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문제 정의
- 혹은 1997년까지는 면역계획이 12개월 이후 아동들에게 한번 면역하는 것으로 되어 있었기에 (6, 10, 16, 29, 32) 항체가가 낮아져 방어력의 약화로 유행성이 하선염 질환에 걸 릴 수도 있다. 따라서 이 가능성과 관련하여 본 연구에서는 국내에서 유행하는 유행성 이하선염 바이러스를 분리하여 백신주와의 혈청학적 비교 및 유전자형 분석을 통해 변이도를 알아보고자 수행하였다.
제안 방법
- 34℃, 5% CO2 배양기에서 7일간 배양하면서 세포병변 (cytopathic effect; cpe)이 나타나는지 를 관찰한 후 3회 맹검계계대배양 (blind passage)을 실시하여 최종적으로 세포병변이 관찰된 가검물만을 수확하였다.
- ABI PRISM™ Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin Elmer, US A) 를 사용하여 제조사의 지침대로 반응액 20 pl당 Terminator Ready Reaction Mix 80 jll, 1 |1M primer 3와 30 -------ng template을 첨가하고 termal cycler로 25회 주기로 증폭하였다. 또한 결정된 염기서 열 결과를 DNASTAR (Madison, WI, USA) 프로그램을 이용하여 결정된 염기서열을 비교 분석하였으며, deduced 아미노산 염기도 결정하고 이를 비교 분석하였다 (4, 9, 18).
- 0%의 guinea pig erythrocyte 용액 50 R1 를 넣고 상온에서 30분간 반응시킨 후 바 이 러스의 HAI 역가를 결정하였다 (5, 22). PBS를 음성 대조액으로 사용하여 최초 응집이 일어나는 희석 배수에서 음성대조액과 비교하여 반응집이 일어나는 경우는 희석 단계의 중간값을 HAI 역가로 결정 하였다.
- 각각의 바이러스에 대한 마우스 항혈청은 RDE (Receptor Destroying Enzyme, Denka Seiken, Japan, 420 302)을 1:3의 비율로 혼합하고 371) 항온수조 에서 18시간 반응시킨 후, 56P에서 1시간 열처리하여 RDE를 불활성화시키고 사용하였다.
- 각각의 분리 증식되 어진 유행성 이하선염 바이러 스의 150 ㎕를 취하여 QIAamp Viral RNA Kit (QIAGEN, USA, 29504)를 이용하여 각 바이러스당 최 종적으로 50 |11의 genomic RNA를 분리 하였다. 분리된 2의 genomic RNA를 random hexamer (Gibco BRL, USA, 18418-012)4 cDNA Synthesis Kit (TaKaRa, Japan, 6120)를 이용하여 20의 cDNA를 합성하였다.
- 세포병변이 나타난 바이러스 배양액과 anti-mumps serum을 동량으로 혼합하여 암실조건 4P 에서 2시간 동안 충분히 중화반응을 시킨 후 Vero 세포 (2X105 cells/ml)와 동량으로 혼합하여 접종하였다. 그 중 세포병변이 나타나지 않은 바이러스 배양액을 유행성이 하선염 바이러스로 확인하였다.
- 동정된 검체를 3회에 거친 플라크 형성시험을 수행하여 야생 유행성 이하선염 바이러스를 순수 분리하였다 또한 국내에서 사용중인 유행성이하 선염 백신주를 순수분리하기 위해 시판중인 Tri-kovax (Korea Vaccine Co., Korea, TR9807-1), MMR- II (MSD, USA, W4380), MuMeRu Vax (KGCC, Korea, 1280047) 및 Triviraten Bema (Swiss Serum and Vaccine Institute, Switzerland, 147 680.124)로부터 각각 4종류의 Urabe Am9, Hoshino, Jeryl Lynn, Rubini strain을 야생 유행성이 하선염 바이러스 분리와 동일한 방법으로 순수분리하였다 (11).
- 분리 증식된 4종류의 백신주와 분리된 야생형 유행성이하선염 바이러스를 각각 바이러스의 역가가 2.5 X 107mlo] 되도록 하고, 바이러 스 종류별 10마리 마우스 (ICR, outbred, 6주령)에 각각의 바이러 스를 0.5 ml씩 복강내에 1주 간격으로 3회 면역하고, 최초 면역으로부터 총 4주가 경과한 후 채혈하여 혈청을 분리 수확하였다 (17).
