[국내논문]동치미 유래 생균제로서 가능성이 있는 Lactobacillus sp. FF-3의 분리와 특성 Isolation and Characterization of Lactobacillus sp. FF-3 for Probiotics Production from Korean Dongchimi.원문보기
생균제로서 가능성 있는 유산균의 선별을 위해 발효식품인 동치미로부터 분리된 균주들의 내산성, 내담즙성, 내췌장 액성 및 유해균 억제능을 조사하였다. 특히 분리된 균종 중에서 FF-3가 인공위액과 담즙산에 대한 높은 내성을 나타내었을 뿐만 아니라, Salmonella sp. 과 Escherichia coli에 대하여 높은 항균 활성을 나타내었다. FF-3유래 박테리오신은 그람 양성 및 음성 세균에서 넓은 항균 범위를 나타내었다 본 연구에서 최종선별된 FF-3 균주를 16s rDNA sequence 동정한 결과 Lactobacillus sp.으로 확인되어 FF-3으로 명명하였다.
생균제로서 가능성 있는 유산균의 선별을 위해 발효식품인 동치미로부터 분리된 균주들의 내산성, 내담즙성, 내췌장 액성 및 유해균 억제능을 조사하였다. 특히 분리된 균종 중에서 FF-3가 인공위액과 담즙산에 대한 높은 내성을 나타내었을 뿐만 아니라, Salmonella sp. 과 Escherichia coli에 대하여 높은 항균 활성을 나타내었다. FF-3유래 박테리오신은 그람 양성 및 음성 세균에서 넓은 항균 범위를 나타내었다 본 연구에서 최종선별된 FF-3 균주를 16s rDNA sequence 동정한 결과 Lactobacillus sp.으로 확인되어 FF-3으로 명명하였다.
For selection of lactic acid bacteria for probiotics, we have examined isolated strains from Korean Dongchimi to assess the acid, bile, and pancreatic tolerance and the growth inhibition on the pathogens. Especially, a kind of isolated strains, FF-3 showed the highest resistancy to both of HCl and b...
For selection of lactic acid bacteria for probiotics, we have examined isolated strains from Korean Dongchimi to assess the acid, bile, and pancreatic tolerance and the growth inhibition on the pathogens. Especially, a kind of isolated strains, FF-3 showed the highest resistancy to both of HCl and bile salt, as well as the highest inhibitory activities against Salmonella sp. and Escherichia coli. Further the bacteriocin of FF-3 showed relatively wide range of inhibition spectrum against gram positive and some gram negative bacterias. By using 16s rDNA sequencing method, FF-3 of the selected lactic acid bacteria were found to be identified as genus Lactobacillus.
For selection of lactic acid bacteria for probiotics, we have examined isolated strains from Korean Dongchimi to assess the acid, bile, and pancreatic tolerance and the growth inhibition on the pathogens. Especially, a kind of isolated strains, FF-3 showed the highest resistancy to both of HCl and bile salt, as well as the highest inhibitory activities against Salmonella sp. and Escherichia coli. Further the bacteriocin of FF-3 showed relatively wide range of inhibition spectrum against gram positive and some gram negative bacterias. By using 16s rDNA sequencing method, FF-3 of the selected lactic acid bacteria were found to be identified as genus Lactobacillus.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 내산성, 내담즙산성 및 병원성균증식억제능 등의 생균제로서 이용 가능성이 있는 유산균을동치미로부터 분리하여 그 특성을 조사하였다.
제안 방법
생균제로서 가능성 있는 유산균의 선별을 위해 발효식품 인 동치미로부터 분리된 균주들의 내산성, 내담즙성, 내췌장 액성 및 유해균 억제능을 조사하였다. 특히 분리된 균종 중에서 FF-3가 인공위액과 담즙산에 대한 높은 내성을 나타내 었을 뿐만 아니라, Salmonella sp.
수집된 동치미는 4℃에서 약 15일간 보관하여 숙성시켰다. 유산균을 분리하기 위한 선택배지로 brobocresol purple(BCP)을 함유한 BCP agar(BCP 0.004%, bacto-peptone 0.5%, yeast extract 0.25%, tween 80 0.1%, L-lysine 0.01%, fucose 0.1%, agar 1.5%) 배지를 사용하였으며, 준비된 시료를 homogenize한 후 평판희석 도말법을 이용하여 BCP agar 배지에 평판 도말하였다. 37℃에서 1~3일 지켜보며 균체 주변에 황색환을 형성하는 균주를 1차 선별하였다.
