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제안 방법
- 5 μM Ca2+A23187 농도에서 정자의 첨체 반응이 시간별로 일정하게 증가되고 첨체반응에 유의한 영향을 나타내어 그 이후의 실험은 5 nM의 Ca*A23187의 농도로 정자의 첨 체반응을 유도하였다 (Figure 2).
- )과 L-형 VDCC 특이 적으로 저해하는 길항제 인 l, 4dhydropyridine계의 시 약인 nifedipine을 사용하였다. Ca2+ 채널 길항제와 Ca2+ A23187를 같이 첨 가하고 370 5%, CO2의 조건으로 배 양하면서 15분, 30분 간격으로 시료를 채취하였다.
- 5 ml의 정자 부유액 에 5 p.M, 10 (IM Ca저 농도로 첨가하여 정 자의 첨 체 반응을 유도하였다. 비교 군에도 5~10 W의 DMSO 를 첨가하여 같은 조건으로 반응을 유도하였다.
- 염색이 끝난 표본은 증류수로 30초 정도 세척, 건조 후 mounting하여 형광현미경으로관찰하였다. 각 표본은 기본적으로 한 정자 표본에서 100개 이상의 정자를 계산하였고 이때 정자의 꼬리가 꼬여있는 것만을 살아있는 것으로 간주하여 본 실험의 분석 에 포함시켰다 (Benoff et al; 1994; Liu et al., 1996).
- , 1993;Jaiswal 1999). 염색이 끝난 표본은 증류수로 30초 정도 세척, 건조 후 mounting하여 형광현미경으로관찰하였다. 각 표본은 기본적으로 한 정자 표본에서 100개 이상의 정자를 계산하였고 이때 정자의 꼬리가 꼬여있는 것만을 살아있는 것으로 간주하여 본 실험의 분석 에 포함시켰다 (Benoff et al; 1994; Liu et al.
- 정자의 첨체반응을 확인하기 위한 처리가 끝난 표본에 PSA-FITC 염 색을 실시하였다. 이 염색은 첨 체반응이 일어 나지 않은 정 자만 PSA-FITC에 의해 염색이 일어나고 첨체반응이 일어난 것은 염색이 되지 않는다 (Figure 1).
- 이 염색은 첨 체반응이 일어 나지 않은 정 자만 PSA-FITC에 의해 염색이 일어나고 첨체반응이 일어난 것은 염색이 되지 않는다 (Figure 1). 죽은 정자에 대한 첨체 반응은 의미가 없기 때문에 살아있는 정자를 구분하기 hypo-osmotic solution 처리 로 정 자는 꼬리가 꼬인 것만을 분석하였다.
- 첨체반응 저해를 위해 L-형 VDCC 길항제는 nifbdipine 를 T-형 VDCC 길항제로서 mibeftadil를 0.1 ~1.0 μM까지 첨가하였다. 첨체반응을 유발하기 위 해 5 p.
대상 데이터
- 첨체반응을 유발하기 위 해 5 p.M Ca2+23187을 첨가하였다. T-형 VDCC 인 mibefradil의 경우 첨가한 양에 따라 첨 체 반응이 감소하였고 1.
- T-형 VDCC을 특이 적 으로 저 해 하는 길항제 인 mibefradil (Roche co.)과 L-형 VDCC 특이 적으로 저해하는 길항제 인 l, 4dhydropyridine계의 시 약인 nifedipine을 사용하였다. Ca2+ 채널 길항제와 Ca2+ A23187를 같이 첨 가하고 370 5%, CO2의 조건으로 배 양하면서 15분, 30분 간격으로 시료를 채취하였다.
- 본 실험에선 Ca2+A23187을 이용한 인위적인 정자 첨체반응 유도에 의한 실험이였다. 하지만 앞으로 Ca2+ 채널 길항제 인 mibefradil과 같은 약물들은 실제적인 피임제로 사용하기 위해서는 자궁이나 난관에 조건에 존재하는 progesterone과 난자의 투명 대 ZP3 성분을 이용한 첨체반응 유도에서 어떻게 얼마만큼의 첨체반응 저해를 보이는지에 대한 분석이 진행되어야 할 것이다.
- 본원에 방문한 불임부부 중에서 남성불임의 요소가 전혀 없는 정상적인 정액 소견을 보이는 정자를 회수하여 실험에 공시하였다 (n=10). 완전히 액화된 정액을 Ca2+, Mg2* free PBS 용액 (Gibco-BRL, USA)으로 2회 세척 한 뒤에 운동성이 90% 인정자를 회수하여 2~5 X lOe/ml 이상의 정자 농도로 실험에 공시하였다.
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