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문제 정의
- 이와 같이 천연물로부터 추출한 성분들이 인체 내에서 생리활성을 나타냄으로써 기능성 소재로 활용이 점차 증가하고 있다. 따라서, 본 실험에서는 복분자 딸기의 미숙과 및 완숙과, 잎 등의 추출물을 사용하여 총 폴리페놀 함량 및 전자공여 작용, 아질산염 소거율, SOD유사활성, 항균 활성 등을 확인함으로써 생리활성을 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 1회용cuvette(100½ micro disposable cuvettes, Germany)에추출물 0.9mL를 취하고 여기에 10mM HC1 을 용매로 하여 제조한 20 mM pyrogallol(1, 2, 3-benzenetriol, Simga, Co.)용액을 0.1 ml가하여 1 mL pippet으로 3회 혼합한 후 실온을 유지하면서 420NM에서 2분간 흡광도 변화를 측정하였다. SOD 유사활성은 TCB 0.
- 또한, 동결건조시킨 복분자 딸기의 미숙과 및 완숙과, 잎을 80% 메탄올 및 75% 아세톤 및 열수로 추출했을 때 주출물간의 SOD 유사 활성 정도를 비교하기 위하여 각 시료 5g을 Fig. 1의 방법에 따라 추출한 후 증류수를 첨가하고 최종 50mL로 제조하여 추출물간의 SOD 유사 활성을 비교하였다.
- 0으로 조정하여 총 부피가 10mL가 되도록 한 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응액을 각각 I mL씩 취하고 여기에 2% acetic acid 5mL와 griess 시약 0.4mL를 가한 후 실온에서 빛을 차단하여 15분간 방치시킨 후 520nm에서 흡광도를 측정하여 잔존하는 아질산염량을 구하였다. Griess 시약은 sulfanilic acid (Sigma, Co.
- 복분자 딸기의 미숙과 및 완숙과, 잎 추출물의 SOD 유사활성은 pyrogallol의 자동산화가 SOD 유사 활성 물질의 첨가에 의해 산화 속도가 억제되는 원리를 이용한 Marklund의 방법(21)을 변형하여 사용하였다. 즉, 동결건조시킨 복분자딸기의 미숙과 및 완숙과, 잎을 각각 0.
- 복분자 딸기의 미숙과 및 완숙과, 잎 추출물의 전자공여능은 추출물 각각 0.2 mL에 4X10-4 M DPPH 용액 0.8 mL (absolute ethanol 용해)를 가한 후 vortex mixer로 10초간 진탕하고 실온에서 10분 방치 후 분광광도계를 사용하여 525nm에서 흡광도를 측정하였다(19). 전자공여 효과는 시료첨가구와 첨가하지 않은 경우의 흡광도를 아래식에 따라 백분율로 나타내었다.
- 복분자 딸기의 미숙과 및 완숙과, 잎의 추출물은 Fig. 1과 같이 메탄올, 아세톤, 열수처리구로 나누어 조제하였다(17). 메탄올 추출물은 각 시료 1g을 사용하여 80% 메탄올 300 mL에 현탁시킨 후 8CTC에서 1시간 환류추출하고 여과하였다.
- 여액은 유기용매가 완전히 휘발될 때까지 감압농축하고 원심분리(13, 000 rpm, 15 min)하여 100 mL로 정용한 후 1 mL씩 microtube에 나누어 냉동 보관하였다. 아세톤 추출물은 각 시료lg을 75% 아세톤 300 mL에 현탁시키고 70℃에서 1시간 환류추출한 후 메탄올 추출물과 동일한 방법으로 처리하였으며, 열수 추출물은 증류수 300 mL에 각 시료 lg을 현탁시킨 후 70℃에서 1시간 환류추출하여 메탄올 추출물과 같은 방법으로 처리하였다. 이렇게 제조한 시료는 전자공여작용, 총 폴리페놀 화합물 함량, 아질산염 소거능 시험의 시료로 사용하였다.
- )을 각각 1% 상당량 정량한 후 100% 초산을 첨가하여 교반용해시키고 30% 초산이 되도록 일정량을 정용하여 사용 직전에 조제하였다. 아질산염 소거율은 시료용액을 첨가한 경우와 첨가하 지 않은 경우의 흡광도를 백분율로 나타내었으며 대조구로는 비타민C 10mg/100g을 사용하였다.
