[논문]오미자 활성성분 DDB의 NF-<tex>${\\kappa}B$</tex> 신호 전달 및 염증물질 발현 조절

주성수; 유영민; 원태준; 김민정; 이선구; 황광우; 이도익

doi:10.4110/in.2006.6.1.27

오미자 활성성분 DDB의 NF-${\\kappa}B$ 신호 전달 및 염증물질 발현 조절
Regulation of Inflammatory Repertoires and NF-${\\kappa}B$ Signal Transduction by DDB, an Active Compound from Schizandra Chinensis Baillon 원문보기

Immune network : official journal of the Korean association of immunobiologists, v.6 no.1, 2006년, pp.27 - 32

주성수 (중앙대학교 약학대학 면역학교실) , 유영민 (상지대학교 한의과대학 병리학교실) , 원태준 (중앙대학교 약학대학 면역학교실) , 김민정 (중앙대학교 약학대학 면역학교실) , 이선구 (상지대학교 한의과대학 병리학교실) , 황광우 (중앙대학교 약학대학 면역학교실) , 이도익 (중앙대학교 약학대학 면역학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Background: Chronic inflammation in the brain has known to be associated with the development of a various neurological diseases including dementia. In general, the characteristic of neuro-inflammation is the activated microglia over the brain where the pathogenesis occurs. Pro-inflammatory repertoires, interleukin-1${\beta}$ (IL-1${\beta}$) and nitric oxide (NO), are the main causes of neuro-degenerative disease, particularly in Alzheimer's disease (AD) which is caused by neuronal destruction. Those pro-inflammatory repertoires may lead the brain to chronic inflammatory status, and thus we hypothesized that chronic inflammation would be inhibited when pro-inflammatory repertoires are to be well controlled by inactivating the signal transduction associated with inflammation. Methods: In the present study, we examined whether biphenyl dimethyl dicarboxylate (DDB), an active compound from Schizandra chinensis Baillon, inhibits the NO production by a direct method using Griess reagent and by RT-PCR in the gene expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and IL-1${\beta}$. Western blots were also used for the analysis of NF-${\kappa}B$ and I${\kappa}B$. Results: In the study, we found that DDB effectively inhibited IL-1${\beta}$ as well as NO production in BV-2 microglial cell, and the translocation of NF-${\kappa}B$ was comparably inhibited in the presence of DDB comparing those to the positive control, lipopolysaccharide. Conclusion: The data suggested that the DDB from Schizandra chinensis Baillon may play an effective role in inhibiting the pro-inflammatory repertoires which may cause neurodegeneration and the results imply that the compound suppresses a cue signal of the microglial activation which can induce the brain pathogenesis such as Alzheimer's disease.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

실험에서 관찰된 NO는 host defense를 위해 생체 내 및 면역계에서 중요한 역할을 담당하는 반면, NO의 지나친 생성은 세포사를 유발하고 조직에 손상을 주는 퇴행성 기능을 동반하기도 하므로(25), 중추신경계에서 microglia의 만성 염증 반응에 의한 NO의 생성은 신경세포의 기능 손실 및 사멸을 유도하여 AD를 비롯한 신경 퇴행성 질환을 유발시킬 수 있다(26). 따라서 microglia와 같은 대식세포의 활성에 의한 NO의 증가는 퇴행성 뇌질환에서의 임상적 의미가 크므로, 본 연구에서는 LPS 처리로 microglia를 활성화시켜 그로부터 발현되는 iNOS를 측정하여 NO 농도 변화에 대한 관찰을 하였다. Fig.
/3가 뇌에 응집되어 plaque가 형성되고 결국 뇌신경계 파괴의 결과로 나타나는 것으로 알려져 있으며, 이때 활성화되는 뇌 대식세포인 microglia에 의해 IL-1IL-6, NO와 같은 pro-inflammatory 매개 물질들이 방출되고 이는 ROS, pro-inflammatory cytokine, neurotoxic factor들의 점진적 인상 승을 유도하는 과정을 거친다(22-24). 따라서 본 연구에서는 오미자의 단리 성분인 DDB가 염증과정에 조절자로 역할을 하는지에 대한 여부를 관찰하였으며, figures에서 나타난 바와 같이 항염증 효과가 있음을 알 수 있었다. 실험에서 관찰된 NO는 host defense를 위해 생체 내 및 면역계에서 중요한 역할을 담당하는 반면, NO의 지나친 생성은 세포사를 유발하고 조직에 손상을 주는 퇴행성 기능을 동반하기도 하므로(25), 중추신경계에서 microglia의 만성 염증 반응에 의한 NO의 생성은 신경세포의 기능 손실 및 사멸을 유도하여 AD를 비롯한 신경 퇴행성 질환을 유발시킬 수 있다(26).

