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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 우리나라 전통 발효식품인 동치미로부터 300여주의 유산균을 분리하여 이들의 항돌연변이 활성을 직접 변이원과 간접 변이원에 대하여 조사하였으며 활성이 가장 높은 균주를 동정한 후 그 특성을 조사하 였다.
제안 방법
- 유산균의 분리는 숙성중의 동치미 시료를 30일간 4C에 서 보관하면서 5일 간격으로 균원시료를 채취하여 멸균된 0.85% NaCl 용액에 적당량 희석한 후, brobocresol purple (BCP)을 함유한 plate count agar (yeast extract 0.25%, bactopeptone 0.5%, glucose 0.1%, tween 80 0.1%, L-lysine 0.01%, BCP 0.004%, agar 1.5%) 배지에 도말하여 30℃에서 48시간 배양하고 균체의 주변에 황색환을 형성하는 약 300 여주의 유산균을 1차 분리하였다. 1차 분리된 균주를 MRS broth (bactopeptone 1.
- 돌연변이 및 항돌연변이원성 조사는 Ames test를 개량 한 preincubation 방법[13, 18, 19]에 따라 행하였으며, 사용 균주는 히스티딘 영양 요구주이며 point mutant인 Salmonella enterica serovar h/phimurium TA100 (hisG46, rfa, AuvrB)과 frame shift mutant인 S. enterica serovar typhimurium TA98 (hisD3052, rfa, △uvrB)을 사용하였고, 조사방법은 시료에 의한 H* is 복귀 돌연변이 정도를 조사하여 확인하였 다. 변이원으로서는 S.
- 5 첨가하여 행하였다. 항돌연변이원성 조사를 위하 여는 미리 건열시킨 glass cap tube에 시료 용액을 일정 농 도로 첨가하고 변이원을 50 fit 첨가한 다음 여기에 영양배지에서 16시간 배양시킨 S. enterica serovar typhimurium TA 배양액 100 와 직접 변이원의 경우 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) 0.5 또는 간접 변이원인 경 우 S-9 mix 0.5 를 첨가하였다. 이것을 37℃에서 30분간 preincubation한 다음 소량의 histidine/biotin이 첨가된 top agar 3 ng를 혼합한 후 미리 조제해 놓은 minimal glucose agar상에 중층하여 평판 고화 시킨 다음 37℃ 에서 48시간 배양하였다.
- 이것을 37℃에서 30분간 preincubation한 다음 소량의 histidine/biotin이 첨가된 top agar 3 ng를 혼합한 후 미리 조제해 놓은 minimal glucose agar상에 중층하여 평판 고화 시킨 다음 37℃ 에서 48시간 배양하였다. 항돌연변이 활성은 상기의 고체 배지에서 생 육하는 His+ 복귀 돌연변이 콜로니를 계수하여다음식으로 환산하고 His+ 복귀 돌연변이 저해유inhibition ratio)로서 나타내었다.
- 시료의 돌연변이원성 조사를 위해 변이원을 첨가하지 않고 시료만을 첨가하여 상기의 항돌연변이 실험과 동일한 방법으로 행하였다. 돌연변이 활성은 시료에 의한 His+ 복귀 돌연변이율로서 무처리시 유도된 His+ 복귀 돌연변이 콜로니 수(자연 복귀 돌연변이 콜로니 수)에 대한 시료처리 시 유도된 H* is 복귀 돌연변이 콜로니 수의 %로 나타내 었다.
- subtilis M45의 포자 현탁액을 배지 10 당 1 의 비율로 혼합한 후 petri dish에 각각 분주하여 고화시킨 다음 돌연변이원 성 및 항돌연변이원성 실험에 사용하였다. 항돌연변이원성을 조사하기 위하여는 고화시킨 B. subtilis H17과 B. 434 / 생명과학회지 subtilis M45 포자 한천 배지에 paper disc를 놓고 37℃에서 30분간 반응시킨 배양 상징액과 MNNG (10 /zg/10 ) 또는 4-NQO (20 ng/10 혼합액을 주입하고 4℃에서 8시간 배양하였다. 그 후 37℃에서 16시간 배양하여 paper disc 주변에 형성된 생육 저지대의 직경을 측정하였다.
- 숙성 동치미로부터 BCP를 함유한 plate count agar 배 지에 황색환을 형성하는 약 300여주의 균을 1차 분리하였다. 1차 분리된 균주를 MRS 배지에서 36시간 재배양한 후, 원심분리하여 얻은 배양 상징액의 직접변이원인 MNNG에 대한 항돌연변이 활성을 측정하여 활성이 90% 이상인 20 균주를 2차 분리하였다. 이 균주들의 배양 상징액을 S.
- 우리나라 동치미 발효에 관여하는 유산균의 항돌연변이 활성을 조사하기 위하여 숙성중의 동치미로부터 300여주의 유산균을 분리하였다. 이들 균주들의 항돌연변이 활성을Salmonella enterotica serovar typhimurium TA100과 TA98을 이용하여 조사하고 직접 변이원 MNNG, NPD, 4-NQO와 간접변이원으로서 AFB1 에 대하여 항돌연변이 활성이 가장 우수한 DLAB19균주를 최종 선별하였다.
