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문제 정의
- 대두발효식품의 항산화 활성을 알아보기 위하여 in vitro와 in vivo에서 과산화지질의 생성 억제와 항산화관런 효소인 superoxide dismutase (SOD), catalase 및 glu tathion peroxidase 활성을 증강시키는 실험을 실시하였다.
- 생체의 대사과정에서 발생하는 유해산소종의 하나인 superoxide (6)는 $니peroxide dismutase (SOD)에 의하여 소거된다. 본 실험은 발효 대두 식품의 SOD유사 활성을 알아보기 위하여 측정한 결과를 나타내었다(Table 1).발효 대두 식품의 SOD 활성을 확인하기 위하여 항산화 활성이 높은 것으로 알려진 플라보노이드인 quercetin 및 녹차catechin과 비교한 결과 발효 대두 식품의 메탄올 추출물을 50 ㎍/mL 를 첨가하였을 때의 활성은 각각 54.
제안 방법
- Cyochrome c, 38 mg, 2 "M xanthine 10 mL(0.001 N NaOH), 50 mM sodium phosphate buffer(pH 7.8, 0.1 mM EDTA)100 mL를 혼합한 기질액 2 mL에 희석한 시료를 넣고 2분간 안정화시킨 후 xanthine oxidase (0.2 unit/mL, 0.1 mM EDTA) 50 를 cuvette에 넣고 혼합하여 spec- trophotometer(UV-2100, Shimagu co. Japan)를 이용하여 550 nm에서 2분간 홉광도를 측정하였다.
- 이에 본 연구는 SOD 활성이 높은 Bacillus sp. BH-99를 대두에 접종한 후 발효시켜 SOD 데 두 발효식품으로서 기능성을 검토하였다.
- Fig. 3은 대두발효식품을 사료에 첨가하여 2주간 사육한 후 glutathion peroxidase^] 활성을 측정하였다. 대조군에서는 9.
- H2O2를 기질로 하여 H2O2를 소모하는 속도를 측정하여 간 microsome의 catalase activity를 측정하였다 [5]. 30% hydrogen peroxide 30 μL를 0.
- SOD의 활성 측정은 Fridovich 방법[기에 준해서 측정하였다. Xanthine/xanthine oxidase 반응으로 생성된 sup eroxide anion에 의해 cytochrome c가 환원되는 것을 측정하였고, SOD에 의하여 superoxide anion의 양이 감소하여 cytochrome c의 변화 속도가 감소하는 것으로 SOD 활성을 측정하였다.
- 간장의 cytosol 획분에서 글루타치온 퍼옥시 다이-제 (glu tathione peroxidase : GSHPx)의 활성의 측정하였다 [14].시험관에 cytosol에 인산완충용액(0.
- 4 mL/kg씩 경구 투여하였다. 검액은 투여하지 않고 CCU 만 투여하여 양성대조 군으로 하였고, CCli 및 검액을 투여하지 않고 com oil만 투여하여 정상 대조군으로 하였다..
- 한편, CCZ를 투여하여 쥐간에 손상을 일으킨 후발효 대두를 첨가한 식이군에서는 항산화 관련 효소 및 SOD와 catalase, glutathion peroxidase 활성이 CCg 처리군보다 증가하는 경향은 발효 대두가 항산화 관련 효소의 활성과 관련이 있는 것으로 판단된다. 그리고 CC14로 간에 손상을 일으킨 쥐에 발효 대두를 첨가한 식이를 급여한 군에서 SOD, catalase, glutatliion peroxidase의 활성을 억제시켰으며 이때 유의성을 볼 수 있었다.
- 사염화탄소(CC14)에 의한 지질과 산화 유발 : 휜쥐 1군을 7마리로 하여 두 군은 2주간 시료를 200 mg/kg, 500 mg/ kg씩 saline에 녹여서 경구투여하였고, 두 군은 검액 대신 saline을 투여하였다. 투여마지막 날 미리 6시간 절식 시 키고 com oil에 용해시켜 CCU 0.
- 상기의 간 microsome 분획의 균질액에 10 % sodium dodecyl sulfate 용액을 첨가하고 실온에서 30분간 방치한 다음 0.1 M HC1 과 0.37% thiobarbituric acid 용액을 가한 후 혼합액을 끓는 물에서 45분간 반응시킨 후, 냉각하여 부칠 알코올를 가해 혼합하고 LOOOxg에서 원심분리한 후 상층의 부칠 알코올 층을 532 nm에서 홉 광도를 측정하였고, tetramethoxypropane을 표준액 으로 사용하여 MDA량을 정량하였다 [18].