- 각각의 분리 증식되 어진 유행성 이하선염 바이러 스의 150 ㎕를 취하여 QIAamp Viral RNA Kit (QIAGEN, USA, 29504)를 이용하여 각 바이러스당 최 종적으로 50 |11의 genomic RNA를 분리 하였다. 분리된 2의 genomic RNA를 random hexamer (Gibco BRL, USA, 18418-012)4 cDNA Synthesis Kit (TaKaRa, Japan, 6120)를 이용하여 20의 cDNA를 합성하였다. 유행성이하선염 바이러스의 SH 유전자를 얻기 위하여 Kunkel 등(20)이 고안한 primer (Forward: 5-TCAACACAATATCAAGTA- 3, (position 2964-2981), Reverse: 5'-TTCTGTGTT- GTATTGTGA-3' (position 3401-3418))로 9412에서 5분간 반응시키고 94℃, 30초, 42C, 30초, 72℃, 30초로 총 35 회 반응시킨 후 72P에서 10분간 마지막으로 반응시킨 후 455 bp의 PCR 산물을 얻었다 (3, 13, 19, 20).
- 분리주와 현재 우리나라에서 사용하고 있는 백신주 및 외국의 분리주의 SH 구조유전자를 비교 . 분석해 본 결과를 Table 2에 나타내었다.
- 세포배 양을 통해 세포병 변이 나타난 바이 러 스 를 분리 동정하기 위해 anti-mumps serum (Denka Seiken, 410 706, Japan, l:320/ml)을 항체 역가가 1:32가 되도록 맞추어 처리하였다. 세포병변이 나타난 바이러스 배양액과 anti-mumps serum을 동량으로 혼합하여 암실조건 4P 에서 2시간 동안 충분히 중화반응을 시킨 후 Vero 세포 (2X105 cells/ml)와 동량으로 혼합하여 접종하였다.
- 분리된 2의 genomic RNA를 random hexamer (Gibco BRL, USA, 18418-012)4 cDNA Synthesis Kit (TaKaRa, Japan, 6120)를 이용하여 20의 cDNA를 합성하였다. 유행성이하선염 바이러스의 SH 유전자를 얻기 위하여 Kunkel 등(20)이 고안한 primer (Forward: 5-TCAACACAATATCAAGTA- 3, (position 2964-2981), Reverse: 5'-TTCTGTGTT- GTATTGTGA-3' (position 3401-3418))로 9412에서 5분간 반응시키고 94℃, 30초, 42C, 30초, 72℃, 30초로 총 35 회 반응시킨 후 72P에서 10분간 마지막으로 반응시킨 후 455 bp의 PCR 산물을 얻었다 (3, 13, 19, 20).
- 전처리 되어 진 가검 물을 각각 100 ㎕씩 취하고 접 종용 배지 (EMEM suppemented with 2% fucose, 0.2 ng/ml of crystalline trypsin [1:250])에 ZxlO, cells/ml의 농도로 현탁되어진 Vero (African green monkey kidney, ATCC CCL-81) 및 HEp-2 세포 (Human hepatocarcinoma, ATCC CCL-23) 100 ㎕와 함께 섞어 96 well cell culture plate (flat bottom)에 접 종하였다.
- 대상 환자는 1998년 4월 28일부터 31일 사이 제주도, 대정읍을 중심으로 임상적으로 유행성이하 선염 환자로 진단된 91명의 환자와 1999년 4월 29 일과 30일에 충청북도 옥천과 충청남도 서천에서 유행성 이 하선염 환자로 추정 되는 9명 이 었다. 총 100명의 환자로부터 인후분비물을 멸균된 면 봉으로 도말채취한 후 소혈청알부민이 강화된VTM 배지 (Earle's Minimum Essential Medium [EMEM, Gibco BRL, USA, 41500-034] supplemented with final 1% BSA, 2 ml/tube)에 넣어 냉장상태로 수송하여 세포접종전까지 -70-C에 보관하였다. 인후분비물의 대부분은 증상이 나타난지 1~3일 사이에 채취하였다.
