식이지방산 조성 및 비타민 E의 보충이 제 2 세대 흰 쥐 뇌조직의 항산화 체계에 미치는 영향 Effect of Dietary Fatty Acid and Vitamin E Supplementation in Antioxidant Systmes of the Second Generation Rat Brain Sections원문보기
In this study, we examined the effects of dietary fatty acids and vitamin E supplementation on antioxidant systems in the rat brain regions. The Sprague Dawley rats were fed the experimental diets 3-4 wks prior to the conception. Experimental diet consisted of 10% fat(wt/wt) which were safflower oil...
In this study, we examined the effects of dietary fatty acids and vitamin E supplementation on antioxidant systems in the rat brain regions. The Sprague Dawley rats were fed the experimental diets 3-4 wks prior to the conception. Experimental diet consisted of 10% fat(wt/wt) which were safflower oil(SO, poor in $\omega$3 fatty acids), mixed oil(MO, P/M/S ratio=1.03:1.45:1,$\omega$6/$\omega$3 ratio=6.3) and mixed oil supplemented with vitamin E(ME:MO+500mg vitamin E/kg diet). At 3 and 9 weeks of age of the newborn rats, frontal cortex(FC), corpus striatum(CS), hippocampus(H) cerebellum(CB) were dissected out from the whole brain. Activities of glutathione peroxidase(GSH-P(sub)x, superoxide dismutase(SOD) concentrations of malondialdehyde(MDA) were mesaured. Dietary fatty acids were not effective in antioxidative system for rat brain. However, when vitamin E was supplemented to the diet(ME), the activities of GSH-P(suh)x tended to increase in comparison to MO group. Therefore, the activites of GSH-P(suh)x of FC and H at the age of 3 weeks showed significant differences(p<0.05). The activities of Total-SOD tended to decrease in ME group compared to MO group. There were significant differences(p<0.05) in FC and CS at the age of 3 weeks. The activities of Mn-SOD tended to increase and Cu, Zn-SOD tended to decrease when vitamin E was supplemented. The activity levels of antioxidative enzymes at the age of 3 weeks and 9 weeks were similar. This suggested that the activity level of antioxidative enzymes reached to the adult level at the age of 3 weeks which is the end point of lactation period. The concentrations of MDA were not altered by experimental diets. When the activities of antioxidant enzymes were compared, the activities of antioxidant enzymes were the lowest in H and FC. In conclusion, the antioxidative system were not altered by dietary fatty acid at the age of 3 weeks and 9 weeks, but the supplementation of vitamin E altered the antioxidative systems. Therefore, these findings should be considered comprehensively in scope of the balance of various antioxidative systems and their interactions(Korean J Nutrition 34(1):14-22, 2001)
In this study, we examined the effects of dietary fatty acids and vitamin E supplementation on antioxidant systems in the rat brain regions. The Sprague Dawley rats were fed the experimental diets 3-4 wks prior to the conception. Experimental diet consisted of 10% fat(wt/wt) which were safflower oil(SO, poor in $\omega$3 fatty acids), mixed oil(MO, P/M/S ratio=1.03:1.45:1,$\omega$6/$\omega$3 ratio=6.3) and mixed oil supplemented with vitamin E(ME:MO+500mg vitamin E/kg diet). At 3 and 9 weeks of age of the newborn