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문제 정의
- 생리활성에 대한 연구로는 동속식물인 Chysanthenmm iWcm(감국)의 alcohol 추출물의 혈압저하작용과 항균성에 대한 보고가 있으며(16), 쑥갓의 간독성보호작용(17)에 대한 연구가 보고되어 있으나 쑥갓에서 생리활성을 나타내는 단일물질에 대한 연구는 좀 더 활발히 수행되어야 할 필요가 있다. 본 연구에서는 쑥갓의 생리활성에 대한 후속 연구로 쑥갓의 총 메탄을 추출물이 아질산염 소거작용과 SOD 유사활성을 가짐을 확인하고 총 메단을 추출액으로부터 각 유기용매의 분획을 제조하여 활성분획으로부터 그 활성 성분을 분리하고 활성물질의 화학적 구조를 밝혀 기능성 식품으로서의 개발 가능성을 조사하였다.
가설 설정
- 1)EC50 values represent the concentration (ppm) required for 50% inhibition of SOD-like activity.
제안 방법
- 정제를 위하여 sephadex 컬럼크로마토그래피를 행하고 분리된 시료를 헥산과 에틸 아세테이트의 혼액으로 재결정을 반복하여 흰색의 결정성 분말 compound I을 얻었다. Compound Ie Mass spectrum (VG 70-VSEQ spectrometer, UK), 1H-NMR과 "C-NMR data (Brucker AMX 500 Spectrometer, Brucker, Germany)에 의 하여그 구조를 동정하였다.
- 자연 건조시킨 쑥갓 3 kg을 잘게 절단하여 환류 냉각장치를 부착시킨 추출기에서 80% 메탄을로 60-70℃, 6시간씩 3회 추출한 후 여과하여 추출액을 모으고 그 여액을 rotary evaporator(Uni- trap UT-1000, EYELA, Japan)로 40"C에서 감압 농축하여 총 추출물 300g 얻었다. 이 추출물을 증류수에 현탁시킨 후 용매 극성에 따라 순차적으로 추출하여 각 분획을 제조하여(17) 클로로 포름(chloroform, 아 ICQ 분획물 71 g, 부탄을(시, utanol, n-BuOH) 분획물 28 g과 물(HQ) 분획물 57 g을 얻어 이들 각 분획으로 아질산염 소거작용 및 SOD 유사활성 실험을 하였다.
- 0으로 조절하여 반응용액을 10 mW 하였다. 이 용액을 37。(2에서 1시간 반응시킨 후 각 반응액을 1 mL씩 취하여 2% 초산용액 5mL와 Griess시약(30% HC1 로 제조한 1% naphthylamine과 1% sulfenilic acid의 1 :1 혼액) 0.4 mL를 가하여 잘 혼합한 후 실온에서 15분간 방치시킨 후 생성되는 azo화합물의 흡광도를 520nm에서 microplate reader(Thennomax, Molecular Devices, Suny-vale, CA, USA)로 측정하여 잔존하는 아질산염량을 비교하였다. 대조구로는 Griess시약 대신 증류수를 0.
- 각 시료의 아질산염 소거작용은 Kato(18) 등의 방법에 의하여 다음과 같이 측정하였다. 1 mM NaNO2 용액 2mL에 시료 추출물 0.1 g< 가한 후 0.1 N HC1, 0.2 M 구연산 완충액을 이용하여 pH를 각각 1.5, 3.0, 4.5, 6.0으로 조절하여 반응용액을 10 mW 하였다. 이 용액을 37。(2에서 1시간 반응시킨 후 각 반응액을 1 mL씩 취하여 2% 초산용액 5mL와 Griess시약(30% HC1 로 제조한 1% naphthylamine과 1% sulfenilic acid의 1 :1 혼액) 0.
- Compound I 100 mg에 10%의 염산(HC1)을 넣고 I00℃ 항온수조에서 6시간 동안 가수분해하여 실온에 방치한 후 IN KOH-g- 액으로 중화시키고 가수분해된 aglycone을 클로로포름으로 추출하여 농축시킨 후 가수분해하기 전의 compound I과 TLC로 비교하여 가수분해 되었음을 확인하였다. 위의 클로로포름 분획물을 농축 시켜 컬럼크로마토그래피로 정제한 후 1H-NMR과 TLC로 비교하여 가수분해된 aglycone이 gitosterol임을 확인하였고 수층의 당은 표준품과 함께 부탄을 : 초산 : 에틸에테르 : 물(9 : 6 : 3 : 1) 의용매계에서 TLC로 비교하여 glucose임을 확인하였다.