- 또한 1999년 충청남북도에서 9명의 환자의 인후가검물을 채취하여 이를 Vero 세포배 양을 통해 2개의 유행성 이하선염 바이러스를 분리 증 식하였다. 최종적으로 플라크 형성실험을 통해 최종적 으로 10개의 바이 러 스를 순수분리 하였다. 분리 방법상 유행성 이하선염 바이러스에 대하여 감 수성 이 있다고 알려진 세포인 Vero 세포와 HEp-2 세포를 사용하여 분리 시도를 하였는데, 분리된 바이 러 스 모두 Vero 세 포에서 만 분리 되 었으며 ,이는 유행 성 이 하선염 바이 러 스 분리 에는 Vero 세포가 더욱 감수성이 있는 것으로 볼 수 있다.
대상 데이터
- 대상 환자는 1998년 4월 28일부터 31일 사이 제주도, 대정읍을 중심으로 임상적으로 유행성이하 선염 환자로 진단된 91명의 환자와 1999년 4월 29 일과 30일에 충청북도 옥천과 충청남도 서천에서 유행성 이 하선염 환자로 추정 되는 9명 이 었다. 총 100명의 환자로부터 인후분비물을 멸균된 면 봉으로 도말채취한 후 소혈청알부민이 강화된VTM 배지 (Earle's Minimum Essential Medium [EMEM, Gibco BRL, USA, 41500-034] supplemented with final 1% BSA, 2 ml/tube)에 넣어 냉장상태로 수송하여 세포접종전까지 -70-C에 보관하였다.
데이터처리
- ABI PRISM™ Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin Elmer, US A) 를 사용하여 제조사의 지침대로 반응액 20 pl당 Terminator Ready Reaction Mix 80 jll, 1 |1M primer 3와 30 -------ng template을 첨가하고 termal cycler로 25회 주기로 증폭하였다. 또한 결정된 염기서 열 결과를 DNASTAR (Madison, WI, USA) 프로그램을 이용하여 결정된 염기서열을 비교 분석하였으며, deduced 아미노산 염기도 결정하고 이를 비교 분석하였다 (4, 9, 18).
성능/효과
- 또한 HAI 시험을 실시한 결과 1998년에 보고된 IFA 결과와 유사한 시험 결과를 얻을 수 있었다. 10개 분리 유행성 이하선염 바이러스 모두 genotype A에 속하는 백신주인 Jeryl Lynn 주와 Rubini 주에 대해서는 약한 HAI unit를 보였으며, 특히 Rubini 주에 대해서는 다소 낮은 HAI unit를 보였다. 따라서 병원소, 즉 환자로부터가 아닌 마우스로부터 얻어진 항혈청으로 수행한 IFA 및 HAI 시험만으로 완전한 평가를 가늠하기는 어려우나, 일본주와 국내 유행바이러스의 항원성이 유사한 것으로 나타났다.
- 따라서 병원소, 즉 환자로부터가 아닌 마우스로부터 얻어진 항혈청으로 수행한 IFA 및 HAI 시험만으로 완전한 평가를 가늠하기는 어려우나, 일본주와 국내 유행바이러스의 항원성이 유사한 것으로 나타났다. 국내 분리주에 대한 본 연구에서, 혈청학적으로 국내 유행주와 백신주와의 항원성 차이를 나타내고 있지만 높은 교차 반응이 일어나고 있는 점으로 보아 국내에 사용되는 백신주 4가지 모두가 국내 유행바 이러스에 대한 방어력이 있음을 인정할 수 있다. Orvell 등(24)은 57개의 아미 노산으로 구성된 SH 단백질 중 아미노산 서열의 차이를 보이는 28-30번의 아미노산 motif에 따라 genotype을 분 류하는 체계를 설정하였다.
- 또한 분리주 1번의 SH 단백의 유도 아미노산 서열 비교에서도 genotype A에 속하는 백신주들과 높은 유사성을 보였다. 그러나 나머지 모든 분리주들은 백신 주인 Jeryl Lynn 주, Rubini 주, Enders 주, Urabe Am9 주 및 Hoshino 주에 대하여 각각 78.6%, 80.4%, 80.4%, 85.7% 및 89.3%의 아미 노산 서 열 유사성 을 보였고, genotype D의 prototype인 RW 주에 대해서는 91.1%의 아주 높은 아미노산 서 열 유사성을 보였다. 반면에 1번을 제외한 나머지 분리주들은 RW 주에 대해서 91.
