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문제 정의
- 위의 여러가지 문헌들을 참고해 본 결과, 민자주방망이 버섯은 식용과 약용 등의 가치가 매우 높고, 국내에도 널리 자생하는 버섯임에도 불구하고, 국내에서의 식용 및 의 약적 이용을 위한 기초적인 배양연구와 유전학적인 연구가 부족한 실정이다. 이에 인공재배와 유용성분검색 및 분류 의 기초가 되는 배양특성과 유전적 특성을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 시행하였다.
제안 방법
- 이들 배지 중 PDA배지의 경우는 PDA 39.0 g/1, pH 5.4로 조제하였으며, MEA배지는 MEA 33.6g/l, pH 5.4로 조제하였다. 그리고 YM배지는 glucose 10.
- O Gas로 멸균된 직경87 mm의 Petri dish에 50 ml씩 분주하여 완전히 식힌 후, 직경 5 mm의 cork borer를 이용하여 접종하였다. 접종 후 25±1℃의 incubator에서 25일간 배양하여 균총의 직경을 측정하여 평균하였다.
- pH별 균사의 생장속도를 알아보기 위하여 Yamanaka배지를 기본배지로 하여 IM HCl 과 IM NaOH로 pH 4, 5, 6, 7, 8로 각각 조절한 뒤, 121℃(1.2 kg/㎠)에서 20분간 멸균하고, 고체배지의 경우 E.O Gas로 멸균한 직경 87 mm의 Petri-dish에 50 ml씩 분주하여 완전히 식히고 직경 5 mm 의 cork borer로 접종한 후, 25±1℃의 incubator에 25일간 배양하여 균총의 직경을 측정하여 평균하였다. 액체배지의 경우는 250 ml flask에 100 ml의 배지를 분주하여 IM HCl과 IM NaOH로 pH를 각각 4, 5, 6, 7, 8로 조절한 후 121 ℃(1.
- O Gas로 멸균한 직경 87 mm의 Petri-dish에 50 ml씩 분주하여 완전히 식히고 직경 5 mm 의 cork borer로 접종한 후, 25±1℃의 incubator에 25일간 배양하여 균총의 직경을 측정하여 평균하였다. 액체배지의 경우는 250 ml flask에 100 ml의 배지를 분주하여 IM HCl과 IM NaOH로 pH를 각각 4, 5, 6, 7, 8로 조절한 후 121 ℃(1.2 kg/㎠)에서 20분간 멸균하고 접종한 뒤, shaking incubator에서 25℃, 120 rpm으로 25일간 배양하고 배양액 을 filter papei로 여과시킨 후, 80℃ 의 dry oven에서 24시간 건조시켜 균사의 건중량을 측정하였다.
- 탄소원의 변화에 따른 균사의 생장속도를 알아보기 위하여 첨가탄소원으로 단당류인 fucose, 이당류인 sucrosez 다당류인 starch의 3종을 선정하여, pH 5.4의 기본배지에 각각의 탄소원을 20.0 g씩 첨가하여 제조하였고, 질소원의 변화에 따른 균사생장속도를 알아보기 위하여 첨가질소원 으로 무기태질소원 중 암모늄태인 ammonium tartrate, 유 기태질소원인 yeast extract, 복합질소원인 peptone, 그리고 유기태질소원 중 아미노산태인 asparaginee 4종의 질소원 을 선정하여 위와 동일한 방법으로 배양, 측정하였다.
- Demturation을 위해 94℃에서 2분간 1 cycle을 program하고, 45 cycle을 94 ℃ 에서 30초간 denaturation, 40℃ 에서 1분간 annealing, 72℃ 에서 2분간 extension한 후 최종적으로 1 cycle을 72℃ 에서 5분간 extension하였다. PCR한 product들을 ethdium bromide를 첨가한 1% agarose g이에서 TAE buffer를 사용하여 85volt 로 전기영동한 후 UV상에서 나타나는 band 들을 관찰하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용한 민자주방망이버섯은 2000년 9월 초순경, 경상북도 경산시 하양읍에 소재한 대구가톨릭대학교 북편 야산의 참나무와 소나무, 아카시아나무 혼합림에서 채집하였다. 채집한 버섯으로부터 조직의 일부분을 분리하여 PDA배지와 Yamanaka배지에 접종하여 251 incubator에서 배양하였다.