- 4 mL를 가하여 잘 혼합한 후 실온에서 15분간 방치시킨 후 생성되는 azo화합물의 흡광도를 520nm에서 microplate reader(Thennomax, Molecular Devices, Suny-vale, CA, USA)로 측정하여 잔존하는 아질산염량을 비교하였다. 대조구로는 Griess시약 대신 증류수를 0.4 mL 가하여 위와 같은 방법으로 실시하였으며, 아질산염 소거작용은 화합물을 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우의 흡광도 차이에 의한 백분율로 나타내었다. 양성대조군으로 사용한 vitamin C는 여러 농도로 제조하여 아질산염의 소거작용을 구하였으며 또 다른 대조군으로 활성이 확인되어 있는 chlorogenic acid(19)도 같은 농도로 제조하여 그 소거작용을 구하였다.
- 정용한 것을 시료액으로 하였다. 시료액 0.95 mL를 취해 24 mM pyrogallol(10 mM HC1 포함) 50jiL를 가한 후 420 nm에서 초기 2분간의 흡광도 차이를 UV spectrophotometer(UVPC- 2101 UV-VIS, Shimadzu, Japan)로 측정하였다. SOD 유사활성은 TCB 0.
- 쑥갓의 항산화 활성을 알아보기 위해 쑥갓 총 메탄을 추출물의 아질산염 소거작용과 SOD 유사활성을 측정하였다. 아질산염 소거작용과 SOD 유사활성을 가지고 있는 총 메탄을 추출물로부터클로로포름, 阡부탄을 및 물 분획물을 제조하여 각각의 활성을 측정하였다.
- 소거작용과 SOD 유사활성을 측정하였다. 아질산염 소거작용과 SOD 유사활성을 가지고 있는 총 메탄을 추출물로부터클로로포름, 阡부탄을 및 물 분획물을 제조하여 각각의 활성을 측정하였다. pH가 1.
- 5일 때의 클로로포름 분획물의 IC%값은 39 ppm으로 가장 우수한 아질산엄 소거작용을 보였으며, vitamin C 와 chlorogenic acid의 岛。값이 15 ppm과 36 ppm일 때 클로로포름 분획물은 양성대조군인 chi이ogenic acid와 동등한 소거작용을 보였다. 아질산염 소거작용에 대하여 유의성 있게 높은 활성을 나타낸 클로로포름 분획 물을 silica gel 컬 럼 크로마토그래 피 와 sephadex LH-20 컬럼크로마토그래피를 이용하여 분획의 활성 성분인 compound【을 분리하였다. 분리된 compound를 ’H-NMR과 "C-NMR spectral data를 통하여 구조를 동정한 결과 compound I 은 g-sitostei.
- 4 mL 가하여 위와 같은 방법으로 실시하였으며, 아질산염 소거작용은 화합물을 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우의 흡광도 차이에 의한 백분율로 나타내었다. 양성대조군으로 사용한 vitamin C는 여러 농도로 제조하여 아질산염의 소거작용을 구하였으며 또 다른 대조군으로 활성이 확인되어 있는 chlorogenic acid(19)도 같은 농도로 제조하여 그 소거작용을 구하였다.
- 유의성 있는 활성을 나타내었던 쑥갓의 클로로포름 분획물 60 g을 클로로포름과 메탄을의 혼합용매를 사용하여 컬럼크로마토그래피를 수행하였다. 유출 용매는 클로로포름 : 메탄을(50:1 )의 혼합용매를 시작으로 극성을 증가시키면서 순차적으로 용매를 유출시켜 12개의 분획을 얻었으며, 이렇게 얻은 소분획을 TLC로 확인하면서 같은 형광을 가지며 &치가 같은 성분을 함유하는 분획들을 모았다.
- 수행하였다. 유출 용매는 클로로포름 : 메탄을(50:1 )의 혼합용매를 시작으로 극성을 증가시키면서 순차적으로 용매를 유출시켜 12개의 분획을 얻었으며, 이렇게 얻은 소분획을 TLC로 확인하면서 같은 형광을 가지며 &치가 같은 성분을 함유하는 분획들을 모았다. 이 증 활성이 있는 분획 XI, XU를 silica g可로 충진시킨 컬럼에서 클로로포름 : 메탄을(12:1) 용매계로 극성을 높여가면서 순차적으로 용출시켜 1-8의 소분획을 얻었다.
