detection at 340nm. The selected fractions were concentrated and applied to the silicic acid column. Maysin was eluted with 500$m\ell$ of 100% ethyl acetate from the silicic acid column for the first purification, and the purity of collected fractions was about 75%, but the purity from the second purification with the Cis column (1/2 $\times$ 43") was greater than 95%. FAB-MS spectral data was obtained with VG7O-VSEQ VG analytical fast atom bombardment mass (UK). $^1$H-NMR and $^{13}$ C-NMR data were obtained with Bruker DPX 400 MHz NMR spectrometers (German) in DMSO-d$_{6}$ at 400 and 100 MHz, respectively.vely.
This study was carried out to isolate and identify the maysin and related flavonoid analogues in corn silks. Silks were covered with silk bag to prevent pollination and were sampled at 3-5 days after silking. The silks were filled with 100% MeOH and stored at $0^{\circ}C$ until analysis. The MeOH extracts of corn silks were filtered and concentrated at 35-4$0^{\circ}C$. The ${CH}_2$${Cl}_2$ was added on the concentrated aqueous solution to remove the chlorophyll and lipids. The Cis open column (25mm$\times$54 cm) was washed and activated with serial treatment of 500$m\ell$ of 100% MeOH(twice)longrightarrow75% MeOH longrightarrow50% MeOHlongrightarrow30% MeOHlongrightarrow100% $H_2$O(2 times). The concentrated aqueous solution was applied to the $C_{18}$ column and washed with $H_2O$ several times to remove the sugars and water soluble pigments. Neochlorogenic acid, chlorogenic acid and 4-caffeoylquinic acid were eluted with 10% MeOH, and rhamosyl isoorientin was eluted with 30% MeOH, but maysin was eluted with 50% MeOH from the $C_18$ open column. Collected fractions were analyzed with HPLC by using revers-phase Ultras-phere $C_{18}$ column (4.6$\times$250mm, 5$\mu\textrm{m}$) and $H_2$O (10% MeOH containing 0.1% $H_3$${PO}_4$)/MeOH (100% MeOH containing 0.1% H$_3$PO$_4$) linear gradient from 20% to 90% MeOH for 35 minutes, a flow rate of 1 $m\ell$/min and detection at 340nm. The selected fractions were concentrated and applied to the silicic acid column. Maysin was eluted with 500$m\ell$ of 100% ethyl acetate from the silicic acid column for the first purification, and the purity of collected fractions was about 75%, but the purity from the second purification with the Cis column (1/2 $\times$ 43") was greater than 95%. FAB-MS spectral data was obtained with VG7O-VSEQ VG analytical fast atom bombardment mass (UK). $^1$H-NMR and $^{13}$ C-NMR data were obtained with Bruker DPX 400 MHz NMR spectrometers (German) in DMSO-d$_{6}$ at 400 and 100 MHz, respectively.vely.
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문제 정의
따라서 옥수수 수염에서 P1의 발현을 증가시키고, 그 밖의 관련 유전자를 밝혀 이를 조절할 수만 있다면 maysin의 양을 증가시킬 수 있을 것으로 평가되고있다. 본 시험은 옥수수 수염에 함유된 maysin 및 그 유사물질을 동정하고 이들의 분리 및 정제법을 확립하여 내충성 신품종 육성의 기초자료를 제공하고자 실시하였다.
옥수수수염에 함유되어 있는 maysin 및 유사 flavonoid 물질의 분리 및 정제법을 확립하여 신품종 육성의 기초적인 자료를 제공하고자 본 시험을 수행하였으며 얻어진 결과를 요약하면 다음과 같다.
제안 방법
2차 정제로부터 얻어진 maysin의 화학구조 확인을 위하여 FAB-MS에 의한 분자량의 측정과(Fig. 5) 1H 및 13C NMR를 이용하여 spectrum(Fig. 6)을 얻고 이들의 aglycone 및 결합 당의 탄소, 수소의 결합상태를 확인한 결과는 Table 2에서 보는 바와 같다.
Preparative C18 컬럼에 의해 얻어진 maysin의 조추출물은 순도를 확인한 결과 다량의 불순물이 함유되어 있었기 때문에 maysin의 정제를 위해 조추출물을 silicic acid 컬럼에 적재하여 methylene chloride와 ethyl acetate(50:50, v/v) 용액으로 세척하여 남아있는 색소를 최종적으로 제거한 후 100% ethyl acetate로 column에 흡착되어 있는 maysin을 용출시켰다. Fig.
3은 silicic acid 컬럼에 의하여 1차 정제된 물질을 maysin의 표준물질과 비교한 HPLC chromatogram을 나타낸 것이다. Silicic acid 컬럼에 의하여 정제된 maysin(Fig. 3의 점선)의 순도는 최대 85% 수준에 달하였으나 표준물질(실선)에 비하여 미지의 물질들을 함유하고 있었으므로 수거된 fraction 중 maysin의 순도가 75% 이상 되는 fraction들을 혼합, 농축하여 2차 정제하였다.
그 후 methylene chloride : ethyl acetate(50:50)의 용액 500ml로 세척하여 남아있는 색소를 최종적으로 제거하였다. 그 후 100% ethyl acetate 500ml로 컬럼에 흡착되어 있는 물질을 용출시켰으며 수거된 각 fraction을 HPLC로 확인하여 순도가 높은 fraction들을 혼합, 농축하였다. 그후 silicic acid 컬럼으로 조추출물의 1차 정제 시 maysin 이외에도 다량의 불순물이 함유되어 있었기 때문에 C18 컬럼(1/2X43”)으로 maysin을 2차 정제하였다.
