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문제 정의
- 본 연구에서 저자들은 사정된 사람 정자의 수정능력획득에 있어서 FPP의 영향을 알아보고자 하였다. 이는 FPP와 접촉이 전혀 없는 생쥐의 부정소 정자를 이용한 결과9에서와 같이 이미 FPP 의 영향하에 있는 것으로 여겨지는 사람의 사정 정자에서도 외부적으로 주어지는 FPP의 효과가 있을지는 확신할 수 없었기 때문이다.
- 본 연구자들은 사람의 전립선, 시상하부 그리고 정액 내에서 그 존재가 확인된 FPP (fertilization promoting peptide; pGlu-Glu-ProNH?)가 사정된 정자에 부착되어, 정자-난자간의 수정과정에서 정자의 수정능력을 유지 또는 향상시키는 역할을 수행하리리는 가설하에 FPP가 냉동 후 해빙한 사람 정자의 운동양태, 수정능력획득 및 첨체반응에 미치는 영향을 CASA 장비와 crc염색방법을 통하여 알아보고자 본 연구를 수행하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 이에 본 연구에서는 냉동 후 해빙한 사람 정자의 운동양태 및 수정능력획득과 첨체반응에 미치는 FPP의 영향을 자동정자 분석기와 chlortetracycline (CTC) 염색방법을 통하여 알아보고자 하였다.
제안 방법
- 1. CASA 장비를 이용한 운동양태변화를 분석하였다. 총운동성 (total motility)은 시간이 경과함에 따라 모든 실험군에서 감소하였고, 대조군과 통계적 인 차이는 없었으나 24시간 경과 후에 대조군의 운동성 이 급격히 감소하였다.
- 각 실험군의 정자의 운동양상은 배양 후 0, 1, 3, 6, 24시간에 CASA를 이용하여 분석하였다. 정자의 운동양상은 curvelinear velocity (VCL), straight line velocity (VSL), average path velocity (VAP), linearity (LIN), straightness (STR), beat cross frequency (BCF) 그리고 총운동성 (total motility) 등을 조사하였다.
- 약 2분간 실온에서 염색하였다. 염색되어진 정자를 2% PVP가 들어있는 배 양액으로 세척하여 남아 있는 염색성분을 제거한 후 CTC 염색과정을 아래와 같이 수행하였다. 정자와 CTC용액을 1:1(50 ul)로 알루미늄호일로 빛을 차단한 실험관에서 혼합한 후 교반기를 이용하여 섞어 주고 05 M TYis-HCl용액 내 2.
- 형광현미경하에서 수정능력획득 여부와 첨체반응을 검경 한 결과를 3가지로 구분하였다. 정자 두부 전체가 골고루 형 광을 띠는 것을 uncapacitated, intact acrosome으로, post-equatorial region에 형 광띠 가 관찰되지 않는 것을 capacitated, intact acrosome으로 구분하였고, 정자의 두부전체에 형광을 띠지 않는 것을 acrosome reacted군으로 구분하여 각각의 slide에서 100개의 정자를 조사하였다. 세가지의 결과 판독 모두에서 정 자의 중편 (mid piece)에서 밝은 형 광을 관찰할 수 있었다.
- 각각의 실험군에 5xl06개의 정자를 분주하여 실험에 사용하였다. 정자를 각각의 실험군에 분주한 후 5% CO2, 37tJ의 배양기에 넣어 배양하였다.
- 정자의 운동양상은 curvelinear velocity (VCL), straight line velocity (VSL), average path velocity (VAP), linearity (LIN), straightness (STR), beat cross frequency (BCF) 그리고 총운동성 (total motility) 등을 조사하였다.
- 준비된 정자를 chlortetracycline (CTC) 염색하기전에 정자의 생존성을 확인하기 위해서 100 mg/ ml의 Hoechst 33258를 단백질이 제거된 배양액으로 1:1000비율로 희석한 후 정자와 1:100으로 섞은 후 약 2분간 실온에서 염색하였다. 염색되어진 정자를 2% PVP가 들어있는 배 양액으로 세척하여 남아 있는 염색성분을 제거한 후 CTC 염색과정을 아래와 같이 수행하였다.
- 해빙 후 정자를 얻기 위해 3개층으로 구성된 percoll방법으로 2회 원심분리하여 움직이는 정자를 획 득하였다. 원심분리는 1400 ipm에서 20분간 1회, 120) rpm에서 5분간 1회씩 시행하였다.