- . 즉, 각각의 추출물 0.1 mL에 증류수 8.4 mL와 2 N FoHn- Ciocalteu's 시약(Sigma Co.) 0.5 mL를 첨가하고 20% Na2CO3 1 mL를 가하여 1시간 방치 후 725nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 galHc acid(Sigma Co.
- 추출물의 항균 활성은 paper disk를 이용한 agar diffusion test를 사용하였다. 즉, 대수기에 도달한 균을 g당 107으로 희석하여 petri dish에 20μl씩 접종한 후 멸균시킨 배지lOmL를 pouring하고 멸균된 paper disk(8 mm thick, Advantec)를 주 줄액 에 2초간 침지하여 plate상에 접착시키고 42시간 동안 37℃에서 배양한 후 clear zone의 직경(mm)을 즉정하여 항균력을 비교하였다.
- 변형하여 사용하였다. 즉, 동결건조시킨 복분자딸기의 미숙과 및 완숙과, 잎을 각각 0.4g씩 취한 후 tris ami-nomethane(Sigma, Co.)와 cacodylic acid(Sigma, Co.)로 제조한 50 mM tris-cacodylic acid buffer(TCB, pH 8.20) 30 mL를 가하여 실온에서 1시간 동안 shaking incubation 시킨 후 10,000rpm에서 30분간 원심분리하여 그 상등액을 여과한 후 pH 8.2으로 조절하여 SOD 유사 활성 측정을 위한 추출물로 사용하였다.
- 5 mL를 첨가하고 20% Na2CO3 1 mL를 가하여 1시간 방치 후 725nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 galHc acid(Sigma Co.)를 이용하여 추출 용매별로 100 mg% stock solution을 제조한 후 20, 40, 60, 80 mg%가 되도록 희석하여 측정하였다.
대상 데이터
- 복분자 딸기의 미숙과 및 완숙과, 잎의 항균 활성 측정을 위한 추출물은 SOD 유사 활성 측정에 사용한 시료를 사용하였다. 시험 균주로는 Escherichia coll Olli, Salmonella typh- imurim ATCC13311, Bacillus cereus SKK12, Staphylococcusaureus SKK14를 가축위생연구소와 성균관대학교 응용 미생물 연구실로부터 분양받아 사용하였으며, nutrient broth(Difco.
- 본 실험에 사용한 복분자 딸기 (Rubus coreanus Miq.)의 미숙과 및 완숙과, 잎은 2000년6, 7월에 고창군 심원면에서 채취하여 동결건조한 후 미숙과와 완숙과는 분쇄기로 분쇄하였고, 잎은 ball mill로 분쇄하여 빛을 차단시킨 desicatoi에보관하면서 사용하였다.
- 추출물은 SOD 유사 활성 측정에 사용한 시료를 사용하였다. 시험 균주로는 Escherichia coll Olli, Salmonella typh- imurim ATCC13311, Bacillus cereus SKK12, Staphylococcusaureus SKK14를 가축위생연구소와 성균관대학교 응용 미생물 연구실로부터 분양받아 사용하였으며, nutrient broth(Difco. Co.)에 agar가 0.7% 되도록 조제하여 실험하였다. 추출물의 항균 활성은 paper disk를 이용한 agar diffusion test를 사용하였다.
- 아세톤 추출물은 각 시료lg을 75% 아세톤 300 mL에 현탁시키고 70℃에서 1시간 환류추출한 후 메탄올 추출물과 동일한 방법으로 처리하였으며, 열수 추출물은 증류수 300 mL에 각 시료 lg을 현탁시킨 후 70℃에서 1시간 환류추출하여 메탄올 추출물과 같은 방법으로 처리하였다. 이렇게 제조한 시료는 전자공여작용, 총 폴리페놀 화합물 함량, 아질산염 소거능 시험의 시료로 사용하였다.
이론/모형
- 복분자 딸기의 미숙과 및 완숙과, 잎 추출물의 아질산염 소거능은 kato등(20)의 방법에 따라 측정하였다. 즉, ImM NaNO2용액 2mL에 각각의 추출물 1 mL를 가하고 0.
- 복분자 딸기의 미숙과 및 완숙과, 잎 추출물의 총 폴리페놀 화합물 함량은 Folin-Ciocalteu's 방법에 따라 측정하였다(18). 즉, 각각의 추출물 0.