분리한 maysin의 구조 해석을 위하여 FAB-MS(VG70- VSEQ VG Analytical, UK)에 의한 분자량의 측정과 핵자기공명 (Bruker DPX 400 MHz NMR, German)에 의한 구조의 확인은 분리된 maysin을 DMSO-d6에 용해하여 1H-NMR은 400MHz에서 13C-NMR은 100MHz로 측정하였다.
옥수수에서 maysin 및 그 유사물질의 분리를 위하여 사용된 옥수수의 수염은 미국 Georgia주 Tifton에 위치한 Coastal Plain Experiment Station의 Insect Biology and Population Management Research Center의 시험포장에 자식계통인 T97 및 T281(Tifton, GA)을 파종하여 silk bag으로 자연수분을 인위적으로 차단시켰고 출사 후 3~5일이 경과된 수염을 약 30g 씩 채취하여 250ml의 시료병에 넣고 100%의 MeOH 180ml를 가하였으며 분석이 이루어지기 전까지 Georgia주 Athens의 Russell Research Center(USDA-ARS)에서 이의 저온저장고에 약 1주일간 보관하였다.
가하여 농축하였다. 이때 농축관의 넘침현상을 방지하기 위하여 농축관의 회전속도를 낮게 조절하였고, 농축이 완료될 무렵에는 회전속도를 더욱 감소시키고 압력을 증가시켰으며 때때로 농축관을 가볍게 두들겨 줌으로서 silicic acid가 농축관 기벽에 달라붙지 않도록 하였다. 농축이 진행됨에 따라 조추출물은 진갈색~연노란색으로 변화되며 이때 적당량의 CH3CN을 첨가한 후 농축하여 조추출물의 silicic acid coating을 마쳤다.
농축이 진행됨에 따라 조추출물은 진갈색~연노란색으로 변화되며 이때 적당량의 CH3CN을 첨가한 후 농축하여 조추출물의 silicic acid coating을 마쳤다. 조추출물의 정제를 위한 silicic acid 컬럼의 충진은 N2 기류에서 methylene chloride 250ml로 컬럼을 세척하여 충진물을 활성한 후 silicic acid로 코팅된 maysin 의 조주줄물을 적재하였다. 그 후 methylene chloride : ethyl acetate(50:50)의 용액 500ml로 세척하여 남아있는 색소를 최종적으로 제거하였다.
컬럼은 Ci8(Preparative C18 125Å Bulk Packing Material 55-105 ㎛, WATERS, U.S.A.)을 Fisher FP 컬럼(25mm X54cm)에 충진하고, N2의 기류에서 500ML의 100% MeOH (2회)→75% MeOH(1회)→50% MeOH(1회)→30% MeOH(1 회)→ 100% H2O(2회)처리하여 컬럼을 활성화하였다. 활성화된 컬럼에 methylene chloride가 제거된 slurry 상태의 농축시료를 적재하고 초순수로 여러번 세척하여 당 및 각종 수용성 물질을 제거하였고, 10~40% MeOH로 농도를 10% 씩 증가시키면서 컬럼을 세척하여 색소를 제거한 후 50% MeOH로 컬럼에 흡착된 물질을 용출시켜 125ml씩 fraction을 수거하였다.
)을 Fisher FP 컬럼(25mm X54cm)에 충진하고, N2의 기류에서 500ML의 100% MeOH (2회)→75% MeOH(1회)→50% MeOH(1회)→30% MeOH(1 회)→ 100% H2O(2회)처리하여 컬럼을 활성화하였다. 활성화된 컬럼에 methylene chloride가 제거된 slurry 상태의 농축시료를 적재하고 초순수로 여러번 세척하여 당 및 각종 수용성 물질을 제거하였고, 10~40% MeOH로 농도를 10% 씩 증가시키면서 컬럼을 세척하여 색소를 제거한 후 50% MeOH로 컬럼에 흡착된 물질을 용출시켜 125ml씩 fraction을 수거하였다. 각 fraction은 HPLC(Table 1)로 확인하여 maysin을 높게 함유하고 있을 것으로 판단되는 fraction들을 선택, 혼합하여 농축하였다.
성능/효과
2. Silicic acid 컬럼으로 maysin 조추출물의 1차 정제시 100% ethyl acetate 500ml로 컬럼에 흡착되어 있는 maysin을 용출시켰으며, 이때 수거된 maysin의 순도는 75% 이상에 해당하였고,C18컬럼(1/2X43")으로 maysin의 2차 정제시 maysin의 순도는 95% 이상에 달하였다.
(1980) 및 Snook et al.(1989)에 의해 보고된 결과와 일치되었으며, 본 시험에 의하여 옥수수 수염으로부터 maysin의 분리 및 정제는 매우 효율적인 방법임을 확인 할 수 있었다.
1. Preparative C18 컬럼에서 10% MeOH에 용출된 물질은 neochlorogenic acid, chlorogenic acid 및 4-caffeoylquinic acid였으며 30% MeOH로 용출된 물질은 rhamnosyl isoorientin이었고 maysin은 50%의 MeOH에서 용출되었다.
3. FAB-MS에 의한 maysin의 분자량은 577M+H m/z이고, fragmentation으로 보아 431M+H m/z은 rhamnose에 해당하였고,1H및 13C NMR에 의한 spectrum을 확인한 결과 분리한 물질이 maysin임을 확인할 수 있었다.
FAB-MS에 의한 maysin의 분자량은 577M+H m/z이고, fragmentation으로 보아 431M+H m/z은 rhamnose에 해당됨을 알 수 있었다. NMR에 의한 maysin의 화학구조는 Elliger et al.
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