rats, frontal cortex(FC), corpus striatum(CS), hippocampus(H) cerebellum(CB) were dissected out from the whole brain. Activities of glutathione peroxidase(GSH-P(sub)x, superoxide dismutase(SOD) concentrations of malondialdehyde(MDA) were mesaured. Dietary fatty acids were not effective in antioxidative system for rat brain. However, when vitamin E was supplemented to the diet(ME), the activities of GSH-P(suh)x tended to increase in comparison to MO group. Therefore, the activites of GSH-P(suh)x of FC and H at the age of 3 weeks showed significant differences(p<0.05). The activities of Total-SOD tended to decrease in ME group compared to MO group. There were significant differences(p<0.05) in FC and CS at the age of 3 weeks. The activities of Mn-SOD tended to increase and Cu, Zn-SOD tended to decrease when vitamin E was supplemented. The activity levels of antioxidative enzymes at the age of 3 weeks and 9 weeks were similar. This suggested that the activity level of antioxidative enzymes reached to the adult level at the age of 3 weeks which is the end point of lactation period. The concentrations of MDA were not altered by experimental diets. When the activities of antioxidant enzymes were compared, the activities of antioxidant enzymes were the lowest in H and FC. In conclusion, the antioxidative system were not altered by dietary fatty acid at the age of 3 weeks and 9 weeks, but the supplementation of vitamin E altered the antioxidative systems. Therefore, these findings should be considered comprehensively in scope of the balance of various antioxidative systems and their interactions(Korean J Nutrition 34(1):14-22, 2001)
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문제 정의
두뇌와 성장 발달은 동물에 따라 차이가 있으며 쥐의 경우 사람과는 달리 수유기에 가장 활발하여 출생 후 10일경 에 최대에 이르게 되며, 쥐의 수유기는 사람의 pre-term과 유사하므로, 쥐의 수유기에 대한 연구는 infant 특히 미숙 아에게 적용시킬 수 있을 것으로 보인다. 따라서 본 연구에서는 어미 삭이의 조성을 달리하여 임신되기 3~4주 전부터 섭취시키고, 이로부터 출생한 새끼 쥐도 어미와 같은 실험 삭이를 공급하여, 서로 다른 지방산 조성과 비타민 E의 첨가 식이가 제2세대 쥐 뇌조직의 항산화 체계에 미치는 영향에 대하여 알아보고자 하였다.
가설 설정
Fig 2. Glutathione peroxidase activities in the rat brain regions at the age of 3 & 9 weeks. FC : Frontal cortex, CS : Corpus striatum, CB : Cerebellum, 버 : Hippocampus, SO : Safflower oil MO : Mixed oil, ME : MO+vitamin E.
제안 방법
1ml 취하였다. 08ml 반응 혼합물 (4, 5mM EDTA, 4.7mM sodium azide를 포함한 0.125M phosphate buffer, pH 7.0과 2.8nM NADPH, 49.9nM reduced glutathione, 0.67 units glutathione reduc- tase를 함유)을 가한 후, 0.25mM H2O2 0.1m}을 가하여 반응을 일으킨 즉시 spectrophotometer를 이용하여 파장 340nm에서 산화형 glutathione(GSSG)2] 형성에 따론 NADPH의 흡광도가 감소되는 속도를 3분동안 측정하였다. GSH-Px의 존재 하에 HQ?의 첨가에 의하여 환원형 glutathione(GSH)이 생성되고, reaction mixture 내 glutathione reducts迎e와 NADPH가 개입되어 GSSG가 다시 GSH로 환원되는 속도를 흡광도의 변화를 통해서 관찰함으 로써 GSH-Px의 활성을 산출하였다.
2) Superoxide dismutase(SOD) 활성 즉정 SOD활성은 Marklund이와 Sheri171^ 방법을 수정하여 pyrogallol의 autooxidation을 SOD가 억제하는 정도를 통하여 측정하였다. Total SOD 활성을 측정하기 위해 뇌.
GSH-Px 활성은 Pagli武와 DeagerW의 방법을 수정하여 과산화수소를 기질로 이용한 coupled enzyme proce- dure로 측정하였다. 뇌조직 0.
Sprague Dawley strain을 이용하여 3일간 시판 배합사 료를 주어 환경에 적응시킨 뒤 임신 3~4 주 전부터 실험 식이를 공급한 뒤 교배시켰다. 각 어미로부터 출생한 새끼 쥐는 출생 3일 후 8~10마리로 수를 조절하였다. 출생 후 어미와 같은 실험 식이를 공급하여 생후 3주와 9주에 각각 희생시킨 뒤 두뇌를 적출하여 부위별로 분석에 이용하였다.
