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문제 정의
- 이 연구에서는 오이 methanol 추출물과 methan이 추출물의 분획물에 대한 항돌연변이 효과와 항미생물 효과를 조사하였다. Ames 실험 계를 이용한 항돌연변이 효과는 Salmonella 讪m TA100에 서 간접돌연변이 원인 aflatoxin Bi에 대해 methanol 추출물은 1.
제안 방법
- 이 실험에서는 일상의 식생활에서 독특한 풀 내음의 시원한 향기와 그 조직감의 기호성, 그리고 위에서 기술된 영양적 혹은 그 외적인 요인 등으로 사계절 소비되고 있는 오이 추출물을 시료로 하여 항미생물 효과를 조사하였고 동시에 AFB], MNNG를 mutagen으로 한 Ames test를 하여 항돌연변이효과도 조사하였다.
- , Germany)로 건고될 때까지 농축 시켜 이것을 methanol 추출물로 하였다. 유기용매별 분획 추출물은 오이 분말 100 g으로앞의 방법에 의하여 methanol 추출물을 준비하고, 여기에 hexane : methanol: H2O (10: 1 : 9)의 혼합용액 500 口丄을 첨가하여 상온에서 6시간씩 3회 진탕 추출하여 hexane층은 농축, 건 고 시켜 hexane 분획 추출물로 하였다. 수용액 층에는 다시 chloroform 500 mL을 첨가시켜 6시간씩 3회 진탕 추출하여 chloroform층을 농축, 건 고 시켜 chloroform 분획 추출물로 하였다.
- 유기용매별 분획 추출물은 오이 분말 100 g으로앞의 방법에 의하여 methanol 추출물을 준비하고, 여기에 hexane : methanol: H2O (10: 1 : 9)의 혼합용액 500 口丄을 첨가하여 상온에서 6시간씩 3회 진탕 추출하여 hexane층은 농축, 건 고 시켜 hexane 분획 추출물로 하였다. 수용액 층에는 다시 chloroform 500 mL을 첨가시켜 6시간씩 3회 진탕 추출하여 chloroform층을 농축, 건 고 시켜 chloroform 분획 추출물로 하였다. 수용액 층에 는 다시 ethyl acetate 500 mL을 첨 가시켜 6시간씩 3회 진탕 추출하여 ethyl acetate 층은 농축, 건고 시켜 ethyl acetate 분획 추출물로 하였다.
- 추출 시 사용된 유기 용매는 모두 Merck 제품 GR급으로 사용하였다. 각 용매별 추출물은 농축용기의 항량을 측정한 후 그 용기로 추출물을 완전히 농축, 건 고시키고, 다시 무게를 정확히 측정하여 추출물의 수율을 측정하였다.
- 실험 전에 균들은 정기적으로 histidine 요구성, deep rough character, UV 감수성 및 R fac tor 존재 등의 genotypes을 확인한 후 시험균주로 사용하였다. 항돌연변이 실험은 Maron 과 Ames(2®의 방법에 따라 S9 mixture를 준비하고, 준비된 S9 mix 0.5 mL(AFBi의 경우) 또는 0.2 M 인산 완충액 0.5 mL(MNNG의 경우), 하루밤배양된 균주(1 ~2 X IO, cells/mL) 0.1 mL, mutagen 용액 50 卩L오} 여러 농도의 시료액 50 HL씩을 ice bath에 담긴 시험관에 첨가한 후 가볍게 vortex하고 37℃에 서 20분간 예비 배 양하였다. 이때 mutageri으로 N-methyl-N7-nitro-N -nitros- oguanidine(MNNG) 및 aflatoxin Bi(AFBi)은 미국 Aldrich 회사 및 Sigma 회사에서 각각 구입하여 증류수 및 dimethyl - sulfoxide(DMSO)에 녹여 실험에 사용하였다.