제안 방법

Gel에서 분리된 단백질을 PVDF membrane에 transfer하였다. Membranee 5% skim milk/ TBS-T로 1시간 동안 blocking 한 후 TBS-T에 희석된 anti-NF- /cB p65 (Delta Biolabs, USA), anti-NF- kB p50 (Delta Biolabs, USA), anti-I /cB a (Santa Cruz Biotechnology, USA), anti-iNOS (Santa Cruz Biotechnology, USA) 또는 anti-GAPDH (Lab Frontier, Korea)를 1시간 동안 incubation 후 anti-rabbit Ig-horse radish peroxidase (Zymed, USA) 2차 항체를 붙여 ECL (enhanced chemiluminescence luminogram) reagent (Amersham, US A) 로 반응시킨 후 x-ray film에 exposure 하였다.
RNA pellet을 DEPC 처리한 증류수로 희석한 75% EtOH 1 ml로 세척한 후 공기 중에서 건조시켜 reverse transcription sample로 사용하였다. cDNA template를 대상으로 한 PCR 반응에 사용된 primer는 IL-1 8 (sense: age tgt ggc age tac etg tg, antisense: get etg ett gtg agg tgc tg), iNOS (sense: ggc acc gag att gga gtt eg, antisense: gcc aga tgt ggg tet tcc ag), GAPDH (sense: tcc atg aca act ttg gca teg tgg, antisense: gtt get gtt gaa gtc aca gga gac)이며 522, 382 및 375 bp를 각각의 target size로 하였다. 반응 용량은 20 “1가 되도록 하였고 ethidium bromide로 염색된 1.
RT-PCR. 각 군의 1 X 10如1의 세포로부터 Trizol Reagent(Life Technologies, USA)를 이용하여 total RNA를 추줄하였다. 즉, Trizol reagent 1 ml를 첨가하여 세포를 용해시키고 실온에서 5분 동안 방치 후 chloroform 200 “1를 첨가하여 13, 500 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다.
즉, LPS 투여 1시간 후 세포질과 핵에서 단백질을 각각 추줄하여 NF- kB와 IkBa의 상대적 관찰을 하였고 6시간 후 total RNA를 추출하여 NF- kB에 의해 전사가 조절되는 IL-18와 iNOS의 mRNA 발현을 관찰하였으며 9시간 후 세포질과 핵에서 단백질을 각각 추출하여 NF-kB의 활성화와 MBa의 degradation 및 iNOS 단백질의 발현을 관찰하였다. 또한 LPS 투여 12시간 및 24시간 후 배지를 취하여 NO의 생성을 확인하였다.
cDNA template를 대상으로 한 PCR 반응에 사용된 primer는 IL-1 8 (sense: age tgt ggc age tac etg tg, antisense: get etg ett gtg agg tgc tg), iNOS (sense: ggc acc gag att gga gtt eg, antisense: gcc aga tgt ggg tet tcc ag), GAPDH (sense: tcc atg aca act ttg gca teg tgg, antisense: gtt get gtt gaa gtc aca gga gac)이며 522, 382 및 375 bp를 각각의 target size로 하였다. 반응 용량은 20 “1가 되도록 하였고 ethidium bromide로 염색된 1.2% agarose gel에서 전기 영동 한 후 UVDoc (UVItec, UK)에서 관찰하였다.
본 실험에서 DDB를 안정화 상태의 BV-2 세포주에 30분간 전처리 후 각 실험군(5, 10, 20, 40“g/ml)에 따라 lipopolysaccharide (LPS) 5 "g/ml를 처리하여 세포에서 나타나는 생화학적 변화를 관찰하였다. 즉, LPS 투여 1시간 후 세포질과 핵에서 단백질을 각각 추줄하여 NF- kB와 IkBa의 상대적 관찰을 하였고 6시간 후 total RNA를 추출하여 NF- kB에 의해 전사가 조절되는 IL-18와 iNOS의 mRNA 발현을 관찰하였으며 9시간 후 세포질과 핵에서 단백질을 각각 추출하여 NF-kB의 활성화와 MBa의 degradation 및 iNOS 단백질의 발현을 관찰하였다. 또한 LPS 투여 12시간 및 24시간 후 배지를 취하여 NO의 생성을 확인하였다.
본 연구에서 사용된 오미자 Schizandrin C 유도체 인 DDB가 항염증 효과를 가지는 선행연구로부터 microglia의 proinflammatory cytokine의 생성 억 제 여부를 조사하고자 하였으며, 오미자 활성 성분이 microglial cell에서 그■와 같은 상위개념의 항염효과를 가진다면 점차 증가 일로에 있는 노인성 치매 등에 효과적으로 활용할 수 있을 것으로 생각된다. 특히, DDB의 NF-kB의 활성억제를 통해 항염작용이 보고되고 있어(19), 본 연구에서는 LPS로 활성화시켜 염증 반응을 유도한 BV-2 microglial cell line에 Schizandrin C 유도체 DDB를 농도 별로 처리하였을 때 발생하는 pro inflammatory repertoire의 발현과 이러한 신호를 유도하는 NF- /cB signal transduction을 관찰하여 활성물질에 의한 NO 및 IL-18 억제작용을 확인하였다.