- 300g 얻었다. 이 추출물을 증류수에 현탁시킨 후 용매 극성에 따라 순차적으로 추출하여 각 분획을 제조하여(17) 클로로 포름(chloroform, 아 ICQ 분획물 71 g, 부탄을(시, utanol, n-BuOH) 분획물 28 g과 물(HQ) 분획물 57 g을 얻어 이들 각 분획으로 아질산염 소거작용 및 SOD 유사활성 실험을 하였다.
- 31 로 anisaldehyde 발색시 짙은 보라색을 띄었으며 long wave 에서 blue형광을 보였고, short wave에서 검게 보였다. 정제를 위하여 sephadex 컬럼크로마토그래피를 행하고 분리된 시료를 헥산과 에틸 아세테이트의 혼액으로 재결정을 반복하여 흰색의 결정성 분말 compound I을 얻었다. Compound Ie Mass spectrum (VG 70-VSEQ spectrometer, UK), 1H-NMR과 "C-NMR data (Brucker AMX 500 Spectrometer, Brucker, Germany)에 의 하여그 구조를 동정하였다.
대상 데이터
- 쑥갓의 추출과 컬럼크로마토그래피용 용매는 급 시약(Duksan, Korea)을 1차 증류하여 사용하였고, 그 외에는 분석용 1급 시약(Junsei Chemical, Japan)을사용하였다. 또한 TLC 발색시약 anisaldehyde-HeSQ spray reagent 는 anisaldehyde 0.5 mL와 98% acetic acid 10 mL, 메탄을(metha- nol, MeOH) 85 mL의 흔액을 H2SO4 5 mL와 혼합하여 제조하여 사용하였고, FeCl, reagent는 10% 수용액으로 만들어 사용하였다.
- m (Phannacia, Sweden)의 것을, TLC(Thin layer chromatography)용으로는 precoated plates(UV indicator, Sigma, USA)를 사용하였으며, 항산화 활성 측정용 시약으로 pyrogallol, ascorbic acid, chlorogenic acid, naphtylamine, cacodylic acid, hydrochloric acid, sodium nitrite, citrate buffer, acetic acid, Tris- base는 특급 시약(Sigma)을 사용하였고 sultanilic acid는 1 급 시약 (Kanto chemical, Japan)을 사용하였다. 쑥갓의 추출과 컬럼크로마토그래피용 용매는 급 시약(Duksan, Korea)을 1차 증류하여 사용하였고, 그 외에는 분석용 1급 시약(Junsei Chemical, Japan)을사용하였다. 또한 TLC 발색시약 anisaldehyde-HeSQ spray reagent 는 anisaldehyde 0.
- 자연 건조시킨 쑥갓은 1999년 2월에 서울대학교 약학대학 부속 약초원에서 공급받아 사용하였으며, 증거표본은 서울대학교 약학대학 부속 약초원에 보존하였다.
이론/모형
- 간접적으로 측정할 수 있다(20, 21). SOD 유사활성은 Marklund(22) 등의 방법에 따라 측정하였다. 추출한 시료 20 g에 50 mM Tris-cacodylic acid buffer(TCB, pH 8.
- 이를 이용하여 측정할 수 있다. 각 시료의 아질산염 소거작용은 Kato(18) 등의 방법에 의하여 다음과 같이 측정하였다. 1 mM NaNO2 용액 2mL에 시료 추출물 0.
성능/효과
- 6%로 가장 활성이 높았다(Table 3). 1,000 ppm까지의 농도에서는 총 메탄을 분획물과 클로로포름 분획물의 활성이 큰 차이를 보이지 않았으나 2, 000 ppm의 높은 농도에서는 클로로포름 분획물의 활성이 크게 나타나는 특징을 보였다. 양성대조군인 vitamin C와 chlorogenic acid의 EC、。값은 각각 38 ppm, 449 ppm으로 높은 활성을 나타내는 반면에 각 분획물에서는 대부분의 EC%값이 2,000 ppm 이상을 나타내었고, 클로로포름 분획물만이 1, 860 ppm으로 분획물 중에서 가장 높은 활성을 나타내었다(Table 4).
- Compound Ie TLC의 발색양상으로 steroid 유도체임을 추측할 수 있었는데 Mass spectnim 결괴-, (M'-glucose)의 m/z 414의 peak 가 관찰되었고, 1H-NMR specti'al data에서 J = 6.9 Hz의 anomeric doublet이 8 5.21에서 나타남으로서 sterol이 배당체 상태로 존재함을 알 수 있었다(Table 5). 또한, 6 0.