- 이때 mutageri으로 N-methyl-N7-nitro-N -nitros- oguanidine(MNNG) 및 aflatoxin Bi(AFBi)은 미국 Aldrich 회사 및 Sigma 회사에서 각각 구입하여 증류수 및 dimethyl - sulfoxide(DMSO)에 녹여 실험에 사용하였다. 앞에서 예비배 양된 시험관에 45℃에 보관 중이던 top agar 2 mL/씩 을 첨 가하여 3초간 vortex 한 후 이것을 미리 준비된 minimal glucose agar plate에 도 말하고 37 48시간 배양한 후 revertant 숫자를 계수하였다(29). 한편 균주에 대해 오이 추출물과mu tagen 의 농도는 독성 실험과 dose response를 행하여 결정하였다.
- 앞에서 예비배 양된 시험관에 45℃에 보관 중이던 top agar 2 mL/씩 을 첨 가하여 3초간 vortex 한 후 이것을 미리 준비된 minimal glucose agar plate에 도 말하고 37 48시간 배양한 후 revertant 숫자를 계수하였다(29). 한편 균주에 대해 오이 추출물과mu tagen 의 농도는 독성 실험과 dose response를 행하여 결정하였다.
- 항미 생물 활성 측정: 실험은 세균의 특성에 따라 nutrient agar(NA)/nutrient broth(NB)(Difco, 디 SA) 그리고 강화된 NA/NB 배지를 이용하였고 Vibrio jxirahaemolyticus KCTC 24기는 NA/NB 배지 에 3%의 NK1을 첨가한 것으로 실험 하였다. 효모는 YM agar/bro나!(Difco, USA)배지를 사용하였 匸k 항균성 측정은 paper disc를 이용한 holo test로 측정 하였다.
- 효모는 YM agar/bro나!(Difco, USA)배지를 사용하였 匸k 항균성 측정은 paper disc를 이용한 holo test로 측정 하였다. 즉 3 회계 대 배양하여 준비된 전배 양액 0.
- 1 m丄을 두균 pi- pette으로 취하여 50℃ 유지된 게] 지 15 m丄정 도에 가하여 너 H 지가 굳기 전에 잘 혼합 시켜 petri dish에 옮긴다. 여기에 멸균된 8 mm의 paper disc(Avantec 49005010)를 잘 밀착시킨 후 DMSO로 10% 농도로 희석된 오이 추출물을 membrane filter (0.2 Um, Whatman 6750-2502)로 제균한 후 micro pipette 으로 30 UL 취하여 밀착되어 있는 paper disc 위에 적 하하고, 세균은 37℃, 효모는 25℃에서 24시간 배양시킨 후 paper disc 주위 의 clear zone의 지름을 측정하였다. Control로서 DMSO 만 적하하여 병행 실험하였다.
- concentration)-!- 위한 실험은 methanol 추출물을 DMSO로 용해시키고, 이용액을 membrane filter(0.2 卩m)로 제균한 후 멸균 준비된 nutrient broth에 첨가시켜 농도를 0, 500, 1000, 1500, 2000, 2500 ppm으로 조절하였다. 이렇 게 준비된 배지 10mL에 1 mL의 전배 양된 균 액을 첨가하여 분광광도계 (UV-1201 Shimadzu Co.
- , Japan)로 660 nm에서 흡광도 (A)를 측정하였고, 그 후 24시간 동안 37℃에서 진탕배양 시킨 후 다시 흡광도(B)를 측정하였다. 이렇게 측정된 흡광도의 차이 (B-A)를 조사하여 control(0 ppm)과 비교하여 균 증식억제에 대한 효과를 조사하였다.
- 살균력 측정: Methanol 추출물을 1%, 0.5%로 조절하여 준비 된 nutrient broth에 각각 전배 양된 Pseudomonas aer^ uginosa를 첨가하여 초기균수를 약 10° 정도로 조절한 후 진탕배양조 37 배양하면서 1시칸 간격으로 채취된 시료로 생균수를 측정하여 살균의 효과를 조사하였다.
- 이것은Lee 등(17)이 보여준 오이의 methanol 추출물이 간접 돌연변이 원인 AFB에는 항돌연변이 효과가 약하게 나타났으나, 직접 돌연변이 원인 4-NQO에는 강한 효력으로 이 실험의 결과와도 일치하고 있다. 오이의 활성 물질을 분리하기 위해서 오이의 methanol 추출물을 극성이 다른 용매, 즉 hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol 및 물 등으로 분획하였다. AFBi에 대한 이들 용매 획분의 항돌연변이 효과는 Table 3과 같다.