대상 데이터

DDB (우리제약), LPS (Sigma, USA) 원액은 마이크로필터 (0.2 “m)를 통과한 배지에 녹여 준비했다. DDB는 5, 10, 20, 40“g/ml, LPS는 5"g/ml의 최종농도가 되도록 조절했다.
투명한 상층액을 취하여 새로운 tube로 옮기고 동량의 isopropyl alcohol을 첨가한 후 13, 500 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 RNA를 침강시켰다. RNA pellet을 DEPC 처리한 증류수로 희석한 75% EtOH 1 ml로 세척한 후 공기 중에서 건조시켜 reverse transcription sample로 사용하였다. cDNA template를 대상으로 한 PCR 반응에 사용된 primer는 IL-1 8 (sense: age tgt ggc age tac etg tg, antisense: get etg ett gtg agg tgc tg), iNOS (sense: ggc acc gag att gga gtt eg, antisense: gcc aga tgt ggg tet tcc ag), GAPDH (sense: tcc atg aca act ttg gca teg tgg, antisense: gtt get gtt gaa gtc aca gga gac)이며 522, 382 및 375 bp를 각각의 target size로 하였다.

데이터처리

이어서 N-1 -napthylethylene diamine dihydrochloride (NED) 용액 50“[를 첨가하고 차광하여 10분 동안 실온에서 반응시킨 후 30분 내에 540 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. NO의 생성량은 표준검 량곡선을 통해 계산하였다. RT-PCR.
통계처 리. 결과분석은 GraphPad Prizm4 software를 이용하여 p<0.05일 때 통계적 유의성 (t-test)이 있음을 인정하였고, PCR 및 western blot 결과의 분석 은 gel/membrane band scanning 후 UVIDocMW program을 통해 band inten-sity의 상대비교 분석을 실시하였다.