식이 지방 수준은 전체 무게의 10%로서, 旎계 지방산을 결핍시킨 군(safflower Oil: SCO과 o)3 및 <o6계 지방산을 적절한 비율로 공급한 군(mixed Oil: MO). 비타민 E를 보충한 군(MO + 비타민 E: ME)으로 분류하였다. 여러 종류의 기름의 지방산 조성을 computer에 입력하여 바람 직한 P/M/S 및(o6/o)3 지방산의 비율을 갖춘 혼합 기름 중 배합되는 기름의 종류 수가 비교적 적은 것을 선택하였다.
Table 2에는 실험식이의 지방산 조성을 나타내었다. 비타민 E의 수준은 모든 군에 50mg a-tocopherol acetate/kg diet을 기본적으로 첨가하였고. 비타민 E를 보충 한 군(ME)에서는 50〔)mg의 a-tocopherol acetate/kg diet 을 더 보충하였다.
비타민 E를 보충한 군(MO + 비타민 E: ME)으로 분류하였다. 여러 종류의 기름의 지방산 조성을 computer에 입력하여 바람 직한 P/M/S 및(o6/o)3 지방산의 비율을 갖춘 혼합 기름 중 배합되는 기름의 종류 수가 비교적 적은 것을 선택하였다. 본 연구에 사용한 MO군의 지방산 조성은 P/M/S 비율이 1.
1m}을 가하여 반응을 일으킨 즉시 spectrophotometer를 이용하여 파장 340nm에서 산화형 glutathione(GSSG)2] 형성에 따론 NADPH의 흡광도가 감소되는 속도를 3분동안 측정하였다. GSH-Px의 존재 하에 HQ?의 첨가에 의하여 환원형 glutathione(GSH)이 생성되고, reaction mixture 내 glutathione reducts迎e와 NADPH가 개입되어 GSSG가 다시 GSH로 환원되는 속도를 흡광도의 변화를 통해서 관찰함으 로써 GSH-Px의 활성을 산출하였다. 효소 1 uwite 혈청 1ml당 1 분동안 산화된 NADPH의 n血로 나타내었고, specific activity는 Img 단백질에 해당하는 효소 unit으로 환산 하였다.
상층액 20μ1에 Tris buffer 3ml과 pyrogallol 2014를 순서 대로 가한 후 거꾸로 세워 혼합하였다. 이 혼합액을 Gilford Spectrophotometer(Stasar DI, 1220)를 이용하여 파장 420nm에서 5분동안 흡광도가 증가되는 정도를 측정하였다. Enzyme 1 unit는 pyrogallol의 auto oxidation 을 50% 방해하는데 필요한 효소의 양으로서 산출하고 specific activity는 cytos시의 Img protein에 해당하는 enzyme unit로 환산한다.
이 혼합액을 원심분리(4000rpm, 10분간) 하고’ 침전물에 증류수 5ml과 1% thiobarbituric acid 2ml을 가한 후 90~9EC에서 20분간 incubation시켰다. 이를 냉각시킨 후 n-butanol 5ml을 가하여 vortex한 후 원심분리 (4000rpm, 10분간)하여 상층와 butanol층을 luminescence spectrophotometer(Amico Bowman series)^- 이용하여 excitation 500nm, emission 553nm에서 fluorescence intensity를 측정한 후 표준용액과 비교하여 비색 정량하였다.
각 어미로부터 출생한 새끼 쥐는 출생 3일 후 8~10마리로 수를 조절하였다. 출생 후 어미와 같은 실험 식이를 공급하여 생후 3주와 9주에 각각 희생시킨 뒤 두뇌를 적출하여 부위별로 분석에 이용하였다.
ME군)식이로 임신되기 3~4주 전부터 섭취시키고, 이로부터 출생한 제 2세대 쥐의 뇌조직 을 전두피질(FC), 선조체(CS). 해마(H), 소뇌(CB)의 4부 위로 나누어 항산화효소 및 MDA을 측정하였다. 연구 결과는 다음과 같다.