- 우리나라 동치미 발효에 관여하는 유산균의 항돌연변이 활성을 조사하기 위하여 숙성중의 동치미로부터 300여주의 유산균을 분리하였다. 이들 균주들의 항돌연변이 활성을Salmonella enterotica serovar typhimurium TA100과 TA98을 이용하여 조사하고 직접 변이원 MNNG, NPD, 4-NQO와 간접변이원으로서 AFB1 에 대하여 항돌연변이 활성이 가장 우수한 DLAB19균주를 최종 선별하였다. 최종 선별한 DL- AB19의 형태학적, 배양학적 및 생리학적 특성을 조사하여Bergey's Manual Systematic Bacteriology의 분류 기준에 따라 동정한 결과 Leuconostoc mesenteroides subsp.
- 5%) 배지에 도말하여 30℃에서 48시간 배양하고 균체의 주변에 황색환을 형성하는 약 300 여주의 유산균을 1차 분리하였다. 1차 분리된 균주를 MRS broth (bactopeptone 1.0%, meat extract 1.0%, yeast extract 0.5%, glucose 2.0%, tween 80 0.1%, sodium acetate 0.5%, tri-ammonium citrate 0.2%, K2HPO4 0.2%, MgSQ . 7HQ 0.02%, MnSO4 - 4H2O 0.005%) 배지에 배양하여 상징액의 항돌연변이 활성[13, 18, 19]을 측정한 후 활성이 가장 높은 균주를 최종 선별하여 공시 균주로 사용하였다.
- 그 후 37℃에서 16시간 배양하여 paper disc 주변에 형성된 생육 저지대의 직경을 측정하였다. 돌연변 이원성 조사를 위하여는 배양 상징액을 첨가하지 않고 상기의 항돌연변이원성 실험과 같은 방법으로 행하였다.
대상 데이터
- enterica serovar typhimurium TA98 (hisD3052, rfa, △uvrB)을 사용하였고, 조사방법은 시료에 의한 H* is 복귀 돌연변이 정도를 조사하여 확인하였 다. 변이원으로서는 S. enterica serovar typhimurium TA100의 경우 MNNG (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine), NPD (4-nitro-O-phenylenediamine)z AFB1 (aflatoxin B° 를 plate당 각각 5 , 15 g, 1되게 사용하였으며, S. enter- ica serovar typhimurium TA98의 경우 NPD, 4-NQO (4- nitroquinoline-1-oxide), AFB1 을 각각 2.5 0.25 g, 1 /zg되게 사용하였다. AFB]과 같은 간접 돌연변이원의 활성화를 위해 쥐 간의 microsome 분획인 S3 mix (Sigma Co.
- Kada의 방법[11]에 따라 행하였으며, 사용한 균주는 Ba cillus subtilis H17 (rec+)과 B. subtilis M45 (rec)를 이용하고 포자를 조제하여 실험에 사용하였다. 영양한천 배지를 조제하여 50℃로 냉각한 후 B.
- subtilis M45 (rec)를 이용하고 포자를 조제하여 실험에 사용하였다. 영양한천 배지를 조제하여 50℃로 냉각한 후 B. subtilis H17과 B. subtilis M45의 포자 현탁액을 배지 10 당 1 의 비율로 혼합한 후 petri dish에 각각 분주하여 고화시킨 다음 돌연변이원 성 및 항돌연변이원성 실험에 사용하였다. 항돌연변이원성을 조사하기 위하여는 고화시킨 B.
- 1차 분리된 균주를 MRS 배지에서 36시간 재배양한 후, 원심분리하여 얻은 배양 상징액의 직접변이원인 MNNG에 대한 항돌연변이 활성을 측정하여 활성이 90% 이상인 20 균주를 2차 분리하였다. 이 균주들의 배양 상징액을 S.enterica serovar typhimurium TA100과 S. enterica serovar typhimurium TA98을 사용하여 MNNG, NPD와 4-NQO에 대한 항돌연변이 활성을 조사한 결과(Table 1), 20개의 균주들 중에서 특히 DLAB19가 모든 변이원에 대하여 활성이 가장 높았으므로 최종 선별하여 본 실험의 공시 균주로 사용하였다.
데이터처리
- 돌연변이 활성은 시료에 의한 His+ 복귀 돌연변이율로서 무처리시 유도된 His+ 복귀 돌연변이 콜로니 수(자연 복귀 돌연변이 콜로니 수)에 대한 시료처리 시 유도된 H* is 복귀 돌연변이 콜로니 수의 %로 나타내 었다. 돌연변이 및 항돌연변이 조사는 3구 3회 반복으로 실험하여 평균값으로 나타내었다.