이론/모형

Equal amounts of lysate (25 ㎍) extracted from cytosol and nucleus was loaded for the detection of NF- /cB p65 (A), NF- /cB p50 (B) and I /cB (C), and the blot intensity was compared between cytosol and nucleus. Gene expression of proinflammatoty cytokine Ⅱ-1 B was analyzed by RT- PCR method as described in the materials and methods (D). Cont: control (culture media), LPS: lipopoly-saccharide (5 ㎍/ml), Veh: vehicle (acetonitrille), D5: 5 /7g/ml DDB, DIO: lOpg/ml DDB, D20: 20 /zg/ml DDB, D40: 40 //g/ml DDB.

성능/효과

1A, IB). 반면, NF-kB (p50)의 세포 내 농도가 DDB 40"g/ml군을 제외한 전체농도에서 농도 의존적으로 증가하였으며 핵 내 농도변화의 LPS와 대조하여 감소한 결과가 유지되는 것으로 관찰되었다(Fig. IB). 이러한 결과는 결국 DDB에 의해 NF-kB가 조절될 수 있음을 제시하는 것으로 생각된다.
이러한 결과는 결국 DDB에 의해 NF-kB가 조절될 수 있음을 제시하는 것으로 생각된다. 또한 NF-kB 활성화와 관계된 RBa의 세포질 내 농도를 관찰한 결과 LPS 처리 1시간 후 IkB가 degradation되어 상대적 농도가 낮게 관찰되 었으며 DDB 처리 시 에는 고농도(20, 40“g/ml)를 제외한 군에서 control과 유사한 패턴을 보였다. 이와 같은 결과는 LPS 및 DDB 처 리 9시간 후 UB 증가가 관찰되어 basal 상태로 신속히 복구되는 것으로 사료되며 특히 고농도에서 I /汨의 상대적 증가가 관찰되 었다(Fig.
2에서 NO의 농도와 iNOS의 발현은 상호 일치하는 결과가 인정되었고 특히 DDB 40"g/ml에서 의미 있는 결과가 관찰되었다. 이러한 결과는 NF-kB 활성억제 실험에서 확인되 었는데, NF- kB의 upstream 과정 인 IkB degra-dation과 관련하여 DDB 처리 시 시간이 경과함에 따라 RB의 농도가 조절되었고 이 결과 NF-kB의 활성화를 억 제하여 DDB가 NF-kB의 inactivation에 작용할 수 있음을 알 수 있었다(Fig. 1A, B, C). 이와 같은 결과는 DDB 처리 시 염증유발물질의 발현을 억제하여 항 염 효과를 예측할 수 있으며, 또한 NO에 의한 세포손상을 차단하여 세포보호 효과가 있음을 제시하고 있다.
2A에 나타난 바와 같이, DDB 처리군에서 NO의 억제가 용량 및 시간 의존적으로 나타났으며, 농도의 차이는 있었으나, 12 h 및 24 h에서 용량별 유사한 패턴을 보였다. 이러한 결과는 유전자발현(RT-PCR) 및 단백질 분석(Western blot)에서 보다 구체적인 비교를 실시하였으며, 결과적으로 Fig. 2B, 2C에서와 같이 DDB에 의한 iNOS gene expression 억제효과로부터 iNOS protein이 조절되고 있음을 알 수 있었다. 특히 40“g/ml에서 가장 효과적인 억 제가 관찰되었다.
1A, B, C). 이와 같은 결과는 DDB 처리 시 염증유발물질의 발현을 억제하여 항 염 효과를 예측할 수 있으며, 또한 NO에 의한 세포손상을 차단하여 세포보호 효과가 있음을 제시하고 있다. 따라서 이와 같은 결과가 뇌의 microglia로부터 얻어진 결과임을 고려할 때 만성염증에 의한 퇴행성 뇌질환 예방과 더불어 치매 치료요법제로 기대할 만한 물질로 기대된다.

