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문제 정의
- 현재 날로 증가 되고 있는 심혈 관계 및 뇌혈관계 질환의 주요 원인 이 되는 혈중 콜레스테롤 농도를 감소시킬 수 있는 생리활성 성분의 검색에 많은 관심이 고조되고 있다. 따라서 본 실험에 서는 우리가 일상적으로 섭취할 수 있는 식품인 치커리 추출물 중에 이러한 생리활성 성분을 검색하는 연구의 일환으로서 고콜레스테롤혈증의 개선작용과 그 작용 기작을 밝혀내고, 노화 및 암 발생에 깊이 관련된 산화스트레스의 지표인 8-hydroxydeoxyguanosine 과 과산화지질 농도에 어떠한 영향을 미치는지를 검토하였다.
가설 설정
- 1) Vahies are means ±SE of 6 rats per group.
- 1) Values are means + SE of 6 rats per group.
- 1) Values are means ± SE of 6 rats per group.
- 2) Between the groups, values with different letters are significantly different at p<0.05.
제안 방법
- 실험 최종일 8시간 이상 절식시킨 후 동물을 에틸에테르로 가볍게 마취 시 킨 후 복부 대동맥으로부터 채혈하여 탈혈 사시 켰으며, 이때 얻어진 혈액은 30분간 정치한 후 3, 000 rpm 에서 15분간 윈심분리하여 혈청을 얻어 지질분석에 사용하였다. 각 조직은 적출한 후 냉각 생리식염수로 충분히 세척하고 물기를 제거한 다음 조직 무게를 측정하였다.
- 간장을 일정량 취해 10 mM Tris-HCKpH 7.4), 10 mM ethylenediaminetetraacetate(EDTA) 및 250 mM sucrose를 함유한 homogenate 용액으로 균질화시킨 후 초원심분리기 (Hitachi 55p-72, Tokyo, Japan)로 microsome 분획을 분리하였다. 분획한 homogenate와 microsome 생체막의 과산화 지질 함량은 전보의 방법(16)에 준하여 정량하였다.
- 뇨는 실험 7일째와 최종 전일의 24시간 동안 대사 케이지를 이용하여 채집하였으며, 뇨단백질량은 BCA protein assay kit(Pierce, Illinois, USA)를 이용하여 microplate reader(Model 1550, Bio-Rad Co., Tokyo, Japan) 570 nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. 8-OHdG 농도는 ELISA kit를 사용하여 microplate reader(Model 1550, Bio-Rad Co.
- 그러나 신장 주변 지방 무게는 각 군 간에 유의한 차이가 없는 것으로 나타나, 치커리 첨가 군에서의 체중 증가는 치커리 추출물의 섭취에 의한 체지방 증가와는 무관한 것으로 사료된다. 본 실험에서 치커리 추출물의 첨가는 식이섬유에 관한 대부분의 영양학적인 연구에서 식이중에 첨가되고 있는 수준에 기초를 두었다(4, 11, 21). 또한 치커리의 식이 중첨가 수준은 일상적인 사람이 매일 섭취하고 있는 25g 전후의 식이섬유 섭취량과 비슷한 수준으로서, WHO에서 권장하고 있는 16-24 g/day과 영국에서 권장하고 있는 12—24 g/day과 거의 비슷한 양으로 생각된다(22, 23).
- 본 실험의 식이 조성은 Table 1과 같이 정상식이군, 콜레스테롤 식이군 및 콜레스테롤 식이에 치커리를 5% 수준으로 첨가시킨 치커리 첨가 군으로 나누고, 이때 치커리 추출물 첨가 대신에 sucrose에서 제외시켰다. 조제한 식이와 탈이 온수는 14일간 자유 급여시켰다.
- 회수한 상층에 10 mL diethyle- ther를 가하여 충분히 혼합한 후 diethylether 층을 회수하여 농축시킨 후 5 mL petroleum ether를 재용해시켜 분 중의 콜레스테롤 추출액으로 하였다. 분변 중의 콜레스테롤 농도 는 시 판 콜레스테롤 측정용 kit(Wako junyaku, Osaka, Japan)로 측정하였다. 또한 회수한 하층에는 2 N 염산을 일정량 가 한 후 10 rnL diethylether를 가하여 잘 혼합 시켜 diethylether 층을 회수하였다.