- 7% 되도록 조제하여 실험하였다. 추출물의 항균 활성은 paper disk를 이용한 agar diffusion test를 사용하였다. 즉, 대수기에 도달한 균을 g당 107으로 희석하여 petri dish에 20μl씩 접종한 후 멸균시킨 배지lOmL를 pouring하고 멸균된 paper disk(8 mm thick, Advantec)를 주 줄액 에 2초간 침지하여 plate상에 접착시키고 42시간 동안 37℃에서 배양한 후 clear zone의 직경(mm)을 즉정하여 항균력을 비교하였다.
성능/효과
- 36%로 미숙과 가 전자공여능이 가장 우수한 것으로 나타났다. 80% 메탄올과 75% 아세톤으로 추출한 유기용 매 추출물에서는 미숙과 92.59-92.61%, 완숙과 82.31-82.64%, 잎 84.46~88.36%의 전자공여 효과를 나타내었으나 열수 추출물은 미숙과 91.90%, 완숙과 88.93%, 잎 85.60% 순으로 전자공여 효과를 나타내어 복분자딸기를 유기용매로 추출했을 때와 열수로 추출했을 경우 전자공여 효과가 시료에 따라 다른 경향을 나타냄을 알 수 있었다. 일반적으로 폴리페놀 함량이 증가하면 전자공여능도 증가하는 것으로 알려져 있으나 본 실험에서 열수 추출물의 경우 미숙과 및 완숙과의 총 폴리페놀 함량은 낮았슴에도 전자공여능은 높게 나타났다.
- 85%에 비하여 높은 활성을 나타내었다. Table 4, 5에 나타낸 바와 같이복분자딸기 완숙과 추출물이 TCB로 추출한 경우 91.72%, 추출 용매를 달리하여 추출한 경우 41.12~43.39%로 전체적으로 완숙과 추출물에서 높은 SOD유사활성을 나타내는 것을 알 수 있었다. 복분자 딸기는 성숙되어감에 따라 검붉은 색으로 완숙되어지는데 앞서 언급한 바와 같이 이러한 색소성분이 항산화 성과 관련하여 여러 가지 기능적 역할을 수행하는 것으로 생각되어진다.
- 2일 때 가장 높은 아질산염 소거율을 나타내었다. pH 1.2의 조건에서 미숙과의 아질산염 소거율은 80% 메탄올 추출물이 63.24%, 75% 아세톤 추출물은 60.56%로 완숙과나 잎에 비하여 높은 값을 나타내었고, 열수 추출물에서는 잎이 49.83%로 미숙과와 잎에 비하여 높은 아질산염 소거율을 나타내었다. 복분자 딸기의 SOD유사활성은 완숙과가 미숙과나 잎에 비하여 모든 추출 조건에서 높은 SOD 유사 활성을 나타내었다.
- 21g에 비하여 높은 값을 나타내었다. 국내산 식물성 식품 중의 총 폴리페놀 화합물 함량을 분석한 결과를 보면 모과(1.18g), 밤속 껍질(5.16g), 감잎(5.24 g) 등에서 비교적 높은 농도로 조사되어 이것과 비교하였을 때 복분자 딸기는 폴리페놀 화합물이 3.21~5.87g으로 높은 함량을 나타냄을 알 수 있었다(22). 선인장의 경우에는 씨 1.
- 이상의 결과로 볼 때 위장내의 낮은 pH 조건에서는nitrosamino] 쉽게 형성되므로 이와 같이 낮은 pH 에서의 아질산염 소거율이 큰 것은 nitrosamine 형성을 효과적으로 억제하는 것으로 판단된다. 대조군으로 사용한 vitamin C, 10 mg의 아질산염 소거율은 pH 1.2에서 99.67%였으며, pH 4.2에서는 88.00%, pH 6.0의 조건에서는 67.16%으로 나타났다.
- 복분자 딸기의 SOD유사활성은 완숙과가 미숙과나 잎에 비하여 모든 추출 조건에서 높은 SOD 유사 활성을 나타내었다. 복분자 딸기 추출물의 항균 활성을 조사하기 위하여 E. coli, S. typhimurium, B. cereus, S. aureus를 시험균주로 하여 agar diffusion test를 실시한 결과 모든 주줄물이 B. cereus에서만 높은 항균 활성을 나타내었다.