37℃에서 1~3일 지켜보며 균체 주변에 황색환을 형성하는 균주를 1차 선별하였다. 1차 선별된 균주들은 BCP agar 배지에 단독으로 spot 배양하여 그중 활성이 우수한 균주들을 2차 선별하였다. 선별된 균들은 내산성, 내담즙산성, 내췌장액성 및 항균력 을 관찰하여 가장 우수한 균주를 선발하여 gram 염색, 현미경 관찰, catalase 반응 그리고 10% 환원탈지유에서의 curd 형성 여부 등을 통한 생리학적 성질을 조사한 후 한국생명공학연구원 유전자센터에 의뢰하여 16s rDNA 염기서열로 동정한결과 Lactobacillus sp.
2차 선별된 균주들의 생육 정도를 알아보기 위해 각각 종배양된 배양액을 MRS broth 배지에 2% 접종하여 37C에서 24시간 배양하였다. 배양액 1 mL을 0.
배양하였다. 배양액 1 mL을 0.85% NaCl 9 mL가 든시험관에 넣고 vortexing한 후 1/10의 배수로 경시적으로 희석한 뒤, 각각 100 μL를 준비된 MRS agar에 도말한 후 37℃ 에서 24시간 배양 후 생균수를 측정하였다. 일반적으로 균수가 약 30~ 300 범위에 들어오는 petridish를 골라 희석배율을 곱한 값을 생균수로 나타내었다.
배양액 1 mL를 각각 50 mL의 인공위액 (1, 000 U pepsin/mL NB, pH 3.0)과 pH 7.0의 Nutrient Broth(NB)배지액(50 mL, 대조군)에 넣고 2시간 동안 37℃에서 정치시킨 뒤, 이 중 1 mL를 취해 0.85% NaCl로 연속 희석시켜 petridish에서 배양하고 생균수를 측정하였다. 인공위액의 조제는 Kobayashi(18) 등의 방법을 변형한 것으로 배양액의 pH를 1 N HC1 로 3.
85% NaCl로 연속 희석시켜 petridish에서 배양하고 생균수를 측정하였다. 인공위액의 조제는 Kobayashi(18) 등의 방법을 변형한 것으로 배양액의 pH를 1 N HC1 로 3.0으로 조정하고 pepsin을 1,000 U/mL되도록 첨가하였다.
0.22jim filter(Millipore, Membrane Filter, Ireland) 로 여과 제균된 돼지 췌장액(Sigma Chemical Co., St. Louis, USA)을 0.5% 첨가한 배양액에 인공 위액의 pH와 담즙산에서 생존한 균을 접종하였다. 37℃에서 24시간 배양 후 100 μL를 petridish에 도말한 뒤 이것을 37℃에서 24시간 배양 후 나타난 생균수를 측정하였다.
분리 균주를 MRS broth배지에서 24시간 배양한 후 4℃에서 IQOOOxg 로 원심분리하여 상등액을 얻어 0.22 pm filter(Millipore, Membrane Filter, Ireland)를 통과시켜 cell free supernatant를 회수하였다. 항균력 측정은 agar diffusion assay 의 방법(19)을 변형하여 사용하였다.
22 pm filter(Millipore, Membrane Filter, Ireland)를 통과시켜 cell free supernatant를 회수하였다. 항균력 측정은 agar diffusion assay 의 방법(19)을 변형하여 사용하였다. 즉, MRS agar를 미리첨가시켜 굳힌 배양 접시에 억제 여부 시험균을 1% 접종한 MRS soft agar(agar 0.
항균력 측정은 agar diffusion assay 의 방법(19)을 변형하여 사용하였다. 즉, MRS agar를 미리첨가시켜 굳힌 배양 접시에 억제 여부 시험균을 1% 접종한 MRS soft agar(agar 0.7% 포함) 7 nL를 첨가하여 표면을 미리 건조시킨 다음 원심분리한 상등액을 5 uL 점적하여 12시간 배양한 후 억제환 생성 여부로 판정하였다.
분리 균주의 항균 spectrum을 조사하기 위하여 부패 및 병원균을 포함하는 gram 양성 및 gram 음성균들을 대상으로 억제 환을 측정하였다. 수정된 agar diffusion assay의 방법(19) 을 사용하여 억제환 크기(mm)를 비교하였다.
부산시 사하구 일원의 일반가정에서 수집한 동치미를 4℃에서 15일간 숙성시켜 BCP를 함유한 plate count agar 배지에황색환을 형성하는 약 20여 균주을 1차 분리하였다 1차 분리된 균주를 단독 spot 배양하여 2차로 우수한 6균주를 선별하였다. 선별된 균주들을 각각 MRS broth에 37℃에서 24시간동안 배양 후 내산성, 내담즙액성 및 내췌장액성 뿐만 아니라 병원성균 억제력이 우수한 1균주를 최종 선발하였다.
선별된 균주들을 각각 MRS broth에 37℃에서 24시간동안 배양 후 내산성, 내담즙액성 및 내췌장액성 뿐만 아니라 병원성균 억제력이 우수한 1균주를 최종 선발하였다.
