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문제 정의
- 유산균은 전분을 직접 발효에 이용하지 못하기 때문에 곡류와 같이 전분 함량이 높은 재료는 전분을 가 수분해시키거나 전분 분해력을 가진 균주를 이용해왔 다2(3) 따라서 전분함량이 높은 밤을 발효시키기 위해서는 이에 적합한 균주의 분리가 중요하다고 생각 되며 또한 이들은 일반척으로 유산균이 선호하지 않는 식물성 재료를 발효하기 때문에 발효 후 저장기간 중 생존능력이 중요할 것으로 짐작된다. 따라서 본 연구에서는 밤을 이용하여 발효음료를 개발하기 위한 준비 과정으로 먼저 밤용액의 유산발효에 우수한 적 성을 보이는 미생물을 분리하고자 제반 특성을 검토 하였다.
- 본 연구에서는 밤 용액을 발효하여 식물성 요구르트 형태로 개발하기 위한 한 방편으로 밤 용액의 유산발 효에 적합한 균주를 분리하고자 하였다. 밤 요구르트는 밤이 상대적으로 높은 섬유소 함량으로 인하여 변 비환자에게 처방되어온 식이적 전통"과 고섬유성 요 구르트가 비만이나 과민성 대장질환을 가진 사람들 에게 선호되고, 노인성 변비에 처방되고 있는 점*을 고려할 때 기능성을 가질 것으로 생각된다.
제안 방법
- 20~25세의 정상적인 배변습관을 가진 대학생(남 학생 10명과 여학생 5명)을 선정하고, 표본은 대상자 들이 원하는 시간에 실험실에서 가까운 지정된 장소 에서 제공하도록 하였다. 분변 표본은 즉시 냉동저장용 배지”) (BHI 37g, glycerol 100ml, cysteine 0.
- PAP1과 MGG2는 서로 상이한 성질을 가져 이들을 단독 선정하여 사용하면 제품의 특성이 매우 다르며 각각 장단점을 가져 최선을 가리기 어럽기 때문에 이 들을 혼합 배 양하였을 때 산도와 생균수 면에서 어떠 한지를 검토하였다. 그 결과 Table 6에서와 같이 혼합 배양 발효액의 산도와 생균수는 0.
- 가스하에서 혐기적으로 3일간 배양하였다. 나타난 집 락들 중 그람 양성균을 1차 분리하고 혐기성 배양시험 을 수행하여 통성균과 혐기균으로 나누었다. 이들은 추가로 Rapid API32A와 API50CHL등의 상업용 키트를 이용하여 생화학 시험을 수행하고, 발효산물을 HPLC로 확인한 다음 acetate/lactate의 비율을 계산하였다.
- 25(건조중 량)의 침전물이 형성되어 발효액의 하단부분에 가라 앉아 있음이 관측된다. 따라서 이러한 침전물의 양이 발효액의 산도와 균수에 어떠한 영향을 미치는지와 저장 중의 산도와 균수에 어떠한 영향을 미치는지를 검토하기 위하여 증숙밤 10%의 현탁액어), 별도로 원 심분리하고 세처한 다음 건조시킨 침전물을 0~23% 범위에서 서로 다른 농도로 첨가하고 균을 접종시켜 발효시 킨 다음 산도와 균수를 비교 관찰하였다. 이 실험을 위하여 산도와 생균수가 높은 F1R4와 산도는 낮 지만 저장성 이 있는 MGG1 을 이용하였다.
- 일반적으로 산 생성 능력 이 큰 균들은 산에 대한 내성도 크지만, 장기간의 저장 에서는 균의 생존율이 산도에 의존할 가능성이 있다. 따라서 저장증의 생균수가 발효액의 pH에 따라 어떻게 변 하는지를 알아보기 위해 저장성이 약한 F1R4를 선정하여 발효 제품의 pH를 5.17로 조정한 다음 12일까지 저 장하며 균수 변화를 조사한 결과 Table 4와 같았다.
- 발효액의 생균수는 발효액을 혐기성 희석액에 10 배 수로 순차 희석한 다음 TPY 평판배지에 도말하고 CO2 하에서 2~3일 배양하여 나타난 집락을 세고, 집락수에 희석배수를 곱하여 1ml 중 생균수를 계산하였다.
- 본 연구에서 분리한 균주가 발효유제품을 만드는데 이용되는 상업용 균주와 비교하여 밤용액에서의 발효능력에서 어떠한 차이를 나타내는지를 시험하기 위하여, 수입종균 제품 MSK B2(Wisby Gmbh & Co. Germany) 와 Phytone peptone 0.4%, yeast extract 0.2%, glucose 0.5%를 보충한 8%의 밤용액에서 하룻 밤 배 양한 PAP1과 MGG2의 종균액을 각각 0.2와 2% 씩 접종 배양한 결과는 Table 8에서와 같았다.