GSH-Px의 존재 하에 HQ?의 첨가에 의하여 환원형 glutathione(GSH)이 생성되고, reaction mixture 내 glutathione reducts迎e와 NADPH가 개입되어 GSSG가 다시 GSH로 환원되는 속도를 흡광도의 변화를 통해서 관찰함으 로써 GSH-Px의 활성을 산출하였다. 효소 1 uwite 혈청 1ml당 1 분동안 산화된 NADPH의 n血로 나타내었고, specific activity는 Img 단백질에 해당하는 효소 unit으로 환산 하였다.
대상 데이터
여러 종류의 기름의 지방산 조성을 computer에 입력하여 바람 직한 P/M/S 및(o6/o)3 지방산의 비율을 갖춘 혼합 기름 중 배합되는 기름의 종류 수가 비교적 적은 것을 선택하였다. 본 연구에 사용한 MO군의 지방산 조성은 P/M/S 비율이 1.03 : 1.45 : 1. (t)6/(o3 비율은 6.
비타민 E를 보충 한 군(ME)에서는 50〔)mg의 a-tocopherol acetate/kg diet 을 더 보충하였다. 비타민 mixture와 무기질 mixture는 AIN-76을 사용하였다.
뇌조직은 불포화지방산의 보고이며 산소 소모량이 많고 또한 Fe/Cu와 blood brain barrier의 존재는 뇌의 항산화 system에 대한 관심을 집중시킨다. 이에 본 연구에서는 co3계 지방산 결핍군인 safflower oil(SO)군. 지방산을 바 람직한 비율로 공급한 mixed oiKMO.
데이터처리
으로 표시하였다. 뇌 조직 부위 별 항산화 효소의 활성 및 MDA 농도는 oneway analysis of variance(ANOVA) 및 Duncan's Multiple Test를 실시하여 실험 군간의 비교와 함께 두뇌 부위 별로 비교하였다.
성능/효과
1) 뇌조직 부위별 항산화 체계에서 식이지방산 차이에 따른 효과는 없었으나 비타민 E의 보충 효과가 나타나 비 타민 E의 첨가시(ME군) GSH-Px의 활성이 MO군에 비하여 증가하는 경향을 보여, 이는 생후 3주의 전두피질(FC)과 해마(H)에서 유의적인 차이를 나타내었다.
3) 항산화효소의 활성이 생후 3주와 9주 수준이 유사하 여, 수유기가 끝나는 생후 3주에 이미 성숙한 쥐의 수준에 미침을 알 수 있었다.
4) 뇌조직 부위별로 비교하면 항산화효소의 활성을 비교 하면 해마(H)에서 가장 낮았고, 전두피질(FC)에서 가장 卷았다.
5) MDA농도는 식이 지방산 조성과 비타민 E의 보충 식 아에 영향을 받지 않아 뇌조직의 모든 부위에서 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
고 하였다. Catalase는 생후 5일에 최대 활성을 보였으며 , GSH-Px는 생후 첫 주에 증가하다가 생후 45일에 adult 수준에 도달하였음을 관찰하였다. Hussain 등‘가은 뇌 부위 별로 항산화 효소의 활성을 관찰한 연구에서 1.
2) Mn-SOD. Cu, Zn-SOD의 활성은 서로 다르게 나타 나, Mn-SOD의 활성은 ME군에서 증가하는 경향을 나타 내어, 생후 9주의 전두피질(FC), 생후 3주의 해마(H)에서 유의적인 차이를 나타내었고, Cu, Zn-SOD 는 감소하는 경향을 보여, 생후 3주의 전두피질(FC)과 선조체(CS)에서 비타민 E의 보충시 유의적으로 감소되었다. Total-SOD의 활성도 Cu, Zn-SOD의 활성과 같은 경향을 보여, MO군 에 비하여 ME군에서 감소되는 경향을 나타내었다.
Total-SOD의 활성은 SO, MO. ME군 모두 다른 뇌부 위 조직보다 해마(H)에서 유의적으로(p<0.05) 낮흔 활 성을 보였고, 전두피질(FC)에서 가장 높은 활성을 나타내 었다(Fig. 1). 또한 뇌조직 부위별 GSH-Px활성의 차이를 살펴보면(Fig.