- 5주령의 Sprague-Dawley 계 수컷횐쥐 를 구입하여 정상 식이로 1주일간 적응시킨 후 각 군의 체중이 균일하게 군당 6마리씩 분배하여 개별 대사 케이지에 넣은 후 온도 22 + 2℃, 습도 50 + 5%, 명암주기 12시간(명기 : 07: 00~ 19: 00기, 암 7] : 19 : 00-07 : 00)으로 자동 제어되는 동물 사육실에서 사육하였다. 사육 기간 중 식이 섭취량은 매일 측정하고, 체중은 2일에 한 번씩 측정하였다.
- 실험 최종일 8시간 이상 절식시킨 후 동물을 에틸에테르로 가볍게 마취 시 킨 후 복부 대동맥으로부터 채혈하여 탈혈 사시 켰으며, 이때 얻어진 혈액은 30분간 정치한 후 3, 000 rpm 에서 15분간 윈심분리하여 혈청을 얻어 지질분석에 사용하였다. 각 조직은 적출한 후 냉각 생리식염수로 충분히 세척하고 물기를 제거한 다음 조직 무게를 측정하였다.
- 실험동물로부터 1주 및 2주째의 뇨를 대사 케이 지로부터 채집하여 단백질량을 측정하였다. 치커리 첨가 군에서 1주째에 유의한 증가를 나타내었으나, 2주 째에는 정상식이군 수준까지 회복되어 실험군간의 차이는 없었다(Table 5).
- 본 실험에 사용된 치커리는 충청북도 청원군 남이면에서 수확된 것을 사용하였다. 치커리를 적당한 크기로 절 편한 다음, 60℃로 설정된 열풍 순환 건조기에서 48시간 건조시켜 치커리 추출 원료로 하였다. 건조된 시료 100g씩을 150"C로 예비가열된 볶음기(태환 자동산업)의 드럼에 넣고 20분간 20 rpm 속도로 볶음 처리를 하였다.
대상 데이터
- 5주령의 Sprague-Dawley 계 수컷횐쥐 를 구입하여 정상 식이로 1주일간 적응시킨 후 각 군의 체중이 균일하게 군당 6마리씩 분배하여 개별 대사 케이지에 넣은 후 온도 22 + 2℃, 습도 50 + 5%, 명암주기 12시간(명기 : 07: 00~ 19: 00기, 암 7] : 19 : 00-07 : 00)으로 자동 제어되는 동물 사육실에서 사육하였다. 사육 기간 중 식이 섭취량은 매일 측정하고, 체중은 2일에 한 번씩 측정하였다.
- 본 실험에 사용된 치커리는 충청북도 청원군 남이면에서 수확된 것을 사용하였다. 치커리를 적당한 크기로 절 편한 다음, 60℃로 설정된 열풍 순환 건조기에서 48시간 건조시켜 치커리 추출 원료로 하였다.
데이터처리
- 본 실험에서 얻어진 실험 결과는 일원 배치 분산분석을 실시하여 유의차(p<0.05) 검정은ncan's의 방법(18)을 사용하였다.
이론/모형
- 간장 총 지질은 Folch 등의 방법 (12) 에 준하여 추출 순화하였다. 간장 중성지질 농도는 Fletcher의 방법 (13) 으로, 인지 질 농도는 Bartlett의 방법(14)으로, 총콜레스테롤 농도는 Sperry와 Webb의 방법(15)으로 정량하였다.
- 간장 총 지질은 Folch 등의 방법 (12) 에 준하여 추출 순화하였다. 간장 중성지질 농도는 Fletcher의 방법 (13) 으로, 인지 질 농도는 Bartlett의 방법(14)으로, 총콜레스테롤 농도는 Sperry와 Webb의 방법(15)으로 정량하였다.
- 이를 농축건조 시 킨 후 5 mL ethanol로 재용해시켜 산성 스테롤(담즙산) 추출액으로 하였다. 분변 중의 담즙산 농도는 총 담즙산 측정용 시판 kit(Wako junyaku, Osaka, Japan)를 이용하여 효소비 색법으로 측정하였다.