- 그러나 오이의 butanol 획분은 농도에 비례해서 MNNG에 대해 가장 큰 항돌연변이 활성이 관찰 되 었으며 5%의 농도에 서는 MNNG에 대해 95%의 항돌연변이 성을 나타내었다. Ames test에 사용한 오이의 meth anol 추출물 및 각 용매별 획분은 Fig. 3에 서와 같이 항돌연 변이 test 전에 미리 독성 test를 실시하여 그 농도를 결정 하였다.
- 10%의 농도에서는 일부 획분이 독성을 나타냈으므로 5%의 이하의 농도에서 항돌연변이 실험을 행하였다. 따라서 오이에는 간접 돌연변이 원의 활성화에 관여하여 항돌연변이 성을 나타내는 물질 이외에도 직접 돌연변이 원이 직접 DNA에 결합하여 유전적 돌연변이를 일으키는 것을 차단하는 항돌연변이 물질도 들어있으리라 추정되었다.
- Methanol 추출물의 살균 효과를 알기 위하여 추출물을 1 %와 0.5%로 첨가한 영양액 체 배지에 P. aeruginosa^ 초기균수 약l(f/mL로 접종한 후, 37℃에서 진탕 배양하였고, 배양 중 1시간 간격으로 생균 수를 측정하였다. Fig.
- 2 Um, Whatman 6750-2502)로 제균한 후 micro pipette 으로 30 UL 취하여 밀착되어 있는 paper disc 위에 적 하하고, 세균은 37℃, 효모는 25℃에서 24시간 배양시킨 후 paper disc 주위 의 clear zone의 지름을 측정하였다. Control로서 DMSO 만 적하하여 병행 실험하였다.
대상 데이터
- 엄궁 농산물시장에서 구입한 오이(김해 대저 산 : 가시오이) 를 수세하고, 세절하여 진공동결건조기(model 77545 Lab- conco Co., USA)에서 건조한 다음 분쇄기를 이용하여 분말화한 후 냉동고에 보관하면서 실험용 재료로 사용하였다.
- 위에서 준비된 용매별 분획 추출물은 냉동고에 보관하면서 필요에 따라 증류수 혹은 DMSO에 용해 시 켜 항돌연변이 및 항미생물 실험에 사용하였다. 추출 시 사용된 유기 용매는 모두 Merck 제품 GR급으로 사용하였다. 각 용매별 추출물은 농축용기의 항량을 측정한 후 그 용기로 추출물을 완전히 농축, 건 고시키고, 다시 무게를 정확히 측정하여 추출물의 수율을 측정하였다.
- 시험 균주는 Salmonella typhimurium TA100으로 histi dine 요구성 돌연변이체이며, 미국의 California 대학의 B. N. Ames박사로부터 제공받았다. 실험 전에 균들은 정기적으로 histidine 요구성, deep rough character, UV 감수성 및 R fac tor 존재 등의 genotypes을 확인한 후 시험균주로 사용하였다.
- Ames박사로부터 제공받았다. 실험 전에 균들은 정기적으로 histidine 요구성, deep rough character, UV 감수성 및 R fac tor 존재 등의 genotypes을 확인한 후 시험균주로 사용하였다. 항돌연변이 실험은 Maron 과 Ames(2®의 방법에 따라 S9 mixture를 준비하고, 준비된 S9 mix 0.
- 1 mL, mutagen 용액 50 卩L오} 여러 농도의 시료액 50 HL씩을 ice bath에 담긴 시험관에 첨가한 후 가볍게 vortex하고 37℃에 서 20분간 예비 배 양하였다. 이때 mutageri으로 N-methyl-N7-nitro-N -nitros- oguanidine(MNNG) 및 aflatoxin Bi(AFBi)은 미국 Aldrich 회사 및 Sigma 회사에서 각각 구입하여 증류수 및 dimethyl - sulfoxide(DMSO)에 녹여 실험에 사용하였다. 앞에서 예비배 양된 시험관에 45℃에 보관 중이던 top agar 2 mL/씩 을 첨 가하여 3초간 vortex 한 후 이것을 미리 준비된 minimal glucose agar plate에 도 말하고 37 48시간 배양한 후 revertant 숫자를 계수하였다(29).