- Table 4와 같다. 복분자 딸기는 완숙과 추출물이 91.72%의 높은 SOD유사활성을 나타내었으며 미숙과 추출물 65.21%, 잎 추출물은 41.50% 순으로 나타났다. 엽경채류, 차류, 과채류 및 약용식물류 등 총 55개의 식물성 식품의 추출물을 대상으로 Marklund의 방법으로 SOD유사활성을 측정한 결과 복분자 딸기 미숙과 추출물의 경우 18.
- 복분자 딸기는 전체적으로 82.31~92.61%의 높은 전자공여효과를 나타내었으며 추출용매에 따른 차이는 크지 않는 것으로 밝혀졌다. 이는 솔잎의 열수 추출물과 70% 아세톤 추출물의 전자공여 효과는 각각 80.
- 83%로 미숙과와 잎에 비하여 높은 아질산염 소거율을 나타내었다. 복분자 딸기의 SOD유사활성은 완숙과가 미숙과나 잎에 비하여 모든 추출 조건에서 높은 SOD 유사 활성을 나타내었다. 복분자 딸기 추출물의 항균 활성을 조사하기 위하여 E.
- 38 g으로 가장 높은 값을 나타내었다. 복분자 딸기의 전자공여능은 추출용매에 따른 차이는 보이지 않았으며, 전체적으로 미숙과가완숙과나 잎에 비하여 90% 이상의 높은 전자공여능을 나타내었다. 복분자딸기의 아질산염 소거능을 pH 1.
- 추출 용매에 따른 복분자 딸기의 미숙과 및 완숙과 및 잎의 건물 기준 100g 당 총 폴리페놀 화합물 함량을 측정한 결과는 Table 1과 같다. 복분자 딸기의 총 폴리페놀 화합물 함량은 전체적으로 높은 함량을 나타내었으며, 추출용매별로 폴리페놀 화합물은 75% 아세톤 추출물이 5.06~5.87 g으로 80% 메탄올 추출물 3.21-5.02 g, 열수 추출물 3.76~5.21g에 비하여 높은 값을 나타내었다. 국내산 식물성 식품 중의 총 폴리페놀 화합물 함량을 분석한 결과를 보면 모과(1.
- typhimurium에 대해서 활성을 가지고 있다는 보고(33)와 비교하여 다른 결과를 나타내었다. 복분자 딸기의 항균 활성을 추출용매별로 보면 80% 메탄올 추출물의 clear zone이 9.5~ 16.95 mm, 75% 아세톤 추출물은 12.95~16.65 mm로 10.65-13.75 mm를 나타낸 열수 추출물보다 다소 높은 항균 효과를 보였다. 오미자 종자의 메탄올, 에탄올, 에틸아세테이트, 열수 추출물의 실험 결과 B.
- 복분자딸기 추출물은 모두 Bacillus cereus에서만 높은 항균 효과를 나타내었으며 미숙과 추출물의 clear zone은 13.75~16.95 mm, 완숙과 추출물은 10.65-16.65 mm, 잎 추출물은 9.5-12.95 mm를 나타내었다. 이는 한약재 190종을 메탄올로 추출하여 그람양성세균4종, 그람 음성세균 3종, 효모 2종, 곰팡이 3종에 대한 항균활성을 측정한 결과 복분자 추출물이 P.
- 복분자딸기의 미숙과 및 완숙과, 잎 추출물은 pH 1.2의 조건에서 전체적으로 41.25~63.24%로 가장 높은 소거율을 나타내었으며 pH 4.2에서는 1.59-10.99%, pH 6.0에서는 -2.84-7.94%로 pH가 증가할수록 소거율이 크게 감소하여 추출물에 따른 pH 의존적인 경향을 나타내었다. 이는 솔잎과 쑥, 결명자에서도 pH가 낮을수록 아질산염 소거작용이 높고, pH 1.
- 복분자 딸기의 전자공여능은 추출용매에 따른 차이는 보이지 않았으며, 전체적으로 미숙과가완숙과나 잎에 비하여 90% 이상의 높은 전자공여능을 나타내었다. 복분자딸기의 아질산염 소거능을 pH 1.2, 4.2, 6.0의 조건으로 조사한 결과 pH 1.2일 때 가장 높은 아질산염 소거율을 나타내었다. pH 1.