- 분변은 실험기간 중 1주 및 2주째의 전일과 해당일에 대사 케이지에서 채집하여 -80℃에서 동결시킨 후 동결건조시켰다. 분변으로 배설되는 콜레스테롤 농도는 Lafont 등(17)의 방법으로 측정하였다. 즉, 동결건조시킨 분변을 분말화하여 100 mg을 취해 10 mL ethan이과 함께 80℃에서 &0분간 중탕하였다.
- 4), 10 mM ethylenediaminetetraacetate(EDTA) 및 250 mM sucrose를 함유한 homogenate 용액으로 균질화시킨 후 초원심분리기 (Hitachi 55p-72, Tokyo, Japan)로 microsome 분획을 분리하였다. 분획한 homogenate와 microsome 생체막의 과산화 지질 함량은 전보의 방법(16)에 준하여 정량하였다. 즉, 단백 질량으로 1 mg을 함유한 분획 용액 1 mL에 각각 thiobarbituric acid(TBA) 시 약 2 mL을 가하여 잘 혼합하고, 수조 상에서 30분간 가열한 후 실온에서 방냉하여 3, 000 rpm, 10분간 원심분리한 상등액을 535 nm에서 훕광도를 측정하였다.
- 혈청 총콜레스테롤 농도는 cholesterol C-test kit (Wako Junyaku, Osaka, Japan)를 이용하여 cholesterol oxidase- DAOS법으로 측정하였고, 혈청 중성지질 농도는 triglyceride E-test kit (Wako Junyaku, Osaka, Japan ) 이용하여 GPO~ DAOS법에 의하여 측정하였고, 혈청 인지질 농도는 phospholipid C-test kit(Wako Junyaku, Osaka, Japan)를 이용한 choline oxidase-DAOS법 에 의한 효소 발생법으로 측정하였다. 혈당량은 glucose oxidase 법 에 따라 조제된 시판 glucose kit(Wako Junyaku, Osaka, Japan)를 이용한 효소법으로 측정하였다.
- 혈청 총콜레스테롤 농도는 cholesterol C-test kit (Wako Junyaku, Osaka, Japan)를 이용하여 cholesterol oxidase- DAOS법으로 측정하였고, 혈청 중성지질 농도는 triglyceride E-test kit (Wako Junyaku, Osaka, Japan ) 이용하여 GPO~ DAOS법에 의하여 측정하였고, 혈청 인지질 농도는 phospholipid C-test kit(Wako Junyaku, Osaka, Japan)를 이용한 choline oxidase-DAOS법 에 의한 효소 발생법으로 측정하였다. 혈당량은 glucose oxidase 법 에 따라 조제된 시판 glucose kit(Wako Junyaku, Osaka, Japan)를 이용한 효소법으로 측정하였다.
성능/효과
- 3) Food efficiency ratio = (body weight gain/food intake) x 100.
- 실험동물에 있어서 치커리 추출물 투여는 식이 섭취량 증가와 체중 증가를 가져왔으나, 식이 효율에는 통계상의 유의한 차이 없이 같은 경향을 나타내었다(Table 2). 간장 조직의 상대적 무게(g/100 g body weight)는 정상군에 비해 콜레스테롤 첨가식에서 유의하게 증가하였고, 심장과 비장 무게도 같은 경향이었다(Table 2). 일반적으로 지방 또는 콜레스테롤의 섭취는 간장 조직에서 지질대사 이상을 초래하여 지질의 침착을 일으켜 간 조직의 무게를 증가시키는 것으로 알려져 있어(19, 20), 본 실험에서 콜레스테롤 섭취에 의한 간 조직의 증가도 이러한 원인에 의한 것으로 사료된다.
- 2% 수준으로 식이 중에 첨가한 실험에서는 유의한 감소를 보여 식이 성분에 의해 영향을 받는 것으로 시사되었다(36). 따라서 치커리 추출물 중에는 생체 내에서 암이나 노화와 깊이 관련된 산화 스트레스를 억제시킴으로써 고지혈증이나 과산화지질을 억제시키는 지질 개선 효과가 있는 것으로 사료되었다.
- 콜레스테롤을 함유하지 않은 정상식이에 치커리 추출물을 첨가시킨 식이를 2주간 투여한 흰쥐에서는 혈청 중성지질 농도를 유의적으로 감소시켰으나, 총콜레스테롤 농도에는 유의한 영향을 미치지 못한 것으로 보고한 바 있다(4, 5). 따라서 치커리 추출물에 의한 콜레스테롤 감소 효과는 고콜레스테롤혈증 상태에서 그 효과가 큰 것으로 사료되었다.