- 실험에 사용한 민자주방망이버섯은 2000년 9월 초순경, 경상북도 경산시 하양읍에 소재한 대구가톨릭대학교 북편 야산의 참나무와 소나무, 아카시아나무 혼합림에서 채집하였다. 채집한 버섯으로부터 조직의 일부분을 분리하여 PDA배지와 Yamanaka배지에 접종하여 251 incubator에서 배양하였다. 균사의 성장과정 중 육안과 현미경상으로 균사의 색깔과 모양 등에서 기존의 문헌에서 서술한 민자 주방망이버섯과 일치하는 특징을 나타내는 균사를 Lepista nuda로 간주하여 계대배양하였고, 그 중 성장속도가 빠른 균주를 분리하여 실험에 사용하였다.
- 채집한 버섯으로부터 조직의 일부분을 분리하여 PDA배지와 Yamanaka배지에 접종하여 251 incubator에서 배양하였다. 균사의 성장과정 중 육안과 현미경상으로 균사의 색깔과 모양 등에서 기존의 문헌에서 서술한 민자 주방망이버섯과 일치하는 특징을 나타내는 균사를 Lepista nuda로 간주하여 계대배양하였고, 그 중 성장속도가 빠른 균주를 분리하여 실험에 사용하였다.
- 배지에 따른 민자주방망이버섯 균사의 생장속도를 알아보기 위하여, 일반적으로 버섯균사의 배양실험에서 많이 사용하는 4종의 배지 (PDA, YM, GPB, MEA)와 균근성 버섯의 배지로 많이 사용하는 1종의 배지(Yamanaka)를 선정하였다. 이들 배지 중 PDA배지의 경우는 PDA 39.
- primer. 는대전에 소재한 Genotech사에 주문제작하여 사용하였다. PCR을 위한 reaction mixture의 조성은 Takara PCR kit 에 첨부된 사용지침에 따랐다.
이론/모형
- 는대전에 소재한 Genotech사에 주문제작하여 사용하였다. PCR을 위한 reaction mixture의 조성은 Takara PCR kit 에 첨부된 사용지침에 따랐다. Lepista nuda의 genomic DNA 1 ㎕에 Ttzt/ polymerase 0.
- 를 100 M까지 채웠다. PCg] 사용한 thermal cycler는 영국 Techne사의 Progene였으며, PCR 조건은 박 등(1997)의 방법에 따라 수행하였다. Demturation을 위해 94℃에서 2분간 1 cycle을 program하고, 45 cycle을 94 ℃ 에서 30초간 denaturation, 40℃ 에서 1분간 annealing, 72℃ 에서 2분간 extension한 후 최종적으로 1 cycle을 72℃ 에서 5분간 extension하였다.
성능/효과
- 7mm으로 거의 성장하지 못하였다. pH별 균사생장속도는 pH6의 경우가 고체 배지에서 균총직경 69.5 +1.7mm, 액체배지에서 균사건중량 39mg으로 가장 양호하였으며 pH7, 8의 경우 고체배지에서 65.8 + 3.3mm, 액체배지에서 31mg과 고체배지에서 47.0±6.9mm, 액체배지에서 16mg으로 pH6에 비하여 조금 둔화된 생장을 보였다. pH5에서는 고체배지에서 41.
- 9mm, 액체배지에서 26mg으로 pH8과 비슷하였으나, pH4의 경우는 전혀 생장하지 못하였다. 탄소원의 변화에 따른 균사의 생장 속도는 다당류인 starch를 탄소원으로 첨가한 배지가 고체 배지의 경우 균총의 직경이 46.8 +1.7mm, 액체배지의 경우 균사의 건중량이 65mg로 가장 양호하였고, 그 다음은 이당류인 sucrose를 탄소원으로 첨가한 배지가 39.3±2.8mm, 42mg이었으며, 단당류인 glucose의 경우 19.9 ± 2.2mm, 23mg으로 생장이 저조하였다. 질소원의 변화에 따른 균사 생장 속도는 유기태질소원인 yeast extract와 복합질소원인 peptone을 질소원으로 첨가한 배지가 고체배지에서의 균총의 직경이 31.
- 2mm, 23mg으로 생장이 저조하였다. 질소원의 변화에 따른 균사 생장 속도는 유기태질소원인 yeast extract와 복합질소원인 peptone을 질소원으로 첨가한 배지가 고체배지에서의 균총의 직경이 31.0 +3.2mm, 액체배지에서의 균사의 건중량 43mg과 균총직경24.5 ±1.7mm, 균사건중량 32mg으로 양호하였고, 무기태질소원 중 암모늄태인 ammonium tartrate 를 질소원으로 첨가한 배지에서는 균총직경 18.8 +1.7mm, 균사건중량 8mg으로 생장이 저조하였다.