- 10개 분리 유행성 이하선염 바이러스 모두 genotype A에 속하는 백신주인 Jeryl Lynn 주와 Rubini 주에 대해서는 약한 HAI unit를 보였으며, 특히 Rubini 주에 대해서는 다소 낮은 HAI unit를 보였다. 따라서 병원소, 즉 환자로부터가 아닌 마우스로부터 얻어진 항혈청으로 수행한 IFA 및 HAI 시험만으로 완전한 평가를 가늠하기는 어려우나, 일본주와 국내 유행바이러스의 항원성이 유사한 것으로 나타났다. 국내 분리주에 대한 본 연구에서, 혈청학적으로 국내 유행주와 백신주와의 항원성 차이를 나타내고 있지만 높은 교차 반응이 일어나고 있는 점으로 보아 국내에 사용되는 백신주 4가지 모두가 국내 유행바 이러스에 대한 방어력이 있음을 인정할 수 있다.
- 4%의 염기서 열유사성을 보였다 (12, 24, 25). 또한 분리주 1번의 SH 단백의 유도 아미노산 서열 비교에서도 genotype A에 속하는 백신주들과 높은 유사성을 보였다. 그러나 나머지 모든 분리주들은 백신 주인 Jeryl Lynn 주, Rubini 주, Enders 주, Urabe Am9 주 및 Hoshino 주에 대하여 각각 78.
- 1%의 아주 높은 아미노산 서 열 유사성을 보였다. 반면에 1번을 제외한 나머지 분리주들은 RW 주에 대해서 91.0%의 염기서열 유사성을 보였고 오히려 다른 genotype인 Urabe Am9 주 및 Hoshino 주에 대해서 각각 92.1%,93.8%의 염기서열 유사성을 보였다 (31, 36) (Table 2, 3).
- 한편 플라크 생성 크 기에서도 차이가 있었다. 백신주들은 분리주보다 크기가 작고, 분리주들내에서도 6, 13, 15번은 나머지 분리주보다 크기가 현저히 크게 나타났다. 따라서 SH 단백질 염 기서 열 분석상으로는 동일한 genotype으로 구분되더라도 바이러 스의 증식 및 항원성에 약간의 차이가 있음을 짐작케 한다.
- 분리 바이러스에 대한 혈청학적 연구로 간접형 광항체시험 (indirect immunofluorescence assay, IFA)을 실시한 결과로서는 국내 분리주와 백신주의 유연관계는 찾아보기 힘들었지만, 6번 분리주만 제외하고 대체적으로 미국과 유럽에서 유래한 백 신주인 Jeryl Lynn 주나 Rubini 주보다는 일본에서 유래한 백신주인 Hoshino 주나 Urabe Am9 주쪽에 가까웠다 (1). 또한 HAI 시험을 실시한 결과 1998년에 보고된 IFA 결과와 유사한 시험 결과를 얻을 수 있었다.
- 최종적으로 플라크 형성실험을 통해 최종적 으로 10개의 바이 러 스를 순수분리 하였다. 분리 방법상 유행성 이하선염 바이러스에 대하여 감 수성 이 있다고 알려진 세포인 Vero 세포와 HEp-2 세포를 사용하여 분리 시도를 하였는데, 분리된 바이 러 스 모두 Vero 세 포에서 만 분리 되 었으며 ,이는 유행 성 이 하선염 바이 러 스 분리 에는 Vero 세포가 더욱 감수성이 있는 것으로 볼 수 있다. 한편, 분리된 바이러스의 기원인 환자들의 연령 분포나, 지역 분포상에 일관성은 찾아보기 힘들었다.
- 항원 바이러스의 HA unit를 4 HA unit로 맞추고 상호 HAI 역가를 시험한 결과는 Table 4와 같다. 분리주 15, 77 그리고 243에 대한 항혈청의 역가가 매우 낮아 시험 결과를 판독하기 어려웠 으나, genotype A에 속하는 것으로 결정된 분리주 1번을 제외하고는 나머지 분리주들에 대한 항혈청 은 공히 Hoshino와 Urabe Am9 주 항혈청 에 대해 비슷한 HAI 역가를 보였으나, genotype A에 속하는 Jeryl Lynn 주에 대해서는 약간 낮은 HAI 역가를 보였으나 2배 희석범위내에 있었다. Rubini 주에 대한 HAI 역 가는 다소 낮은 것으로 나타났다.