- 간장의 cytosol 획분에서 글루타치온 퍼옥시 다이-제 (glu tathione peroxidase : GSHPx)의 활성의 측정하였다 [14].시험관에 cytosol에 인산완충용액(0.3 M phosphate buffer with 4.0 mM EDTA, pH 7.2) O.lmL, 증류수 1, 295 mL,26.56 mM sodium azide 용액 0.5 mL, 294.37 mM G5H용 액 60 uL, 8.4 mM NADPH (35.0 mg NADPH/5.0 mL of 0.3 M phosphate buffer with 4.0 mM EDTA)110 uL, glutathione reductase 5 mL, 1 mM hydroperoxide 320 uL 를 첨가하여 5초간 잘 혼합한 후, 분광광도계를 사용하여 340 nm에서 홉 광도를 15초 간격으로 2분간 측정하여 표준 검량선에 의해 GSHPx (IU/g protein) 의 활성을 계산하였다.
- 쥐를 이용한 in vivo에서의 항산화 활성을 알아보기 위하여 발효 대두 식품을 mt에 2주일간 사료에 섞어 먹인 후 간 microsome 분획에 존재하는 SOD, catalase 및 gluta thione peroxidase^ 항산화계 효소에 미치는 영양을 검토하였다.
- 사염화탄소(CC14)에 의한 지질과 산화 유발 : 휜쥐 1군을 7마리로 하여 두 군은 2주간 시료를 200 mg/kg, 500 mg/ kg씩 saline에 녹여서 경구투여하였고, 두 군은 검액 대신 saline을 투여하였다. 투여마지막 날 미리 6시간 절식 시 키고 com oil에 용해시켜 CCU 0.4 mL/kg씩 경구 투여하였다. 검액은 투여하지 않고 CCU 만 투여하여 양성대조 군으로 하였고, CCli 및 검액을 투여하지 않고 com oil만 투여하여 정상 대조군으로 하였다.
- 한편, Fig. 2는 발효 대두를 쥐에 2주일간 투여한 후 쥐간의 microsoine 획분에 존재하는 catalase 활성을 비교하였다. 정상 사육한 대 조군의 catalase 활성은 19.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 Sprague-Dawley(SD)계 수컷 rat는 화학 연구소에서 분양받아 2주 이상 실험사육장의 환경에 적응시킨 후 7마리씩 4군으로 나누어 삼양유지의 기본 사료 (control group)로써 사육하면서 대두발효식품 농축액을 SD계 rat에 하루 200 및 500 mg/kg씩 각각 사료에 첨가하여 사육하였다. SD 수컷 rat는 몸무게 200-220 g의 암컷, 8주령되는 것을 사용하였고 동물사육실은 항온항습 (22±2°C, 65 + 2% RH)하에서 삼양유지의 마우스용 pellets 사료를 주었으며, 물은 자유롭게 먹게 하고, 12시간 cycle 외 조건 하에서 실험하였다.
- 본 실험에 사용된 Sprague-Dawley(SD)계 수컷 rat는 화학 연구소에서 분양받아 2주 이상 실험사육장의 환경에 적응시킨 후 7마리씩 4군으로 나누어 삼양유지의 기본 사료 (control group)로써 사육하면서 대두발효식품 농축액을 SD계 rat에 하루 200 및 500 mg/kg씩 각각 사료에 첨가하여 사육하였다. SD 수컷 rat는 몸무게 200-220 g의 암컷, 8주령되는 것을 사용하였고 동물사육실은 항온항습 (22±2°C, 65 + 2% RH)하에서 삼양유지의 마우스용 pellets 사료를 주었으며, 물은 자유롭게 먹게 하고, 12시간 cycle 외 조건 하에서 실험하였다.
- BH-99를 접종한 다음 38 ℃에서 3일간 배양한 후 동결건조한 후 분말로 만들어 저온에 보관하였다 [24]. 이 때 사용한 배지 조성은 0.5% fu cose, 0.5% polypeptone, 0.5% yeast extract, 0.02% K2HPO4, 0.002% MgSO4 . 7H2O, 0.
데이터처리
- 본 실험에서의 결과치의 유의성은 Student's t-test 법으로 검정하였다.
이론/모형
- SOD의 활성 측정은 Fridovich 방법[기에 준해서 측정하였다. Xanthine/xanthine oxidase 반응으로 생성된 sup eroxide anion에 의해 cytochrome c가 환원되는 것을 측정하였고, SOD에 의하여 superoxide anion의 양이 감소하여 cytochrome c의 변화 속도가 감소하는 것으로 SOD 활성을 측정하였다.