- 고정된 정자 10 |!1를슬라이드 위에 정치한 후 antifade 용액을 한 방울 떨어뜨리고 cover slip를 덮고 slide 위의 정자가 최대한 편평해 지도록 압력을 가한 후 투명한 매니큐어로 mounting하였다. 형광현미경하에서 수정능력획득 여부와 첨체반응을 검경 한 결과를 3가지로 구분하였다. 정자 두부 전체가 골고루 형 광을 띠는 것을 uncapacitated, intact acrosome으로, post-equatorial region에 형 광띠 가 관찰되지 않는 것을 capacitated, intact acrosome으로 구분하였고, 정자의 두부전체에 형광을 띠지 않는 것을 acrosome reacted군으로 구분하여 각각의 slide에서 100개의 정자를 조사하였다.
대상 데이터
- 원심분리는 1400 ipm에서 20분간 1회, 120) rpm에서 5분간 1회씩 시행하였다. 각각의 실험군에 5xl06개의 정자를 분주하여 실험에 사용하였다. 정자를 각각의 실험군에 분주한 후 5% CO2, 37tJ의 배양기에 넣어 배양하였다.
- 9% NaCl를 1:1의 비 율로 준비 한 용액 에 녹인 후 사용전까지 냉동 보관하였다. 실험에 사용하기 직전에 대조군을 제외한 모든 실험군에 Ham's F-10 용액 에 희 석 하여 2 nM/ml의 농도로 준비 하였다.
데이터처리
- FPP에 의한 사람 정 자의 kinematic parameters의 변화를 알아보기 위하여 CASA장비를 이용하여 분석 하였다. 총운동성 (total motility)은 시간이 경과함에 따라 모든 실험군 (VAP, VSL, VCL과 ALH) 에서 감소하는 모습을 보였으며 50 nM FPP처 리 군을 제외하고는 대조군과 유의한 차이는 없었다.
- 통계적 유의성 검정은 x2-test를 이용하였으며, p<0.05인 경우를 유의하다고 판정하였다.
성능/효과
- 2. FPP의 처리농도와 처리시간에 따른 F, B와 AR-pattem의 변화를 CTC염색방법을 이용하여 분석한 결과 FPP 25~100 nM을 처리한 경우에는 대조군에 비하여 시간이 경과함에 따라 F-pattem에서 B-pattem으로의 전이양상이 뚜렸하게 나타났다. 특히 처리 후 3시간이 경과하면서부터 pattern 의 변화가 통계적으로 유의하게 나타났다.
- 3. FPP처리시간에 따른 변화양상은 3시간 이후 관찰되었다. 모든 FPP처리군에서 점진적인 B-pat- tern의 증가가 나타났고, AR-patteme 증가하지 않는 것으로 확인되었다.
- FPP는 사정 된 사람 정자에서도 능동적 인 효과가 있음을 보여주었다. 본 실험의 결과에서와 같이 FPP처리군에서는 운동양태 변화에서 대조군에 비하여 전반적인 운동성의 유지를 보여주었다.
- pattem에서 AR-pat- tern으로의 변화가 유의하게 증가하는 양상을 보여 주었으나 B-pattem의 변화는 관찰되지 않았다 (Figure 4). FPP처리 농도간의 차이는 크게 나타나지 않는 것으로 보였으나 50 nM 처리군이 다른 처리 군보다 변화의 폭이 넓은 것으로 사료된다. 모든 실험군에서 죽은 정자로 인한 false positive 는 Hoechst 33258로 염색한 결과 1% 이하로 확인되었다’
- 위의 kinematic parameters의 분석 결과에서 와같이 progesterone를 첨가해 주는 것은 정자의 운동성을 유지시켜 주는 기능이 있는 것으로 사료되나, 일반적인 인공수정시술시와 같은 방법으로 준비 한 대조군은 24시간이 경과하면서 급격히 운동성을 상실하는 것을 관찰할 수 있었다 (Figure 1). FPP처리군은 처리농도에 상관없이 시간이 경과함에 따라 BCF, STR과 UN 등의 운동양태가 대조군에 비하여 향상 또는 유지되는 것을 관찰할 수 있었다. 이는 정액 내에서 정자에 부착되는 것으로 사료되는 FPP의 기 능이 최소한 정자의 수정능력을 유지한다는 것을 시사한다.
- 모든 FPP처리군에서 점진적인 B-pat- tern의 증가가 나타났고, AR-patteme 증가하지 않는 것으로 확인되었다. Progesterone처리군은 시간이 경과함에 따라 F-pattem에서 AR-pattem으로의변화가 유의하게 증가하는 양상을 보여주었으나 B-pattem의 변화는 관찰되지 않았다. FPP처리 농도 간의 차이는 크게 나타나지 않았다.