비슷한 양상을 나타내었다. 생균제로서의 1, 2차 조건을 조사하여 최종 선발된 균주 FF-3의 특성을 조사하고, 동정하였다.
0.22jim filter(Millipore, Membrane Filter, Ireland) 로 여과 제균된 돼지 딤즙산 (Sigma Chemical Co., St. Louis, US A)을 0.3% 첨가한 배양액에, 인공 위액의 pH에서 생존한 균을 접종하였다(15). 37℃에서 24시간 배양 후 100 J1L를 petridish에도말하고 이것을 37℃에서 24시간 배양 후 나타난 생균수를측정하였다
대상 데이터
균주 선별 및 동정
동치미로부터 유산균의 분리를 위하여 2002년 12월 중순 부산시 사하구 지역 일반가정 10여 곳에서 동치미를 수집하였다. 수집된 동치미는 4℃에서 약 15일간 보관하여 숙성시켰다.
이론/모형
측정하였다. 수정된 agar diffusion assay의 방법(19) 을 사용하여 억제환 크기(mm)를 비교하였다.
성능/효과
최종선발된 균주의 생리학적 특성을 조사한 결과 gram 양성의 간균으로 포자를 형성하지 않으며, catalase 음성, 혐기또는 호기에서도 성장하였다. 10% 환원 탈지유에 배양 시 curd를 형성하였고, glucose 배양 시 gas를 형성하지 않는 정상발효 유산균이었다(Table 1).
호기에서도 성장하였다. 10% 환원 탈지유에 배양 시 curd를 형성하였고, glucose 배양 시 gas를 형성하지 않는 정상발효 유산균이었다(Table 1). 본 균주를 16s rDNA sequence 동정 결과 Lactobacillus pentosus JCM 1588과 99.
10% 환원 탈지유에 배양 시 curd를 형성하였고, glucose 배양 시 gas를 형성하지 않는 정상발효 유산균이었다(Table 1). 본 균주를 16s rDNA sequence 동정 결과 Lactobacillus pentosus JCM 1588과 99.59%, Lactobacillus plantarum ATCC 8014와 99.45%의 상동성을 보여 Lactobacillus sp.로 동정되었으며, 본 연구자들에 의하여 Lactobacillus sp.
분리된 균들 모두 산을 생성하며 생육 정도도 일반적인 유산균과 비슷하였다. 생균제로서의 가능성에서 분리 균들의 산에 대한 생존률은 FF-3, FF-5, FF-6가 각각 90.20%, 98.57% 및 90.00% 로 위산에 매우 강한 균임이 확인되었으며 특화, FF-3균주가 가장 많은 생균수를 나타내었다. 반면, 생육에서 가장 좋았던 FF-1 균은 24.
00% 로 위산에 매우 강한 균임이 확인되었으며 특화, FF-3균주가 가장 많은 생균수를 나타내었다. 반면, 생육에서 가장 좋았던 FF-1 균은 24.40%로 낮은 생존률을 보여 산에 대한 저항성이 약한 것으로 나타났다(Table 4). 담즙산에서의 생존률은 위산과 상대적으로 비슷한 결과를 나타내었으나 전체적으로 생존률이 매우 낮았다.
아마도 분리 균들도 이러한 작용 때문에 담즙산의 존재하에서 생존률이 급격히 줄어든 것으로 추정된다. 위산과 담즙산에서 생존한 균들의 췌장액에서의 생존률은 FF-1 을 제외한 나머지 균들에서 1.2~2.8배 정도 더 생육함을 확인할 수 있었다(Table 6). 따라서.
따라서. 생균제로서의 1차 조건으로 내산성, 내담즙산성 및 내췌장액성을 조사한 결과 FF-3, FF-5, FF-6의 3종의 균주가 생존률이 우수한 것으로 나타났다.
위 결과에 따른 유해균의 억제능을 각각 조사한 결과 Table 7과 같이 나타났다 3종 모두 유해균에 대한 억제능을가지고 있는 것으로 확인되었으며, FF-3와 FF-6 두 종의 균주가 비슷한 양상을 나타내었다. 생균제로서의 1, 2차 조건을 조사하여 최종 선발된 균주 FF-3의 특성을 조사하고, 동정하였다.
분리균과 같은 속의 Lactobacillus delbrueckii-lactis KCTC 1058과 Lactobacillus brevis KCTC 3498에는 항균 활성이 나타나지 않았다. 또한 부패균에 대한 항균 활성보다는 병원균에 대한 항균 활성이 더 높은 것으로 확인되었다.
특히 분리된 균종 중에서 FF-3가 인공위액과 담즙산에 대한 높은 내성을 나타내 었을 뿐만 아니라, Salmonella sp. 과 Escherichia co에 대하여 높은 항균 활성을 나타내었다. FF-3유래 박테리오신은 그 람 양성 및 음성 세균에서 넓은 항균 범위를 나타내었다.
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