Cu, Zn-SOD의 활성을 나타내었 는데, 전반적으로 식이지방산은 SOD활성에는 유의한 영향을 미치지 못하였다. Mn-SOD의 활성은 전체적으로 비타 민 E를 첨가한 ME군에서 낮아지는 경향을 볼 수 있었고, 이는 생후 3주의 해마H)와 생후 9주에의 전두피질(FC)에서 유의적으로 낮았다(p<0.05). Cu.
Zn-SOD의 활성은 전두피질(FC), 선조체(CS)에서 비타민 E를 보충한 ME군 에서 MO군보다 유의적으로 낮은데 이는 여분의 비타민 E가 Cu, Zn-SOD의 항산화역할을 분담해 준 것으로 풀이 된다. Total SOD의 활성은 비타민 E를 첨가한 ME군에서 는 생후 3주의 전두피질(FC)과 선조체(CS)에서는 MO군 에 비해 유의적으로 낮았다(Table 3). 식이에 의한 SOD활 성와 변화를 종합해 보면 본 연구에서 연구한 뇌 부위 중 전 두피질(FC)에서 다른 부위보다 영향을 많이 받았음을 알 수 있다.
Cu, Zn-SOD의 활성은 서로 다르게 나타 나, Mn-SOD의 활성은 ME군에서 증가하는 경향을 나타 내어, 생후 9주의 전두피질(FC), 생후 3주의 해마(H)에서 유의적인 차이를 나타내었고, Cu, Zn-SOD 는 감소하는 경향을 보여, 생후 3주의 전두피질(FC)과 선조체(CS)에서 비타민 E의 보충시 유의적으로 감소되었다. Total-SOD의 활성도 Cu, Zn-SOD의 활성과 같은 경향을 보여, MO군 에 비하여 ME군에서 감소되는 경향을 나타내었다. 식이지 방산의 조성은 SOD의 활성에 영향을 미치지 않았다.
본 연구에서 SOD의 활성은 비타민 E의 첨가시에 Mn- SOD는 증가하고, Cu. Zn-SOD는 감소하였으며, Total SOD는 감소하는 것으로 나타났는데, Zidenberg28'등의 보 고에서 나타난 바와 같이 Mn-SOD가 미토콘드리아 내막 안쪽 공간인 기질에 위치함으로 미토콘드리아에서 지질 과 산화 반응의 방어 기전으로 작용사 내막에 주로 결합되는 비타민 E의 영향을 잘 반영하지 못하는 반면' Cu, Zn- SOD는 미토콘드리아 내막과 세포질에 위치하여 비타민 E의 보호작용을 잘 반영한다고 할 수 있다.刼 Balzan등은 Cu, Zn-SOD와 Mn-SOD와 활성이 반대로 나타나는 원인은 불분명하나, 산화가 일어나고 항산화효소가 존재하는 위치가 중요한 요인이 된다고 하였다.
결론적으로 임신전 3주부터 지방산 조성이 다른 식이를 투여하여 얻은 제 2세대 쥐의 뇌부위별 항산화체게(효소와 MDA)가 유사한 수준으로 유지된 것으로 보아, 뇌조직은 항산화능력을 확보하는데 있어 식이지방의 영향을 크게 받 지 않는 것으로 여겨진다. 비다민 E의 보충으로 항산화체 계의 변화와 함께 행동 발달에 영향을 미치는 것으로 나타 났는데 써' 이는 여러 항산화계의 균형성과 신경전달물질, 그 외 여러가지 요인들과의 상호작용 측면에서의 종합적인 면 으로 해석해야 함을 지적해 주었다.