- 시료의 지질과산화물 생성 억제 효과를 linoleic acid를 기질로 사용하여 Nose의 방법[19] 에 따라 POV를 측정하였다. Linoleic acid 100와 각 시료(5 mg/mL) 10를 1.
성능/효과
- 4%의 억제율을 나타내었다. 이상의 실험 결과에서 발효 대두의 경우 항산화제로 알려진 stechirf및 quercetin괴" 비교해보면 지칠 과산화 효과가 거의 비슷한 수준으로 우수한 활성을 나타내었다.
- . 59% 정도의 활성이 높았으나, 발효 대두를 200 mg/kg 첨가군에서 16, 47+3.06 U/mg, protein 으로 CC14 처리군에 비하여 40% 증가하였으며, 500 mg/ kg 첨가군에서는 20, 86+3.46 U/mg「protein으로 50.73 %의 증가로 1% 수준에서 유의성이 인정되었다.
- Bacillus sp Bu-99로 만든 발효 대두의 동물실험 결과 쥐의 간의 microsome의 SOD, catalase, 이utatkdon peroxidase 및 지실과 산화물의 생성 억제 효과를 항산화 효소의 작용으로, 생물체의 세포막을 보호하여 노화 등을 예방할 것으로 생각된다.
- Fig. 1에서 보는 바와 같이 실험동물인 쥐에 사염화탄소(CC10를 처리하여 간에 과산화 지질을 유발시킨 후 SOD 의 활성을 측정한 결과 정상 사육한 대조군 SOD 활성이 24.0i3.23U/mg, pmtein으로 CC14 처리군의 9, 84+2.50 U/mg, protein이었다..
- In vitro 실험에서 항산화 활성을 실험한 결과 대두발효식품은 pov와 과산화지질의 생성을 유의성 있게 억제시켰으며 quercetin과 catechin^ 비교한 결과 SOD 활성은 상당히 높았다.
- Linoleic acid가 지질에 대한 과산화물 생성 억제 효과는 Table 2와 같다. 과산화지질은 대조구의 POV가 12452 meq/kg에 대하여 발효대두는 POV가 1822 meq/kg으로 대조군에 비하여 85.4%의 억제효과를 나타내었고 현재 사용되고 있거나 알려진 항산화제로서 대조구인 catechin의 경우는 85.0%의 억제율을 나타내었고, quercetin는 86.4%의 억제율을 나타내었다. 이상의 실험 결과에서 발효 대두의 경우 항산화제로 알려진 stechirf및 quercetin괴" 비교해보면 지칠 과산화 효과가 거의 비슷한 수준으로 우수한 활성을 나타내었다.
- 그리고 대두발효 식품을 SD계 수컷쥐에 2주간 사료에 첨가하여 먹인 후 항산화 활성을 측정한 결과, 대두발효식품을 쥐에 투여하여 사염화탄소(CC14)로 손상을 유도시킨 뒤 쥐의 간microsome의 지질과 산화를 유의성 있게 억제시켰다. 항산화 관련 효소인 SOD, catalase 및 glu tathion peroxidase 활성은 유의성 있게 증가하였고, 지질과 산화도 억제시켰다.
- 본 실험은 발효 대두 식품의 SOD유사 활성을 알아보기 위하여 측정한 결과를 나타내었다(Table 1).발효 대두 식품의 SOD 활성을 확인하기 위하여 항산화 활성이 높은 것으로 알려진 플라보노이드인 quercetin 및 녹차catechin과 비교한 결과 발효 대두 식품의 메탄올 추출물을 50 ㎍/mL 를 첨가하였을 때의 활성은 각각 54.53±2.60 mg, protein에 비하여 대조구의 quercetin의 경우 50 ㎍/ mL 첨가구의 SOD가 각각 59.42 + 3.74 mgz protein이었고 catechin^ 경우 50 ㎍/mL 첨가구에서 각각 48.84 ±2.32 mg, protain이였다. 본 실험 결과 발효 대두 식품의 SOD 대조구인 quercetin의 SOD보다는 약간 낮았으나 녹차의 catxhhi 보다는 높은 활성을 나타내었다.
- 32 mg, protain이였다. 본 실험 결과 발효 대두 식품의 SOD 대조구인 quercetin의 SOD보다는 약간 낮았으나 녹차의 catxhhi 보다는 높은 활성을 나타내었다.
- 본 실험 결과 발효 대두는 과산화지질의 억제 효과가 상당히 높게 나타났다. 그리고 쥐를 이용한 Fe2+ -ascorbate system에서도 catechin과 quercetin간의 대조구로 하여microsoTne의 과산화지질의 억제 효과를 실험한 결과 이를 대표적인 항산화제와 비슷한 효과를 나타내었다.