- 신선한 생오이 1 kg을 동결건조하여 35 昌의 오이 분말을 얻었다. 오이 분말 추출물들에 대한 수율은 Table 2에 나타내었다.
성능/효과
- 항미생물 효과의 조사에서는 오이 methanol 추출물이 실험 균주 11종 중 8종의 세균에 대하여 항균 활성을 나타내었다. 이 중 K. pneumonia KCTC 2208, P. aeruginosa KCTC 2004가 clear zone 13 mm로서 가장 항균 활성에 민 감한 균종으로 나타났다. 각 용매별 획분 중에 서는 hexane 획분은 V.
- parahaemolyticus KCTC 24기에 대하여 항균효과를 보였고, chloroform과 ethyl acetate 획분에서도 약하게 항균효과를 보였다. Methanol 추출물의 농도에 따른 균 증식억제 효과의 결과로는 V. parahaemolyticus 가 가장 낮은 최소증식 억제 농도를 보여 500 ppm으로 나타났다. Methanol 추출물의 살균 효과는 /3.
- 5%의 농도에 비하여 약 10배 정도의 빠른 살균 효과를 보였다. 즉 초기균수의 90% 균을 살균하는 데 1%와 0.5%의 농도에서 각각 26분, 250분이 소요되는 것으로 예측되었다.
- AFBi에 대한 이들 용매 획분의 항돌연변이 효과는 Table 3과 같다. 오이의 hexane, chloroform 및 ethyl acetate 획분이 농도에 비례해서 AF%에 대해 강한 항돌연변이 활성을 나타냈으며 특히 hexane 획분의 효과가 가장 커서 AFBi의 돌연변이 저해 효과가 89%에 달하였다. 이는 오이의 지용성 활성 성분이 AFB의 활성화에 관여하며 최종돌연변이 원으로의 전환을 억제하는 역할을 하는 것으로 추정된다.
- 오이의 hexane 및 chloroform 획분의 경우 높은 농도(5%)에서는 강력한 항돌연변이 성을 관찰할 수 있었으나 그보다 낮은 농도에서는 활성 이 그다지 높지 않았다. 그러나 오이의 butanol 획분은 농도에 비례해서 MNNG에 대해 가장 큰 항돌연변이 활성이 관찰 되 었으며 5%의 농도에 서는 MNNG에 대해 95%의 항돌연변이 성을 나타내었다. Ames test에 사용한 오이의 meth anol 추출물 및 각 용매별 획분은 Fig.
- 오이용 매별 분획 추출물의 항미생물 활성을 조사하기 위하여 U종의 미생물에 대하여 10%의 추출물로서 paper disc 를 이용한 holo test# 실시한 결고)■ 그 활성에서 아주 뚜렷하게 나타났다. Methanol 추출물에서는 11종의 미생물 坨st에서 8종의 미생물에 대하여 clear zone< 형 성하였다.
- Methanol 추출물에서는 11종의 미생물 坨st에서 8종의 미생물에 대하여 clear zone< 형 성하였다. Ethyl acetate와 chloroform의 획분에서는 3종의 미생물, hexane 획분에서는 1종의 미생물에서 항균 활성에 결과를 보였으나 물과 butanol 획분에서 는 항균 활성 을 전혀 나타내지 않았다 (Table 5). 이것은 Shim 등(33)이 조사한 겨자 추출물에서 methanol 추출물의 강한 항균력에 반하여 물 획분에서는 전혀 항균력이 없었던 결과에서도 동일한 경향을 보이고 있다.
- 이것은 Shim 등(33)이 조사한 겨자 추출물에서 methanol 추출물의 강한 항균력에 반하여 물 획분에서는 전혀 항균력이 없었던 결과에서도 동일한 경향을 보이고 있다. 실험 균중에서 는 K. pneumonia^ P. aeruginosa6^ 13 mm 의 clear zone으로 가장 강한 항균 활성을 나타내었다고 V. par- ahaemolyticus^} ethyl acetate, chloroform, hexane, methanol 등 4종류의 추출물에서 항균 활성을 보였다. 즉 실험한 균종에서는 가장 다양한 추출물에서 항균 효과를 보이고 있다.