- 배지에 따른 균사의 생장속도비교실험 결과, Yamanaka 배지에서 가장 좋은 성장을 보였는데, 이 배지는 여러 가지 미량원소들을 함유하고 있어서, 균근성버섯에 대한 적정 배지로 보고되고 있으므로 낙엽분해성 또는 일부 수종에서 균근성으로 보고된[4] 민자주방망이버섯의 균 사배지로 적합한 것으로 보인다. pH에 따른 균사의 생장속도 비교실험 결과 pH 6에서 가장 양호한 생장을 보여 주었는데, 이는 같은 속의 Lepista sordida가 pH 6에서 균사생장이 가장 양호하다는 보고[11]와 일치된 결과를 보여주고 있다.
- pH에 따른 균사의 생장속도 비교실험 결과 pH 6에서 가장 양호한 생장을 보여 주었는데, 이는 같은 속의 Lepista sordida가 pH 6에서 균사생장이 가장 양호하다는 보고[11]와 일치된 결과를 보여주고 있다. 그러나 pH 7과 8에서의 생장도 비교적 양호하고 배양 초기부터 균사가 특유의 연보라색을 띠고 있어 민자주방망이버섯은 초기 pH가 중성과 약알칼리에서도 생장이 가능한 사실과, 초기pH가 높을수록 균사의 색깔이 일찍 발현되는 현상이 관찰되었다. 질소원에 따른 균사생장속도비교 실험의 결과, yeast extract에서 가장 좋은 생장을 보이고 ammonium tartrate에서 가장 저조한 생장을 보였는데, 이로 미루어 볼 때 민자주방망이버섯의 경우는 무기태 질소원보다 유기태질소원의 이용이 용이한 것으로 보여진다.
- 그러나 pH 7과 8에서의 생장도 비교적 양호하고 배양 초기부터 균사가 특유의 연보라색을 띠고 있어 민자주방망이버섯은 초기 pH가 중성과 약알칼리에서도 생장이 가능한 사실과, 초기pH가 높을수록 균사의 색깔이 일찍 발현되는 현상이 관찰되었다. 질소원에 따른 균사생장속도비교 실험의 결과, yeast extract에서 가장 좋은 생장을 보이고 ammonium tartrate에서 가장 저조한 생장을 보였는데, 이로 미루어 볼 때 민자주방망이버섯의 경우는 무기태 질소원보다 유기태질소원의 이용이 용이한 것으로 보여진다. 이는 같은 과에 속하는 송이버섯의 균사생육에 yeast extract가 가장 양호한 결과를 나타내었다는 보고[이와 일치한 결과를 보인다.
- 배지별 균사생장속도는 Yamanaka배지가 균총의 직경이 54.3±3.6mm로 가장 양호했으며, PDA배지도 52.8 +3.3mm 로 거의 동일한 수준으로 양호하였다. MEA배지와 GPB배지는 29.
후속연구
- 이는 같은 과에 속하는 송이버섯의 균사생육에 yeast extract가 가장 양호한 결과를 나타내었다는 보고[이와 일치한 결과를 보인다. 탄소원과 질소원의 배지내 적정비율에 대한 실험은 실시하지 못하였는데, 이 또한 균사의 생장에 중요한 변수 중의 하나이므로 이에 대한 실험을 보강하여야 할 것으로 사료된다.
- RAPD의 결과, 느타리버섯속과 자주방망이버섯속을 유전적다형성에 의한 분류에서 유사군으로 분류한 보고(2)와는 달리 primer에 따른 밴드패턴이 상이한 점을 발견하였는데, 이는 본 실험에서 사용한 primer의 수가 적어서 확인에 어려움이 있으므로, 가능한 한 많은 수의 primer와 sample을 이용한 RAPD 분석을 실시하여 유사도 지수분석을 통해 확인을 해야 할 것으로 생각된다. 또한 실험에 사용한 민자주방망이버섯은 채집한 균주이 므로 공시 균주와의 RAPD를 통한 PCR band pattern 비교분석과, 차후 자실체와 균사의 DNA를 PCR-RAPD band pattern의 비교분석을 통하여 확인해 볼 필요가 있다.
- 통해 확인을 해야 할 것으로 생각된다. 또한 실험에 사용한 민자주방망이버섯은 채집한 균주이 므로 공시 균주와의 RAPD를 통한 PCR band pattern 비교분석과, 차후 자실체와 균사의 DNA를 PCR-RAPD band pattern의 비교분석을 통하여 확인해 볼 필요가 있다.
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