이론/모형
- 유산균의 동정은 배양학적, 형태학적 및 생화학적 특성을 조사한 것과 Biolog GP MicroPlate™ (Biolog Co., USA)을 이용하여 특성을 조사한 것을 비교하여 Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology의 방법 [1이에 따라 동정하였다.
성능/효과
- 항돌연변이 활성이 가장 우수한 균주인 DLAB19의 생리학적 성질을 조사한 결과, Gram 염색 양성 간균으로서 운동성이 없었으며, catalase와 oxidase는 음성, glucose로부 터 gas를 생성하지 않았다. Esculin 분해성과 citrate 이용성은 양성이었으며, 6.
- 따라서 이상의 특성을 토대로 하여 Ber gey's Mannual of Systematic BacteriologyS] 기술된 분류기준에 따라 동정한 결과, Leuconostoc mesenteroides sub sp. cremoris 또는 그 유연균으로 동정되어 분리균을 Leu.mesenteroides subsp.cremoris DLAB19로 명명하였다.
- mesenteroides subsp. cremoris DLAB19를 MRS 배지에서 배양한 후 원심분리하여 얻은 상징액의 돌연변이원성을 조사한 결과, Table 4와 같이 배양 상징액의 농도에 따른 돌연변이 효과는 mutation ratio가 2.0이하 이었으며, 농도 의존성을 나타내지 않았으므로 돌연변이 활성이 없음을 알 수 있었다. 배양 상징액의 농도를 달리하여 항놀연변이 활성을 즉정한 결과' point mutant인 S.
- 0이하 이었으며, 농도 의존성을 나타내지 않았으므로 돌연변이 활성이 없음을 알 수 있었다. 배양 상징액의 농도를 달리하여 항놀연변이 활성을 즉정한 결과' point mutant인 S. enter- ica serovar typhimurium TA100을 이용한 실험에서 변이원 MNNG, NPD 및 AFB1 에 대한 활성은 배양 상징액 100 /plate 첨가시 각각 97.2%, 69.9% 및 78.2%로 놎게 나타났다. 또한 frame 아lift mutant인 S.
- 2%로 놎게 나타났다. 또한 frame 아lift mutant인 S. enterica serovar typhi- murium TA98을 이용한 실험에서 변이원 NPD, 4-NQO 및 AFBli 대한 활성 또한 배양 상징액을 plate당 100 첨 가시 각각 52.4%, 58.2% 및 75.0%로 높게 나타났다(Table 5). 현재까지 발효유 및 유산균의 항 돌연변이원성에 관한 연구 보고가 거의 없으나 항암 활성에 관하여는 많은 연구보고가 있다[1, 2].
- B. subtilise] 포자를 이용한 spore-rec assay 방법을 이용하여 분리 균주의 돌연변이 활성 및 항돌연변이 활성을 확인한 결과 Table 6과 같이 분리균의 배양 상징액을 첨가하지 않은 경우 변이원 MNNG와 4-NQO의 변이원성 실험 결과에서 B. subtilis M45와 B. subtilis H17의 생육 저지대 의 차이가 30 mm이상으로서 2가지 변이원 모두 강력한 돌연변이 활성이 존재하는 것으로 나타났다. 그러나 배양 상징액의 농도를 증가시켜 주입함에 따라 생육 저지대의 차이가 없었으므로 상징액은 돌연변이원성이 없음을 알 수 있었다.
- 그러나 배양 상징액의 농도를 증가시켜 주입함에 따라 생육 저지대의 차이가 없었으므로 상징액은 돌연변이원성이 없음을 알 수 있었다. 배양 상징액의 항돌연변이 활성을 조사한 결과는 각각의 변이원에 대해 배양 상징액의 첨가량에 따라 B. subtilis M45와 B. subtilis H17의 생육 저지대의 차이가 각각 최저 5 mm와 4 mm로서 분리균의 배양 상징액이 강한 항돌연변이 활성을 가지고 있음을 재확인할 수 있었다.
- mesenteroides subsp. cremoris DLAB19의 배양 상징액의 MNNG, NPD, 4-NQO 및 AFB1 에 대한 항돌연변이 활성은 100 /plate 첨가시 활성이 가장 높게 나타났다. 또한 B.
- cremoris DLAB19의 배양 상징액의 MNNG, NPD, 4-NQO 및 AFB1 에 대한 항돌연변이 활성은 100 /plate 첨가시 활성이 가장 높게 나타났다. 또한 B. ss의 포자를 이용한 spore-rec assay 방법을 사용하여 MNNG와 4-NQO에 대한 항돌연변이 활성을 가지고 있음을 재확인하였다.
후속연구
- thermophilusf Lactobacillus kefiranofaciens, L crs등 역시 실험 동물에 있어서 각종 암에 대하여 항암효과를 가지고 있는 것으로 보고된 바 있다]. 이들 유산균이 생산하는 항암물질은 대부분 흥lycopeptide또는 다당류로 알려져 있으나1 본 실험에서 분리한 균주가-생산하는 항돌연변이원성 물질과 어떤 차이가 있는지는 좀 더 연구해야 할 과제이다.
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