후속연구

이와 같은 결과는 DDB 처리 시 염증유발물질의 발현을 억제하여 항 염 효과를 예측할 수 있으며, 또한 NO에 의한 세포손상을 차단하여 세포보호 효과가 있음을 제시하고 있다. 따라서 이와 같은 결과가 뇌의 microglia로부터 얻어진 결과임을 고려할 때 만성염증에 의한 퇴행성 뇌질환 예방과 더불어 치매 치료요법제로 기대할 만한 물질로 기대된다.
따라서 microglia 활성 화 억 제는 AD를 비롯한 다수의 퇴행성 뇌질환의 경과를 경감시키는 효과적인 접근법이라 할 수 있다(18). 본 연구에서 사용된 오미자 Schizandrin C 유도체 인 DDB가 항염증 효과를 가지는 선행연구로부터 microglia의 proinflammatory cytokine의 생성 억 제 여부를 조사하고자 하였으며, 오미자 활성 성분이 microglial cell에서 그■와 같은 상위개념의 항염효과를 가진다면 점차 증가 일로에 있는 노인성 치매 등에 효과적으로 활용할 수 있을 것으로 생각된다. 특히, DDB의 NF-kB의 활성억제를 통해 항염작용이 보고되고 있어(19), 본 연구에서는 LPS로 활성화시켜 염증 반응을 유도한 BV-2 microglial cell line에 Schizandrin C 유도체 DDB를 농도 별로 처리하였을 때 발생하는 pro inflammatory repertoire의 발현과 이러한 신호를 유도하는 NF- /cB signal transduction을 관찰하여 활성물질에 의한 NO 및 IL-18 억제작용을 확인하였다.

참고문헌 (26)

Zhu M, Lin KF, Yeung RY, Li RC: Evaluation of the protective effects of Schizandra chinensis of phase I drug metabolism using a $CCl_4$ intoxication model. J Ethnopharmacol 67; 61-68, 1999

상세보기
Molokovskii DS, Davydov VV, Tiulenev VV: The action of adaptogenic plant preparations in experimental alloxan diabetes. Probl Endokrinol 35;82-87, 1987
Jung GT, Ju IO, Choi JS, Hong JS: The antioxidative, antimicrobial and nitrite scavenging effects of Schizandra chinensis RUPRECHT (Omija) seed. Korean J Food Sci Technol 32;928-935, 2000

원문보기 상세보기
Kim OC, Jang HJ: Volatile components of Schizandra chinenesis Bullion. Agric Chem Biotechnol 37;30-36, 1994
Shoji K, Yasufumi O: Effect of gomicin A on liver generation. Planta Med 58;489-482, 1992

상세보기
Shoe HJ, Lee MY, Hwang GS: The effect of Scizandra fructus extract on blood constituents of alloxan-induced diabetes rabbits. J Korean Soc Food Nutr 24;658-662, 1995
Jang EH, Pyo YH, Ahn MS: Antioxidant effect of Omija extracts. Korean J Soc Food Sci 12;372-376, 1996
Kang KW, Kim YG, Kim CW, Kim SG: The anti-fibrogenic effect of a pharmaceutical composition of [5-(2-pyrazinyl)-4-methyl- 1,2-bithiol-3-thione] (oltipraz) and dimethyl-4,4'-dime thoxy-5, 6,5',6'-dimethylene dioxybiphenyl-2,2'-dicarboxylate (DDB). Arch Pharm Res 25;655-663, 2002

원문보기 상세보기
Lowenstein CJ, Dinerman JL, Snyder SH: Nitric oxide: a physiologic messenger. Ann Intern Med 120;227-237, 1994

상세보기
Tsoulfas G, Geller DA: NF-kappaB in transplantation: friend or foe. Transpl Infect Dis 3;212-219, 2001