- 총운동성 (total motility)은 시간이 경과함에 따라 모든 실험군에서 감소하였고, 대조군과 통계적 인 차이는 없었으나 24시간 경과 후에 대조군의 운동성 이 급격히 감소하였다. VAP, VSL, VCL과 ALH도 대조군과 차이가 없는 것으로 나타났다. 그러나 BCF, STR과 LINe 3시간이 경 과하면서부터 대조군과 농도에 상관없이 처리 군에서 증가하는 양태를 관찰할 수 있었다.
- 그러나 24시간 경과 후에 대조군의 운동성이 급감하는 경향을 나타내었다. 그러나 BCF, STR과 LINe 3시간이 경과하면서부터 대조군과 농도에 상관없이 처리군에서 증가하는 양태를 관찰할 수 있었다. 특히, BCF는 모든 FPP처 리군에서 3시간 이후부터 유의한 증가를 보여주었다 (Figure 1).
- 그러나 24시간 경과 후에 대조군의 운동성이 급감하는 경향을 나타내었다. 그러나 BCF, STR과 LINe 3시간이 경과하면서부터 대조군과 농도에 상관없이 처리군에서 증가하는 양태를 관찰할 수 있었다. 특히, BCF는 모든 FPP처 리군에서 3시간 이후부터 유의한 증가를 보여주었다 (Figure 1).
- 따라서 위 의 결과에서 보면 FPP는 uncapacitated 정자를 자극하여 수정능력획득과 운동성을 유지시키고, 일련의 첨체반응 유기를 억제하는 기능은 여성의 생식수관 내에서 정자의 수정력을 유지하는 데 필수적이라고 사료된다. 따라서 지금까지 인공수정시술에서 보여준 낮은 임신률은 정액 내에 존재하는 FPP가 시술준비과정 중에서 상실됨으로 인하여 수정과정이 원활하지 못했던 것으로 사료되며, 전립선내 FPP생성과정의 문제로 인한 정 액내 FPP의 양이 불충분하거나 결핍으로 지금까지 알려지지 못한 남성불임의한 요인이 아닌가 생각된다.
- 이는 정액 내에서 정자에 부착되는 것으로 사료되는 FPP의 기 능이 최소한 정자의 수정능력을 유지한다는 것을 시사한다. 또한 대조군에서 운동양태가 24시간 이후 급격한 감소를 보이는 것으로 보아, 인공수정시술 준비과정 에 시행하는 원심분리를 이용한 세척방법에서 일부 또는 많은 양의 FPP가 상실되는 것으로 추론된다.
- 모든 FPP처 리군에서 점진적인 B-pattem의증가가 나타났고, AR-patteme 증가하지 않는 것으로 확인되었다 (Figure 5). 대조군은 시간이 경과되어도 F-pattem에서 B-pattem, 또는 AR-pattem으로의 변화가 거의 관찰되지 않았다.
- FPP처리시간에 따른 변화양상은 3시간 이후 관찰되었다. 모든 FPP처리군에서 점진적인 B-pat- tern의 증가가 나타났고, AR-patteme 증가하지 않는 것으로 확인되었다. Progesterone처리군은 시간이 경과함에 따라 F-pattem에서 AR-pattem으로의변화가 유의하게 증가하는 양상을 보여주었으나 B-pattem의 변화는 관찰되지 않았다.
- 있음을 보여주었다. 본 실험의 결과에서와 같이 FPP처리군에서는 운동양태 변화에서 대조군에 비하여 전반적인 운동성의 유지를 보여주었다. 위의 kinematic parameters의 분석 결과에서 와같이 progesterone를 첨가해 주는 것은 정자의 운동성을 유지시켜 주는 기능이 있는 것으로 사료되나, 일반적인 인공수정시술시와 같은 방법으로 준비 한 대조군은 24시간이 경과하면서 급격히 운동성을 상실하는 것을 관찰할 수 있었다 (Figure 1).
- 즉, 체내에서 사정 된 정자가 난자에 도달하기까지 수정능력을 유지할 수 있는 기능적인 뒷받침이 있기 때문이라 생각된다?' 또한 progesterone (2 nM)이 함께 처리된 상태에서, 즉 배란기의 여성의 생식기관에 존재하고 있는 progesterone의 영향과 유사한 환경 속에서 대조군은 첨체 반응이유의 하게 진행된 반면에, FPP처 리군에서는 첨체 반응이 억제된 상태로 유지된 것은 FPP의 생체 내에서의 역할을 분명하게 보여주는 것으로 사료된다. 사람의 정액 내에 존재하는 FPP 50 nM 내외의 농도에서& 위와 같은 결과를 얻은 것으로 보아, FPP를 인공수정시술 등에 적용할 수 있음을 시사한다. 실험 결과에서 FPP 농도간의 첨체 반응 유기율에서 기복이 나타나는 것은 실험에 참여한 환자들의 수정능력 이 검증되지 않은 상태에서 전체 정자를 종합하여 분석 에 사용하였기 때문이라고 생각된다.