- 시판 요구르트로부터의 균 분리는 구매한 몇 종의 요구르트를 희석하고 위와 같은 배지와 조건으로 분 리 시험하였다.
- 시판 요구르트의 저장온도와 유사한 온도(5℃)에 각 분리균주로 발효한 발효액을 3주간 저장하면서 일 주일 간격으로 발효액의 생균수를 측정하였다. 그 결과는 Table 3과 같이 3주간 저장 후의 잔여 생균수는 MGG1과 MGG2가 LOXLe으로 가장 많았 으며 최초 균수인 4.
- 나타난 집 락들 중 그람 양성균을 1차 분리하고 혐기성 배양시험 을 수행하여 통성균과 혐기균으로 나누었다. 이들은 추가로 Rapid API32A와 API50CHL등의 상업용 키트를 이용하여 생화학 시험을 수행하고, 발효산물을 HPLC로 확인한 다음 acetate/lactate의 비율을 계산하였다.
- PAP2의 6 주는 Bifidobacterium, F1R4, MGG1, MGG2, PAP1 의 4주는 Lactobacillus 였다. 이들을 MRS 배지에서 저장하고 발효에 사용하였다.
대상 데이터
- 따라서 이러한 침전물의 양이 발효액의 산도와 균수에 어떠한 영향을 미치는지와 저장 중의 산도와 균수에 어떠한 영향을 미치는지를 검토하기 위하여 증숙밤 10%의 현탁액어), 별도로 원 심분리하고 세처한 다음 건조시킨 침전물을 0~23% 범위에서 서로 다른 농도로 첨가하고 균을 접종시켜 발효시 킨 다음 산도와 균수를 비교 관찰하였다. 이 실험을 위하여 산도와 생균수가 높은 F1R4와 산도는 낮 지만 저장성 이 있는 MGG1 을 이용하였다. 그 결과는 Table 5에서와 같이 발효중 침전물의 영향은 매우 적 었다.
- 분리 균주들 중에서 발효 후 생균수 면에서는 PAP1, F1R4 등이 우수하고 저장 중 생균수의 보존성 면에서는 MGG1, MGG2 등이 우수하였다. 이들 중에서 PAP1과 MGG2를 선정하였다.
성능/효과
- 그 결과는 Table 5에서와 같이 발효중 침전물의 영향은 매우 적 었다. MGG1은 침전물이 제거된 발효액에서 산도와 생균수는 1.43과 4.1X108이었으나 23%의 침전물을 함유한 발효액은 1과 1.8 xl"이었고, F1R4는 4.42와 1.0x10및 4.05와 3.6xl07으로 같은 경향을 보여 침전물에 의해 산도와 균수가 미 약하게 나마 감소하는 경향을 보였다.
- 28과 l.Oxi"이었다 이러한 결과는 3주까지의 저장에서 혼합배양액의 생균수는 pH 조정한 경우보다 더 높아 저장성도 우수한 것으로 나타났다.
- PAP1과 MGG2는 서로 상이한 성질을 가져 이들을 단독 선정하여 사용하면 제품의 특성이 매우 다르며 각각 장단점을 가져 최선을 가리기 어럽기 때문에 이 들을 혼합 배 양하였을 때 산도와 생균수 면에서 어떠 한지를 검토하였다. 그 결과 Table 6에서와 같이 혼합 배양 발효액의 산도와 생균수는 0.99와 2.8X109로 MGG2와 PAP1 각각의 단독배 양액 의 산도와 생균수 0.기과 9.0x10 및 0.87과 2.5 X1"보다 더 컸다.
- 8X1Q8에 비하여 감소 가 적었다. F1R4와 PAP1 이 최초균수 l.lxio, 과 2.1 Xi에서 3주 저장 후 6.4xl02과 1.0xl03으로 가장큰 감소를 보여 유통 저장 면에서는 가장 좋지 않았고, MGG1과 MGG2가 가장 좋음을 알 수 있었다,
- 시판 요구르트의 저장온도와 유사한 온도(5℃)에 각 분리균주로 발효한 발효액을 3주간 저장하면서 일 주일 간격으로 발효액의 생균수를 측정하였다. 그 결과는 Table 3과 같이 3주간 저장 후의 잔여 생균수는 MGG1과 MGG2가 LOXLe으로 가장 많았 으며 최초 균수인 4.6X10, 과 6.8X1Q8에 비하여 감소 가 적었다. F1R4와 PAP1 이 최초균수 l.
- 54였다. 따라서 본 연구에서 분리한 균 이 밤용액의 발효에 더 큰 적성을 나타내었다.
- 4X10%] 비하여 비해 100배 이상 더 많았다. 따라서 제품의 생균수는 장기 저장 중 발효액의 산도에 의해 크게 영향을 받으므로 유통중 제품의 생균수를 높게 유지시키기 위해서는 산미를 잃지 않는 범위 내에서 최대한 pH를 상승시켜야 함을 확인할 수 있었다.