계 지방산은 다룐 지방산에 비해 지방산 자체의 불포 화도가 높고 cis형의 불안정한 이중결합을 지니고 있으므로 체내외에서 산화되어 free radical과 peroxide를 생성 할 가능성이 높으며, 생성된 과산화물은 세포막 파괴, lipoprotein 의 산화, 체조직의 노화 등 생체에 치명적인 영향을 줄 수 있는 것으로알려져 왔으나 的 전체적으로 볼 때 본 연구에서는 SO군과 MO군간의 항산화 효소의 활성은 유의한 차이를 나타내지 않아 식이 지방산이 뇌조직의 항산화 체계 에는 별 영향을 주지 않는 것으로 나타났다.
31U/mg pro- tein)에 더 높게 나타났다. 따라서 LCPUFA의 함량이 높 고, 산소의 소비량이 큰 뇌조직을 산화적 stress로부터 보 호할 수 있는 매우 효율적인 항산화 체계가 개발되어 있음을 확인할 수 았었다.
본 연구에서 생후 3주와 생후 9주의 항산화효소의 활성 올 비교하여 보면 생후 3주보다 생후 9주에서 유사한 수치를 나타내어 차이가 없는 것으로 나타나(Table 3, 4) 이는 쥐의 뇌발달이 끝나는 3주에 이미 성숙한 쥐의 수준에 도달 되었음을 말해준다.
불포화도가 매우 높은 대구 간유를 섭취함에 따라 MDA 배설량이 증가하였다는 보고狠도 있고, 비타민 E 와 P/S비율이 다양한 식이로 16주간 사육한 쥐 실험미에서 40mg a-tocopheryl acetate/kg diet 이상에서는 식이 지 방의 P/S비율에 상관없이 일정한 MDA농도를 보여주었다. 본 연구의 기본 식이내의 비타민 E 첨가수준은 50㎎/㎏ diet로 식이 지방의 종류와 비타민 E 수준에 따른 MDA 농 도변화가 관찰되지 않았다.
Total SOD의 활성은 비타민 E를 첨가한 ME군에서 는 생후 3주의 전두피질(FC)과 선조체(CS)에서는 MO군 에 비해 유의적으로 낮았다(Table 3). 식이에 의한 SOD활 성와 변화를 종합해 보면 본 연구에서 연구한 뇌 부위 중 전 두피질(FC)에서 다른 부위보다 영향을 많이 받았음을 알 수 있다.
전반적으로 뇌조직내 효소 활성도를 본 연구팀의 이전 연 구49인 간조직과 비교해보면 조직 1g당 효소농도는 간조직 이 뇌조직에 비해 3~4배 높으나, 본 실험에서와 같이 specific activity로 나타내면 간조직(Total SOD: 1.13~ 2.56U/mg protein)보다 뇌조직 (2.39~5.31U/mg pro- tein)에 더 높게 나타났다. 따라서 LCPUFA의 함량이 높 고, 산소의 소비량이 큰 뇌조직을 산화적 stress로부터 보 호할 수 있는 매우 효율적인 항산화 체계가 개발되어 있음을 확인할 수 았었다.
전체적인 경향을 볼 때 비타민 E의 첨가시 GSH-Px의 활성은 증가하는 경향, Total-SOD의 활성은 감소하는 경 향, Mn-SOD는 증가하는 경향, Cu, Zn-SOD는 감소하는 경향을 보였고. MDA 농도는 실험군간의 차이플 나타내지 않았다.
후속연구
뇌조직이 다른 조직에 비해 산화적 손상이 큰 이유는 PUFA 함량이 높고 catalase 활성이 낮고, SOD와 GSH- Px만이 moderate흥}게 존재하기 때문으로 여겨지나”' 부위 볕 농도의 차이에 대해서는 더 연구되어야 한다. Brain slice가 oxygen free radical-generating system에 노출 되었을 때 신경전달물질의 uptake가 감소, Na+K+-AT- Pase 활성의 저층I, Ca++의 유입이 증가하며, 이로 인하여 지질 산화에 의한 막의 유동성과 지질 구성의 변화가 초래 된다.
두뇌의 항산화체계는 CNS의 산화적 손상을 줄이기 위하여 , 나아가서는 노화와 관련된 기억 능력의 손상과 Alzheimere disease의 예방적 차원으로 앞으로의 연구가 절실히 요청된다고 하겠다.
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