- 이전의 여러 연구 결과에서도 치커리 추출물은 분변 중으로의 총지 질, 총콜레스테롤 및 담즙산량의 분비량을 유의적으로 증가시키는 결과가 보고된바 있다꺗, 26). 따라서, 본 실험의 결과에서 치커리 추출물에 의한 간장 및 혈청 중의 콜레스테롤 농도가 감소된 것은 장에서 콜레스테롤 및 담즙산의 흡수 저해와 관련되는 것으로 사료된다.
- 한편, 생체 내에서 산화스트레스에 의해 DNA가 산화장해를 받게 되면 2'-deoxyguanosine으로부터 산화장해의 지표로 알려진 8-hydroxydeoxyguanosine(8-OHdG)°l 뇨 중으 로 배설된다(34).본 실험에서는 1주 및 2주째의 뇨를 각각 24시간 동안 채취하여 8-HOdG 농도를 측정한 결과, 1주째 에는 각 군 간에 유의한 차이가 없었으나, 2주째에는 정상군 및 콜레스테롤군에 비해서 치커리 첨가군에서 유의한 감 소 효과가 나타났다. 또한 정상 쥐 에 비해 당뇨 유발 실험 쥐에서 뇨중의 8-HOdG 농도가 현저히 증가하여 질환 중에는 산화스트레스에 의해 조직 손상이 일어나고 있음을 시사하였으나, 이러한 당뇨쥐에 0.
- 실험 최종 전일의 체중은 대조군 260 g과 콜레스테롤 군 261 g에 비해 치커리 첨가 군에서 282 g으로 유의하게 증가 하였다(Table 2). 식이 섭취량에서도 치커리 첨가 군에서 대 조 군에 비해 유의적으로 높았다.
- 또한 strep- tozotocin 유발 당뇨 쥐 에서도 5% 치커리 첨 가군에서 식 이 섬유 무첨가의 대조군에 비해 식이 섭취량이 유의한 증가를 보였다고 하였다(6). 실험동물에 있어서 치커리 추출물 투여는 식이 섭취량 증가와 체중 증가를 가져왔으나, 식이 효율에는 통계상의 유의한 차이 없이 같은 경향을 나타내었다(Table 2). 간장 조직의 상대적 무게(g/100 g body weight)는 정상군에 비해 콜레스테롤 첨가식에서 유의하게 증가하였고, 심장과 비장 무게도 같은 경향이었다(Table 2).
- 실험동물로부터 1주 및 2주째의 뇨를 대사 케이 지로부터 채집하여 단백질량을 측정하였다. 치커리 첨가 군에서 1주째에 유의한 증가를 나타내었으나, 2주 째에는 정상식이군 수준까지 회복되어 실험군간의 차이는 없었다(Table 5).
- 혈당량은 정상식이군 152 mg/dL에 비해 콜레스테롤 군 136mg/dL로 유의하게 감소하였으며, 치커리 첨가 군에서는 172 mg/dL로 유의한 증가를 보였다(Table 5). 콜레스테롤 무 첨가의 정상식이에 5% 수준으로 첨가한 볶음치커 리 추출물 첨가 군에서 혈당치는 대조군과 차이가 없었으나, 볶음 처리 하지 않은 치커리 추출물 첨가 군에서는 대조군보다 유의한 증가를 나타내어 본 실험의 결과와는 다른 경향을 보였다(4).
후속연구
- 정상인의 혈당 반응에 미치는 fructan(10 g)의 영향을 검토한 결과, 50 g의 wheat starch를 섭취시켰을 때보다도 섭취 후 90분 이내의 혈당치가 낮게 나타난 것으로 보고하였다(31). 따라서 치커리 추출물 섭취에 의한 혈당치의 변화는 일관성이 없으나, 대체로 증가하는 경향을 나타내는 것으로 판단되어 이에 대한 보다 자세한 정보를 얻기 위해서는 추후 검토가 요구되는 부분이다.
- 이상의 실험 결과에서, 치커리 뿌리수용성 추출물은 혈중 콜레스테롤 농도 저하 효과와 산화적 스트레스를 억제할 수 있는 생리활성 물질로서의 개발 가능성이 기대된다.
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