상세보기
Hobbs AJ, Higgs A, Moncada S: Inhibition of nitric oxide synthase as a potential therapeutic target. Annu Rev Pharmacol Toxicol 39;191-220, 1999

상세보기
Shin HM, Kim MH, Kim BH, Jung SH, Kim YS, Park HJ, Hong JT, Min KR, Kim Y: Inhibitory action of novel aromatic diamine compound on lipopolysaccharide-induced nuclear translocation of NF-kappaB without affecting IkappaB degradation. FEBS Lett 571;50-54, 2004

상세보기
Yamamoto Y, Gaynor RB: IkappaB kinases: key regulators of the NF-kappaB pathway. Trends Biochem Sci 29;72-79, 2004

상세보기
Kreutzberg GW: Microglia a sensor for pathological events in the CNS. Trends Neurosci 19;312-318, 1996

상세보기
Kim HS, Whang SY, Woo MS, Park JS, Kim WK, Han IO: Sodium butyrate suppresses interferon-gamma, but not lipopolysaccharide- mediated induction of nitric oxide and tumor necrosis factor-alpha in microglia. J Neuroimmunol 151;85-93, 2004

상세보기
Meda L, Cassatella MA, Szendrei GI, Otvos LJr, Baron P, Villalba M, Ferrari D, Rossi F: Activation of microglial cells by beta-amyloid protein and interferon-gamma. Nature 374; 647-650, 1995

상세보기
Selkoe DJ: Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev 81;741-766, 2001

상세보기
Kim WK, Jang PG, Woo MS, Han IO, Piao HZ, Lee K, Lee H, Joh TH, Kim HS: A new anti-inflammatory agent KL-1037 represses proinflammatory cytokine and inducible nitric oxide synthase (iNOS) gene expression in activated microglia. Neuropharmacology 47;243-252, 2004

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Kang KW, Kim YG, Kim CW, Kim SG. The anti-fibrogenic effect of a pharmaceutical composition of [5-(2-pyrazinyl)-4- methyl-1,2-dithiol-3-thione] (oltipraz) and dimethyl-4,4'-demethoxy- 5,6,5',6'-dimethylene dioxybiphenyl-2,2'-dicarboxylate (DDB). Arch Pharm Res 25;655-663, 2004

원문보기 상세보기
Blasi E, Barluzzi R, Bocchini V, Mazzolla R, Bistoni F: Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus. J Neuroimmunol 27;229-237, 1990

상세보기
Bocchini V, Mazzolla R, Barluzzi R, Blasi E, Sick P, Kettenmann H: An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells. J Neurosci Res 31;616-621, 1992

상세보기
Petrova TV, Akama KT, Van Eldik LJ: Selective modulation of BV-2 microglial activation by prostaglandin E (2). Differential effects on endotoxin-stimulated cytokine induction. J Biol Chem 274;28823-288237, 1999

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Kim WK, Jang PG, Woo MS, Han IO, Piao HZ, Lee K, Lee H, Joh TH, Kim HS: A new anti-inflammatory agent KL-1037 represses proinflammatory cytokine and inducible nitric oxide synthase (iNOS) gene expression in activated microglia. Neuropharmacology 47;243-52, 2004

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Min KJ, Pyo HK, Yang MS, Ji KA, Jou I, Joe EH: Gangliosides activate microglia via protein kinase C and NADPH oxidase. Glia 1548;197-206, 2004
Furge LL, Fields PR, Goode WE, Konwinski RR, Tressler MC, Stevens-Truss R: Oltipraz inhibits inducible nitric oxide synthase in vitro and inhibits nitric oxide production in activated microglial cells. Arch. Biochem Biophys 424;163-170, 2004

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Joo SS, Won TJ, Lee DI: Potential role of ursodeoxycholic acid in suppression of nuclear factor kappa B in microglial cell line (BV-2). Arch Pharm Res 27;954-960, 2004

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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