- 1). Compound I의 1顷(값은 335 ppm로 양성대조군으로 사용한 vitamin C와 chlorogenic acid의 IC&)값인 15 ppm과 36 ppm과 비교하였을 때 다소 높았으나, 伊sitosterol의 IC50 값은 32 ppm으로 vitamin C보다는 2배 정도 높았으며 이ilorogenic acid보다는 오히려 더 낮은 1C釦값을 가졌다(Table 2). 식물 sterol 은 식물계에 널리 분포되어 있으며 일상적인 식생활에서 빈번히 섭취되고 있으나 그 생리활성에 대한 연구는 최근까지도 계속 그 영역이 확대되어 ceramide metabolism의 촉진작용(27), RAW 264.
- Compound【(^-sitosterol-(시3-D-gh」coside)은 pH 1.5, 320 ppm의 농도에서 49.5%의 아질산염 소거작용을 나타냈으며 가수분해한 aglycone인 0-sitosterole 80 ppm의 낮은 농도에서도 63.4%를 나타냄으로서 가수분해된 aglycone싱태일 때 훨씬 소거작용이 높음을 알 수 있었다(Fig. 1). Compound I의 1顷(값은 335 ppm로 양성대조군으로 사용한 vitamin C와 chlorogenic acid의 IC&)값인 15 ppm과 36 ppm과 비교하였을 때 다소 높았으나, 伊sitosterol의 IC50 값은 32 ppm으로 vitamin C보다는 2배 정도 높았으며 이ilorogenic acid보다는 오히려 더 낮은 1C釦값을 가졌다(Table 2).
- 1,000 ppm까지의 농도에서는 총 메탄을 분획물과 클로로포름 분획물의 활성이 큰 차이를 보이지 않았으나 2, 000 ppm의 높은 농도에서는 클로로포름 분획물의 활성이 크게 나타나는 특징을 보였다. 양성대조군인 vitamin C와 chlorogenic acid의 EC、。값은 각각 38 ppm, 449 ppm으로 높은 활성을 나타내는 반면에 각 분획물에서는 대부분의 EC%값이 2,000 ppm 이상을 나타내었고, 클로로포름 분획물만이 1, 860 ppm으로 분획물 중에서 가장 높은 활성을 나타내었다(Table 4).
- pH가 1.5일 때의 클로로포름 분획물의 IC%값은 39 ppm으로 가장 우수한 아질산엄 소거작용을 보였으며, vitamin C 와 chlorogenic acid의 岛。값이 15 ppm과 36 ppm일 때 클로로포름 분획물은 양성대조군인 chi이ogenic acid와 동등한 소거작용을 보였다. 아질산염 소거작용에 대하여 유의성 있게 높은 활성을 나타낸 클로로포름 분획 물을 silica gel 컬 럼 크로마토그래 피 와 sephadex LH-20 컬럼크로마토그래피를 이용하여 분획의 활성 성분인 compound【을 분리하였다.
- 2). 같은 실험 에서 chlorogenic acid의 EC%값은 449 ppm이었고 p-sitosterol 의 E* C)값은 1, 291 ppm, comound I의 ECs(값은 2,000 ppm 이상으로 양성대조군인 chlorogenic acid에 비해서는 활성이 떨어짐 을 알 수 있었다(Table 4).
- 21에서 나타남으로서 sterol이 배당체 상태로 존재함을 알 수 있었다(Table 5). 또한, 6 0.67과 8 0.95에서의 2개의 singlet angular methyl group, 8 0.86-8 0.91 사이의 3개의 methyl group, 8 1.00에서으] 丿 =6.5 Hz의 doublet methyl peak 들로 비당부가 0-sitosterol임을 알 수 있었고 가수분해히-여 당부의 glucose와 alycone인 (B-sitosterol을 확인하였다. "C-NMR spectral data에서도 102.
- 분리한 compound I과 가수분해한 aglycone의 SOD 유사 활성을 측정한 결과 두 물질 모두 활성이 확인되었는데 배당체 상태의 compound Ie 활성이 낮아 2,000 ppm에서 30.2%의 활성을 보였으나 가수분해 된 gsiiosterole 전체 분획물 중 가장 유사 활성이 좋았던 클로로포름 분획물 2,000 ppm에서의 53.6%(Table 3) 보다더 높은 62.1%를 나타내어 SOD 유사활성도 가수분해된 aglycone 상태의 ster이이 훨씬 활성이 높음을 알 수 있었다(Fig. 2). 같은 실험 에서 chlorogenic acid의 EC%값은 449 ppm이었고 p-sitosterol 의 E* C)값은 1, 291 ppm, comound I의 ECs(값은 2,000 ppm 이상으로 양성대조군인 chlorogenic acid에 비해서는 활성이 떨어짐 을 알 수 있었다(Table 4).