- 54g의 총폴리페놀화합물을 함유하고 있어 주로 열매에 폴리페놀 함량이 높은 것으로 보고하였다(23,24). 본 실험에서는 유기용매로 추출한 복분자딸기의 경우 잎에 비하여 열매인 미숙과와 완숙과 가 4.70 ~5.87g으로 상대적으로 높은 폴리페놀 화합물 함량을 나타내어 위의 보고 등과 유사한 경항을 나타내었다. 그러나 열수 추출물의 경우에서는 잎의 총 폴리페놀 화합물 함량이 5.
- aureus 순으로 강하여 항균성 물질을 추출하는데 메탄올이 효과적이었다고 보고하였다(35)(박주성 등, 1999). 본 실험에서도 메탄올과 아세톤 추출의 경우가 열수 추출의 경우보다 항균력이 약간 우세하게 나타내었으나 B. cereus에서만 항균 활성을 나타내어 위의 보고 등과는 다른 결과를 보여주었다.
- 6%로 나타나 큰 차이가 없었다고 보고(26)된 것과 유사한 경향을 나타내었다. 시료별로 전자공여 효과를 살펴보면 미숙과는 91.90-92.61%, 완숙과는 82.31-88.93%, 잎의 경우는 85.60~88.36%로 미숙과 가 전자공여능이 가장 우수한 것으로 나타났다. 80% 메탄올과 75% 아세톤으로 추출한 유기용 매 추출물에서는 미숙과 92.
- 0으로 pH 의존적이며 아질산염 소거율 역시 강산성에서 높고 pH가 높아질수록 감소하는 것으로 보고한 결과와도 동일한 경향을 나타내었다(29). 이상의 결과로 볼 때 위장내의 낮은 pH 조건에서는nitrosamino] 쉽게 형성되므로 이와 같이 낮은 pH 에서의 아질산염 소거율이 큰 것은 nitrosamine 형성을 효과적으로 억제하는 것으로 판단된다. 대조군으로 사용한 vitamin C, 10 mg의 아질산염 소거율은 pH 1.
- 이상의 결과를 요약하면 총 폴리페놀 함량의 경우 80% 메탄올 추출물과 75% 아세톤 추출물의 경우 완숙과 및 미숙과, 잎의 순으로 높게 나타나 아질산염 소거능 및 SOD유사활성, 항균력과 비슷한 경향을 나타냈다. 그러나, 총 폴리페놀 함량과 전자공여능은 유의성이 없는 결과를 보여 추출용매에 따라 폴리페놀 성분이외에 전자공여에 관여하는 물질이 존재하기 때문으로 판단되었다.
- 60% 순으로 전자공여 효과를 나타내어 복분자딸기를 유기용매로 추출했을 때와 열수로 추출했을 경우 전자공여 효과가 시료에 따라 다른 경향을 나타냄을 알 수 있었다. 일반적으로 폴리페놀 함량이 증가하면 전자공여능도 증가하는 것으로 알려져 있으나 본 실험에서 열수 추출물의 경우 미숙과 및 완숙과의 총 폴리페놀 함량은 낮았슴에도 전자공여능은 높게 나타났다. 이와 같은 결과는 추출용매에 따라 폴리페놀이외에 다른 전자공여물질이 동시에 추출되었기 때문으로 판단된다.
- 즉, 총 폴리페놀 함량은 추출용매에 의한 차이는 보이지 않았고 전체적으로 복분자 딸기의 잎에서 높은 총 폴리페놀 함량을 나타내었으며, 특히 75% 아세톤으로 추출한 경우 잎에서 건물 기준으로 100 g당 11.38 g으로 가장 높은 값을 나타내었다. 복분자 딸기의 전자공여능은 추출용매에 따른 차이는 보이지 않았으며, 전체적으로 미숙과가완숙과나 잎에 비하여 90% 이상의 높은 전자공여능을 나타내었다.
- 추출용매에 따른 SOD유사활성 정도를 비교해보면 미숙과 추출물의 경우 전체적으로 29.71-31.86%, 완숙과 추출물은 41.12- 43.39%를 나타내어 추출용매에 따른 뚜렷한 차이를 보이지 않았으나 잎 추출물의 경우는 열수 추출물이 27.95%로 80% 메탄올 추출물 10.13%, 75% 아세톤 추출물 18.85%에 비하여 높은 활성을 나타내었다. Table 4, 5에 나타낸 바와 같이복분자딸기 완숙과 추출물이 TCB로 추출한 경우 91.
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