- 또한 1999년 충청남도 서천에서 분리된 분리주 4A와 8번도 1998년에 분리된 바이러스와 동일 아미노산 염기 서열을 보였다. 분리주 1번은 C-말단 부위에 7개의 아미노산이 결손된 상태로 나타났으며 genotype A로 분류되었고 그 밖의 분리주들은 genotype D로 분류되었다.
- 분석해 본 결과를 Table 2에 나타내었다. 분리주 1번은 genotype A에 속하는 백신주인 Jeryl Lynn 주, Rubini 주 및 Enders 주에 각각 97.2%, 99.4% 및 99.4%의 염기서 열 유사성을 보인 반면에 genotype B에 속하는 백신 주인 Urabe Am9 주 및 Ho- shino 주에 대해서는 각각 85.9% 및 86.4%의 염기서 열유사성을 보였다 (12, 24, 25). 또한 분리주 1번의 SH 단백의 유도 아미노산 서열 비교에서도 genotype A에 속하는 백신주들과 높은 유사성을 보였다.
- 이하선의 팽창은 48시간 후에 최대가 되고 대부분 7~10일간 팽창한 상태로 남게 되지만 체온의 변화는 거의 없다. 유행성이하선염 바이러스의 감 염 으로 인한 합병증으로는 감염 환자들 중 50~ 60%가 무증상 수막염이 발생되고, 환자 중 15% 정도는 수막염 증상을 보이고 3~10일 이내에 후유증 없이 회복된다. 뇌염 발생은 드물지만 (2/ 100,000명) 이들 중 생존자의 25%가 영구후유증이 발생된다.
- Orvell 등(24)은 57개의 아미 노산으로 구성된 SH 단백질 중 아미노산 서열의 차이를 보이는 28-30번의 아미노산 motif에 따라 genotype을 분 류하는 체계를 설정하였다. 이에 따라서 국내 분 리주의 아미노산 서열 분석 결과 분리주 1번은 genotype A로 나머지 분리주들은 genotype D로 나타났다. genotype A와 D는 1970~80년대 유럽에서 분리된 바이러스 type으로 1990년대 중반 genotype B인 일본 분리주들과는 다르게 나타났 다 (24, 36).
- 1998년 총 91개의 가검물로부터 Vero 세포를 이용하여 가검물 번호 1, 4, 6, 13, 15, 66, 72, 77, 80, 84, 243이 세포병 변을 나타냈으며 , 3, 21, 242, 282, 283, 285, 286, 288, 289은 추가로 약한 세포 병변을 나타내었다. 중화시험을 실시한 결과, 양성으로 나타난 분리번호로는 1, 4, 6, 13, 15, 72, 77, 243번이 었으며 , 분리 번호 66, 84은 동정 시험 결과 음성으로 판정하였다. 또한 1999년 총 9개의 가검물에서는 가검물 번호 4A와 8에서 2종류의 바이러스를 분리, 동정하였다 (Table 1).
- 국내에서도, 1998년 4월을 전후하여 제주도 지역에서 유행성이하 선염 환자들이 예년에 비해 급증하였고, 이 당시 유행성이하선염 유아 환자들로부터 검체를 채취 하여 바이러스를 분리하였다. 총 91개의 유사 환 자 검 체로부터 10개의 바이 러스가 분리되 었고, 8 개의 검체에서 유행성이하선염 바이러스로 동정 되었다. 또한 1999년 충청남북도에서 9명의 환자의 인후가검물을 채취하여 이를 Vero 세포배 양을 통해 2개의 유행성 이하선염 바이러스를 분리 증 식하였다.
후속연구
- 한편, 분리된 바이러스의 기원인 환자들의 연령 분포나, 지역 분포상에 일관성은 찾아보기 힘들었다. 이는 분리된 바이 러 스가 적고, 유행지역 이 제주 지역에서도 국한적으로 일어났기 때문에 어떠한 연관성 을 유추하기는 힘들지만 이후에 새로운 유행이 있어 조사된다면 본 연구가 기초 자료로 쓰일 수 있을 것이다.
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