- Compound I과 그 aglycone인 p-sitosteiol의 아질산염 소거작용과 SOD 유사 활성은 다소 차이가 있었다. 양성대조군으로 사용한 vitamin C와 chlorogenic acid의 1(為값이 pH 1.5에서 각각 15 ppm과 36 ppm일때 compound I의 1(品값이 335 ppm, 0-sitoster이의 1(品값이 41 ppm으로 가수분해된 aglycone이 아질산염 소거작용이 훨씬 높았다. SOD 유사활성의 경우 vitamin C와 chlorogenic acid의 EC50 값은 38 ppm, 449 ppm으로 이와 비교시 p-sitosterol괴- 배당체의 ECS0 값은 1, 291 ppm과 2,000 ppm 이 상으로 나타났다.
- 가수분해 되었음을 확인하였다. 위의 클로로포름 분획물을 농축 시켜 컬럼크로마토그래피로 정제한 후 1H-NMR과 TLC로 비교하여 가수분해된 aglycone이 gitosterol임을 확인하였고 수층의 당은 표준품과 함께 부탄을 : 초산 : 에틸에테르 : 물(9 : 6 : 3 : 1) 의용매계에서 TLC로 비교하여 glucose임을 확인하였다.
- 일반적으로 총 메탄을 추출물을 비롯한 모든 분획물의 SOD 유사 활성이 각 분획물의 농도가 증가할수록 농도 의존적으로 증가하였으며 클로로포름 분획물은 2,000 ppm에서 53.6%로 가장 활성이 높았다(Table 3). 1,000 ppm까지의 농도에서는 총 메탄을 분획물과 클로로포름 분획물의 활성이 큰 차이를 보이지 않았으나 2, 000 ppm의 높은 농도에서는 클로로포름 분획물의 활성이 크게 나타나는 특징을 보였다.
후속연구
- 근래에 극심하게 증가하여 그 위험성이 대두되고 있는 성인병 질환의 원인이 활성산소에 기인된 것이라는 학설이 인정되어짐에 따라(2-5) 이를 조절할 수 있는 superoxide dismutase(SOD), catalase, glutathione peroxidase 등의 항산화성 효소와 함께 vitamin E, vitamin C, 카로테노이드, glutathione 및 ubiquinone 등의 항산화성 물질들이 연구되어 왔으며(6) 이들이 생체 내에서 생성되거나 음식물에서의 섭취 등을 통해 생체를 보호하고 있다고 전해진다. 따라서 활성산소를 소거할 수 있으며 식품에 존재하는 항산화 물질들이 과산화물에 의해 야기되는 각종 노화성질환의 억제제 및 치료제로 개발될 수 있다고 기대되는 바이다.
- 쑥갓과의 근연식물인 유럽원산의 Chrysanthemum 의 화학적 성분에 대한 연구로는 flavonoid( 11), acetylene계 화합물(12), sesquiter- pene( 13, 14), quinic acid 등이 보고되고 있으나(15) 국내에서 일상적인 식품으로 빈번하게 이용되고 있는 쑥갓의 경우는 그 생리활성과 성분에 대한 연구가 미미한 실정이다. 생리활성에 대한 연구로는 동속식물인 Chysanthenmm iWcm(감국)의 alcohol 추출물의 혈압저하작용과 항균성에 대한 보고가 있으며(16), 쑥갓의 간독성보호작용(17)에 대한 연구가 보고되어 있으나 쑥갓에서 생리활성을 나타내는 단일물질에 대한 연구는 좀 더 활발히 수행되어야 할 필요가 있다. 본 연구에서는 쑥갓의 생리활성에 대한 후속 연구로 쑥갓의 총 메탄을 추출물이 아질산염 소거작용과 SOD 유사활성을 가짐을 확인하고 총 메단을 추출액으로부터 각 유기용매의 분획을 제조하여 활성분획으로부터 그 활성 성분을 분리하고 활성물질의 화학적 구조를 밝혀 기능성 식품으로서의 개발 가능성을 조사하였다.
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