- 본 실험의 결과에서와 같이 FPP처리군에서는 운동양태 변화에서 대조군에 비하여 전반적인 운동성의 유지를 보여주었다. 위의 kinematic parameters의 분석 결과에서 와같이 progesterone를 첨가해 주는 것은 정자의 운동성을 유지시켜 주는 기능이 있는 것으로 사료되나, 일반적인 인공수정시술시와 같은 방법으로 준비 한 대조군은 24시간이 경과하면서 급격히 운동성을 상실하는 것을 관찰할 수 있었다 (Figure 1). FPP처리군은 처리농도에 상관없이 시간이 경과함에 따라 BCF, STR과 UN 등의 운동양태가 대조군에 비하여 향상 또는 유지되는 것을 관찰할 수 있었다.
- 정자의 수정능력획득과 첨체반응은 모든 FPP (25-100 nM) 처리 군에서 유의한 차이를 나타내었다. Uncapacitated, acrosome intacted 상태인 F- pattem군에서 capacitated, acrosome intacted 상태 B-pattem군으로의 유의한 (p<0.
- 하였다. 총운동성 (total motility)은 시간이 경과함에 따라 모든 실험군 (VAP, VSL, VCL과 ALH) 에서 감소하는 모습을 보였으며 50 nM FPP처 리 군을 제외하고는 대조군과 유의한 차이는 없었다. 그러나 24시간 경과 후에 대조군의 운동성이 급감하는 경향을 나타내었다.
- CASA 장비를 이용한 운동양태변화를 분석하였다. 총운동성 (total motility)은 시간이 경과함에 따라 모든 실험군에서 감소하였고, 대조군과 통계적 인 차이는 없었으나 24시간 경과 후에 대조군의 운동성 이 급격히 감소하였다. VAP, VSL, VCL과 ALH도 대조군과 차이가 없는 것으로 나타났다.
- FPP의 처리농도와 처리시간에 따른 F, B와 AR-pattem의 변화를 CTC염색방법을 이용하여 분석한 결과 FPP 25~100 nM을 처리한 경우에는 대조군에 비하여 시간이 경과함에 따라 F-pattem에서 B-pattem으로의 전이양상이 뚜렸하게 나타났다. 특히 처리 후 3시간이 경과하면서부터 pattern 의 변화가 통계적으로 유의하게 나타났다. Pro- gesterone처 리군은 시간이 경과함에 따라 점차 AR- pattem이 유의하게 증가하였으나 FPP처리군에서와 같이 F-pattem에서 B-pattem으로의 전이는 나타나지 않았다.
후속연구
- 사료된다. 따라서 인공수정시술과정에서 원심분리로 정자를 세척할 때 FPP 일부 또는 전부가 제거됨으로써 임신률에 영향을 미칠 수 있다고 사료되며, 또한 전립선내 FPP생성과정의 문제로 인한 정액 내 FPP의 양이 불충분하거나 결핍되었을 때 남성불임요인이 아닌가를 앞으로 더 연구해 보아야할 것이다. 또한 이러한 FPP의 기능을 불임 치료에 응용한다면 보다 더 나은 임상적 결과를 도출할 수 있을 것으로 생각된다.
- 따라서 인공수정시술과정에서 원심분리로 정자를 세척할 때 FPP 일부 또는 전부가 제거됨으로써 임신률에 영향을 미칠 수 있다고 사료되며, 또한 전립선내 FPP생성과정의 문제로 인한 정액 내 FPP의 양이 불충분하거나 결핍되었을 때 남성불임요인이 아닌가를 앞으로 더 연구해 보아야할 것이다. 또한 이러한 FPP의 기능을 불임 치료에 응용한다면 보다 더 나은 임상적 결과를 도출할 수 있을 것으로 생각된다.
- 이상의 결과로 보아, FPP가 정자의 수정능력 획득과 운동성을 유지시키고, 일련의 첨 체반응 유기를 억제함으로써, 여성의 생식수관 내에서 정자의 수정능력을 유지 하는데 필수적 역할을 수행 한다고 사료된다. 따라서 인공수정시술과정에서 원심분리로 정자를 세척할 때 FPP 일부 또는 전부가 제거됨으로써 임신률에 영향을 미칠 수 있다고 사료되며, 또한 전립선내 FPP생성과정의 문제로 인한 정액 내 FPP의 양이 불충분하거나 결핍되었을 때 남성불임요인이 아닌가를 앞으로 더 연구해 보아야할 것이다.
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