- 본 실험 결과에서 발효 대두 식품의 80 % 메탄올 추출물이 활성산소 소거능이 있는 것으로 판단된다.
- 본 실험 결과에서 발효 대두는 in vivo에서 SOD의 활성을 증가시키면서 지칠과 산화를 억제하였다.
- 이렇게 생성된 radicals는 세포막의 인지질인 polyenoic fatty acid의 methyl carbon을 공격하여 과산화지질을 야기하어 간세포를 괴사시킨다[26]. 본 실험걸 과로서 CCL의 처리군에 발효 대두를 첨가하였을 대 SOD의 활성이 증가하는 것으로 보아 과산화지질을 억제하는 것으로 사료된다.
- 이러한 실험 결과는 생체 내에서 발효 대두 식품이 CCI4에 의하여 손상되었든 간에 SOD와 catalase의 활성이 회복되는 것을 볼 수 있었고 과산화지질의 생성은 발효 대두 식품에 대하여 억제되었다.
- 10 nmole/mg7 protein으로 80, 0%의 억제 효과를 나타내었다. 이상의 실험 결과로 보아 발효 대두 의 지질과 산화 억제 효과는 상당히 높은 것으로 사료된다.
- 2는 발효 대두를 쥐에 2주일간 투여한 후 쥐간의 microsoine 획분에 존재하는 catalase 활성을 비교하였다. 정상 사육한 대 조군의 catalase 활성은 19.65±2.73 U/mg, pTQtein이였으나 CC14 처리군에서는 8.17±3.401 U/mg, protein으로 CCl^ 대조군에 비하여 58.5 % 감소하였으나 발효 대두 200 mg/kg 첨가군에서는 13.28±2.17 U/mg> protein으로 CC" 처리군에 비하여 31.94 % 증가하였고 500 mg/kg 첨가군에서는 17.04±1.28 U/mg, protein 으로 40.98 %의 증가를 나타내어 유의성이 있었다.
- 4는 in vivo에서 발효 대두첨가식이가 주간의 microsome 획분의 지질과 산화의 생성을 나타내었다. 정상 사육한 대 조군의 과산화지질의 지표인 malondialdehyde (MD씨는 L63±0.26 nmole/m& protein이었으나 CCZ 처리군에서는 3.37+0.84 nmole/mg, protein이였으나, 발효 대두 200mg/kg첨가군에서는 2.28 ± 0.12 nmole/mg, pro- tein으로 32.4% 감소하였고, 500 mg/kg 첨가군에서는 1.73 ±0.17 nmole/mg, protein으로 48.7% 감소하여 유의성이 인정되었다.
- In vivo에서 간의 microsome 분획에 대한 지질과 산화에 대하여 malondialdehyde (MDA)의 결과를 Table 3에 나타내었다. 지질 과산화에 대한 실험 결과 대조군은 10.42 nmol/mg protein 이었으나/ 항산화 활성이 높은 것으로 알려진 대두 발효식품의 80% 메탄올 추출물를 50 ㎍ 첨가하였을 때 2.50 nmole/mgz protein으로 76, 1%의 억제 효과를 볼 수 있었다. Catechin를 50 ㎍ 첨가 한 경우 2.
- 한편, CCZ를 투여하여 쥐간에 손상을 일으킨 후발효 대두를 첨가한 식이군에서는 항산화 관련 효소 및 SOD와 catalase, glutathion peroxidase 활성이 CCg 처리군보다 증가하는 경향은 발효 대두가 항산화 관련 효소의 활성과 관련이 있는 것으로 판단된다. 그리고 CC14로 간에 손상을 일으킨 쥐에 발효 대두를 첨가한 식이를 급여한 군에서 SOD, catalase, glutatliion peroxidase의 활성을 억제시켰으며 이때 유의성을 볼 수 있었다.
- 그리고 대두발효 식품을 SD계 수컷쥐에 2주간 사료에 첨가하여 먹인 후 항산화 활성을 측정한 결과, 대두발효식품을 쥐에 투여하여 사염화탄소(CC14)로 손상을 유도시킨 뒤 쥐의 간microsome의 지질과 산화를 유의성 있게 억제시켰다. 항산화 관련 효소인 SOD, catalase 및 glu tathion peroxidase 활성은 유의성 있게 증가하였고, 지질과 산화도 억제시켰다.
후속연구
- 따라서, 발효 대두는 항산화 관련 효소의 활성을 높여주고 지질과 산화를 억제하므로서 노화 등 성인병 예방에 기여할 것으로 생각되어진다.
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