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제안 방법
- Fr. 3의 TLC 분리 전개용매로 petroleum ether : ethyl ether : acetic acid(70 : 30 :1)와 hexane: ethyl ether : 1% fonnic acid(80 : 20 : 2) 두 종류를 사용하였으며, 발색제로는 25% 황산 그리고 Rf치 확인대조물질로 triglyceride오]" cholesterol을 사용하여 추정성분의 Rf치와 발색특성을 조사하였다.
- 19) 부위 를 긁어 내 어 acetone에 용해 하고 여과한 뒤 acetone을 N-; 가스를 이용하여 건조시 켰다. Chloroform으로 잔류물을 용해하여 일정량으로 만든 다음 분광광도계 (Unicon 930, Kontron Co.)를 이용하여 400—700 nm사이의 흡수 스펙트럼을 조사하였다. HPLC를 이용한 retention time 의 분리 특성을 조사하기 위해 표준품으로 carotenoid는 lutein, cryptoxanthin, lycopene, 0-carotene을, chlorophyll a는 Sigma 사 제품을 사용하였다.
- Rf치 별 HPLC 성분분석에서 분리되어진 retention time별성 분을 조사하기 위해 HPLC에 RP Cis 칼럼 (4 X150 mm Inertsil ODS-2)이 연결된 HPLC에 시료수집기를 부착시켜 각 화합물의 피크에 해당하는 시간대 에 분리되는 이동상 용액을 알미늄 호일로 차광한 수집관내에 자동으로 회수하였다. 수집된 용액은 실온에서 감압농축기를 이용하여 차광 하에 증발 건조시 키고 잔류물은 N2 가스로 완전히 건조시 킨 다음 항암성분 확인과 동정에 사용하였다.
- TLC 전개 후 분리된 Rf 0.19와 Rf 0.25 band의 silica gel을 회수하여 acetone에 용해하고 여 과한 다음 건조시 킨 잔류물을 犯etor比에 재용해하였다. 이 용액을 시료수집 기가 연결된 HPLC에 주입 하고 retention time별로 수집 한 Rf 0.
- 또한, carotenoid 계통의 화합물을 분석할 때 시료 중에 함유되 어 있는 chlorophyll, pheophytin, lipid 등을 제거하기 위하여 20% KOH 용액을 사용하여 실온에서 2시간 정도의 검화 과정을 거친 후 분석한다. 본 실험에서 TLC 분석시료에 20% KOH를 사용하여 동일한 검 화과정을 거치고 440 nm의 분석 파장에서 분석하였을 때 Fig.
- 본 실험에서 항암물질로 잠정적으로 동정된 pheophytin a 와 pyropheophytin a가 암세포 증식 억 제 효과가 있는가를 검정 하기 위해 인간 대 장암 세포의 하나인 HCT-116 cancer celH] 두중잎의 petroleum ether extract(Sa L), column chro-matography(CC)의 fraction l(Sa 2), fraction 3(Sa 3), silica gel thin layer chromatography(TLC)의 Rf 0.19(Sa 4)와 Rf 0.25(Sa 5) 발색 부위 band의 성분을 추출하여 암세포 증식억제 실험을 한 결과는 Fig. 9 및 10과 같다.
- 05(주황), 출발점에서의 주황색 band 등 3개 band를 합쳐 총 6개의 band가 분리되었다. 분리된 band들이 중성 지 질 그룹의 화합물인지를 확인하기 위해 전개용매로 petroleumether : ethyl ether : acetic acid(70 : 30 :1)를 사용하여 전개시 켰다. 이 어 TLC 판을 100℃에서 건조 후 황산으로 분무하고 230℃에서 가열하여 발색 시 킨 결과 Rf치 0.
- 증식되어 세포수가 약 5X1&1 또는 5X105 cell/dish로 되었을 때, 두충잎에서 분리한 화합물을 일정 농도별로 조제한 시험용액이 함유된 새로운 배양액으로 교체 하였다. 이 배 양액을 24, 48, 72시간 간격으로 배양하면서 생성된 암세포를 tiypsin-EDTA로 처리하여 분리하고 0.9% NaCl 로 희석한 다음 hemocytometer 를 이 용 invert micro -scope로 각 시험군의 세포수를 측정 비교하였으며 대조군은 ethyl alcoh이을 첨가하여 동일한 방법으로 시 험하였다.
- 즉, 음건한 두충잎 시료 6 g을 Soxlilet 장치 에서 petroleum ether 150 mL로 70℃ 에서 16시간 추출한 후 진공농축기 (Buchi RE 121 rotary evaporator)로 감압농축하고 Na 가스로 잔류 물을 건조시 켜 조추출물을 조제 하였다. 다음에 silicic acid 40 g을 120℃의 건조기 에서 2시간 동안 활성화하고 충진한 유리 칼럼 (2.
- 항암추정 성분에 대한 분자량 동정은 HPLC로 정제한 물질을 Fast atom bombardmentZMass(Micromassz]- Autospec)를 사용하여 해 당화합물의 mass spectrum을 조사하고 분자량을 측정하였다.
대상 데이터
- Cancer celle 서울대학교 암 세포주 은행에서 분양 받은 인체 대장암세포인 HCTT16을 사용하였으며, cancer cell의 배양은 Hwang 등의 방법 ⑺에 준하였다. 즉 5% fetal bovine serum, penicillin 100 units/mL, streptomycin 10 Ug/mL가 함유된 Dulbeco's modified essential medium 배지를 사용하여 T-75 플라스크에 이식시킨 후 5% CO2가 공급되는 37℃ incubator에서 monolayer로 배양하였으며, 플라스크에 임■세포가 약 4 X IO, cell/mL로 증식 되면 phosphate buffers saline으로 세 척 하고 0.
- HPLC를 이용한 retention time 의 분리 특성을 조사하기 위해 표준품으로 carotenoid는 lutein, cryptoxanthin, lycopene, 0-carotene을, chlorophyll a는 Sigma 사 제품을 사용하였다. Chlorophyll b와 chlorophyll 관련 유도체의 표준화합물은 신선한 상치로부터 제조한 Chlorophyll을 산과 열을 이용해 만든 시료를 사용하였으며 HPLC 분석 조건은 Table 1과 같다.
- )를 이용하여 400—700 nm사이의 흡수 스펙트럼을 조사하였다. HPLC를 이용한 retention time 의 분리 특성을 조사하기 위해 표준품으로 carotenoid는 lutein, cryptoxanthin, lycopene, 0-carotene을, chlorophyll a는 Sigma 사 제품을 사용하였다. Chlorophyll b와 chlorophyll 관련 유도체의 표준화합물은 신선한 상치로부터 제조한 Chlorophyll을 산과 열을 이용해 만든 시료를 사용하였으며 HPLC 분석 조건은 Table 1과 같다.
- 본 실험에 사용한 두충나무 잎은 경상남도 합천에서 생육되고 있는 10년생 두중나무잎을 7월에 채 취 하여 음지 에서 건조한 후 사용하였다.
이론/모형
- Lee(6)의 방법에 의해 시료의 조제 및 분리를 행하였다. 즉, 음건한 두충잎 시료 6 g을 Soxlilet 장치 에서 petroleum ether 150 mL로 70℃ 에서 16시간 추출한 후 진공농축기 (Buchi RE 121 rotary evaporator)로 감압농축하고 Na 가스로 잔류 물을 건조시 켜 조추출물을 조제 하였다.
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