- PAP1 과 MGG2를 분리하였다. 발효액의 저장 중 균수는 발 효액의 산도에 의존하였고 산도를 낮추었을 때 생균 수는 증가하였다. 이들을 흔합 배 양하였을 때 발효제품의 산도와.
- 분리 균주들 중에서 발효 후 생균수 면에서는 PAP1, F1R4 등이 우수하고 저장 중 생균수의 보존성 면에서는 MGG1, MGG2 등이 우수하였다. 이들 중에서 PAP1과 MGG2를 선정하였다.
- 분변에서 분리한 M1R1, M2R1, M2R6, M3R3, F1R4의 5균주와 시판 요구르트에서 분리한 NBL1, PAP1, PAP2, MGG1, MGG2의 5균주를 위의 검사결과를 바탕으로 Chevalier의 분류법에 따라 동정한 결과 M1R1, M2R1, M2R6, M3R3, NBL1. PAP2의 6 주는 Bifidobacterium, F1R4, MGG1, MGG2, PAP1 의 4주는 Lactobacillus 였다.
- 8ml를 가한 다음 2일 배양하고 산도와 균수를 측정한 결과는 Table 2와 같다. 산도는 F1R4와 PAF1 이 3.26, 3.66으로 비교적 높았으나 생균수는 MGG1, MGG2, NBL1 이 1.7X10, , 1.5 X109, 1.8 X109 으로 우수하였다.
- 이들을 흔합 배 양하였을 때 발효제품의 산도와.생균수는 각각의 단독배 양액 에 비하여 더 컸으며 3주간 저장 후 생균수도 100배 이상 컸다. 밤 용액의 발효에서 이들을 상업용 수입 종균제품과 비교하였을 때 24시간 배양에서 생균수가 더 많았다.
- 선정한 PAP1과 MGG2를 혼합배양하고 발효액에 증류수, 당액, 또는 당액과 밤용액의 혼합을 각각 1:1 로 섞고, 5℃ 에서 3주까지 저장하면서 균수의 변화를 조사한 결과는 Table 7과 같았다. 선정된 혼합균주는 2주에서 3주 사이에 4.1X10&에서 4.5X103으로 균수가 감소되어 2주 이상의 저장에서는 균수 유지에 문제가 있음을 발견할 수 있었다. 이러한 문제를 발효 후 조미 액을 첨가하여 해결될 수 있는지를 검토하기 위하여 당, 밤 용액 및 당과 밤 용액의 혼합액을 각각 동량 가 하고 3주까지 같은 온도에서 저장하면서 균수의 변화를 조사하였을 때 3주 저장액의 균수는 4.
- 저장 중 침전물의 영향은 12일간 저장 후 MGG1은 침전물이 없는 경우 산도와 균수가 1.43과 1.4X108였고 23%의 침전물에서 1.13과 Ux이었으며, F1R4의 경우는 각각 4.70과 및 4.40과 4.8xl03인 것으로 나타나 MGG1 와는 달리 F1R4에서는 침전물이 저장 중 생균수의 감소를 저지시켰으나 그 영향은 적었다.
- 접종 직후의 생균수와 산도는 MSK B2가 2.1 X108 과 0.44 였고, PAP1과 MGG2의 혼합은 1.9 과 0.77이어서, 생균수는 비슷하였으나 산도는 선정된 균 주가 더 높았다. 24시간 배양 후의 생균수와 산도는 MSK B2가 각각 3.
- 8xl08으로 가장 우수하였다. 침전물이 제거되지 않은 배양에서 생균수는 3.8X 108~2.1x109의 분포를 보여 각 분리균이 거의 비슷한 생육을 나타내었지만 F1R4, PAP1 이 1.1 X109, 2.1 Xi으로 비교적 높았으며, 이들의 산도는 각각 5.26, 5.21 로서 1.30~2.45의 범위의 분산을 보인 다른 균들 에 비해 높았다. 따라서 발효 직후의 발효액의 산도와 생균수 면에서는 F1R4와 PAP1 이 가장 좋은 것으로 사료된다.
- 분리한 10주의 균주들을 침전물이 제거되거나 제거 되지 않은 밤용액에 접종 발효시키고 산도와 균수를 측정해 본 결과는 Table 1과 같다. 침전물이 제거된 배 양에서는 산도는 0.90~2.15ml(0.1N NaOH) 의 분포를 보였고 M1R1 이 가장 높았으며, 생균수는 1.9X108 -1.4X109 CFU/ml의 분포였고 시험균 중 PAP2와 M2R1 가 각각 1.4 xlO9, 9.8xl08으로 가장 우수하였다. 침전물이 제거되지 않은 배양에서 생균수는 3.
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