- par- ahaemolyticus^} ethyl acetate, chloroform, hexane, methanol 등 4종류의 추출물에서 항균 활성을 보였다. 즉 실험한 균종에서는 가장 다양한 추출물에서 항균 효과를 보이고 있다. 반면 E.
- 결과를 Table 6에서 나타내었다. V. parahaemolyticus 가 500 ppm에서 증식의 억제가 나타나기 시작하여 가장 민감하게 반응하였고, 최고 실험 농도인 2, 500 即m에서는 거의 살균 효과를 보였고, 이것은 Mok 등(34)이 단삼의 ethanol 주줄 물 실험에서 V. parahaemolyticus^} 최소증식 억 제 농도가 800 ppm 이상을 나타낸 것과 항균효과 면에서 비교할 수 있다. 그 외 S.
- aureus는 본 실험의 최고농도인 2500 ppm에서도 증식 억제가 나타나지 않았다. S cerevisiae^ 고농도에서 약간의 억제 효과를 나타내고 있지만 그 정도는 아주 미미하게 나타났다, K parahaemolyticus 를 제외한 실험에 사용된 모든 균종에서 미량의 methanol 추출물은 오히려 미생물의 증식에 긍정적인 효과를 나타내 었다. 즉 control보다는 methanol 추출물의 500 ppm 첨 가가 균 증식을 더욱 증가시켰다.
- aeruginosa^ 초기균수 약l(f/mL로 접종한 후, 37℃에서 진탕 배양하였고, 배양 중 1시간 간격으로 생균 수를 측정하였다. Fig. 4에서 나타난 결과로 1%의 methanol 추출물 첨가에서 그 살균 효과는 아주 강하게 나타남으로서 0.5%와 비교할 때 농도의 효과를 크게 보이고 있다. 이 그래프를 회귀방정식으로 정리하여 살균의 속도를 Table 7에 나타내었다.
- 이 그래프를 회귀방정식으로 정리하여 살균의 속도를 Table 7에 나타내었다. 농도가 2배로 증가되었을 때 살균의 속도는 약 10배 정도 증가됨을 알 수 있고, 초기 균수의 90% 정도를 살균하는 데 소요되는 시간은 1% 농도에 서는 약 26분, 0.5% 농도에서는 약 250분 정도가 필요한 것으로 나타났다.
- Ames 실험 계를 이용한 항돌연변이 효과는 Salmonella 讪m TA100에 서 간접돌연변이 원인 aflatoxin Bi에 대해 methanol 추출물은 1.25〜5.0%에서 11〜70%의 항돌연변이 활성을 나타냈었고, 직접 돌연변이 원인 MNNG에 대해서는 46〜85%의 항돌연변이 활성을 나타내었다. 또한meth- anol 추출물을 분획하여 얻은 각 용매별 획분 중에서 는 afla- toxin Bi에 대해서는 hexane 획분이, MNNG에 대해서는 bu tanol 획분이 89% 및 95%로 가장 큰 항돌연변이 효과를 나타내었다.
- 0%에서 11〜70%의 항돌연변이 활성을 나타냈었고, 직접 돌연변이 원인 MNNG에 대해서는 46〜85%의 항돌연변이 활성을 나타내었다. 또한meth- anol 추출물을 분획하여 얻은 각 용매별 획분 중에서 는 afla- toxin Bi에 대해서는 hexane 획분이, MNNG에 대해서는 bu tanol 획분이 89% 및 95%로 가장 큰 항돌연변이 효과를 나타내었다. 항미생물 효과의 조사에서는 오이 methanol 추출물이 실험 균주 11종 중 8종의 세균에 대하여 항균 활성을 나타내었다.
- aeruginosa KCTC 2004가 clear zone 13 mm로서 가장 항균 활성에 민 감한 균종으로 나타났다. 각 용매별 획분 중에 서는 hexane 획분은 V. parahaemolyticus KCTC 24기에 대하여 항균효과를 보였고, chloroform과 ethyl acetate 획분에서도 약하게 항균효과를 보였다. Methanol 추출물의 농도에 따른 균 증식억제 효과의 결과로는 V.
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