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문제 정의
- Campylobacter는 일반적인 식중독 세균에 비해 아주 적은 infective dose인 20~500cell 만으로 도 식중독을 유발16)할 수 있으며, 또한 viable but noncultur- able cell(VBNC)로 보고”)되고 있어 이에 대한 대책이 시급하게 요구되고 있다. 따라서 본 연구에서는 초등학교 집단급 식소에 납품되는 계육에서 Campylobacter를 분리, 동정 후 오염정도를 분석하여 이의 위해 가능성에 대한 분석을 하고자 하였다.
제안 방법
- Campylobacter의 분리를 위해 재래적인 방법인 candle method 와 miroaerophilic chamber(Bug box, Ruskin tech. Co., UK)를 병행하여 비교 실험하였다.
- 위와 같은 선택배지로부터 Gram test20-21), catalase test, oxidase test끄를 실시하였다. Gram test는 슬라이드에 한 방울의 3% KOH를 떨어뜨린 후 각각의 세균 집락을 따서 2 mm 직경의 loop로 60초까지 회전시켜 string 현상이 나타나면 Gram negative로 확인하였고, catalase test는 24시간 배양한 후 집락을 따서 slide 이ass에 도말하고, slide glass 위에 피펫으로 3% H2O2 한 방울을 떨어뜨리고 즉시 거품이 생기는지를 관찰해 거품이 생기면 양성이며 거품 발생이 없으면 음성으로 판독하고, oxidase test는 Tryptic Soy Agar (Difco)에서 24시간 배양된 집락 위에 Kovac's 시약을 떨어 뜨린 후 15초 내에 진한 자주빛으로 변하면 양성으로 확인하였다. 결과가 Gram(-), catalase(+), oxidase(+) 인 분리균을 대상으로 H2S 생성시험, nitrate 환원시험, 운동성시험, 25℃ 및 42℃에서의 발육시험 등의 생화학적 검사23)를 실시하여 1차적으로 Campylobacter-like strain균을 분리하였다.
- 5 mM MgCl2 를 포함하는 PCR PreMix (Bioneer, Chongwon, Korea)에 2|_il의 cell lysate를 첨가하여 mixture tube를 만들어 이것을 Gene cycler(BioRad, USA)로 옮겨 실험하였다. PCR cyclee pA, pB는 94℃에서 5분간 Icycle 후 94℃ 30초, 52℃ 30초, 72℃ 1 분을 30cycle 진행하였으며 마지막으로 72℃에서 5분간 Icycle 조건으로 실시하였고, JEJ 1, JEJ 2는 94℃에서 5분간 Icycle 후 57℃ 30초, 72℃ 1분을 30cycle 진행하였으며 마지막으로 72℃에서 5분간 Icycle 조건으로 실시하였다. PCR product 10 μl를 0.
- PCR cyclee pA, pB는 94℃에서 5분간 Icycle 후 94℃ 30초, 52℃ 30초, 72℃ 1 분을 30cycle 진행하였으며 마지막으로 72℃에서 5분간 Icycle 조건으로 실시하였고, JEJ 1, JEJ 2는 94℃에서 5분간 Icycle 후 57℃ 30초, 72℃ 1분을 30cycle 진행하였으며 마지막으로 72℃에서 5분간 Icycle 조건으로 실시하였다. PCR product 10 μl를 0.5 μg/ml ethidium bro- mide를 포함하는 TAE buffer에서 1% agarose gel을 만들어 전기영동을 한 후 gel을 UV ligh에서 결과를 확인하였다.
- PCRe 1U thermostable DNA polymerase, 250 |1M의 dNTe 50 mM Tris-HCl(pH 8.3), 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2 를 포함하는 PCR PreMix (Bioneer, Chongwon, Korea)에 2|_il의 cell lysate를 첨가하여 mixture tube를 만들어 이것을 Gene cycler(BioRad, USA)로 옮겨 실험하였다. PCR cyclee pA, pB는 94℃에서 5분간 Icycle 후 94℃ 30초, 52℃ 30초, 72℃ 1 분을 30cycle 진행하였으며 마지막으로 72℃에서 5분간 Icycle 조건으로 실시하였고, JEJ 1, JEJ 2는 94℃에서 5분간 Icycle 후 57℃ 30초, 72℃ 1분을 30cycle 진행하였으며 마지막으로 72℃에서 5분간 Icycle 조건으로 실시하였다.
- Gram test는 슬라이드에 한 방울의 3% KOH를 떨어뜨린 후 각각의 세균 집락을 따서 2 mm 직경의 loop로 60초까지 회전시켜 string 현상이 나타나면 Gram negative로 확인하였고, catalase test는 24시간 배양한 후 집락을 따서 slide 이ass에 도말하고, slide glass 위에 피펫으로 3% H2O2 한 방울을 떨어뜨리고 즉시 거품이 생기는지를 관찰해 거품이 생기면 양성이며 거품 발생이 없으면 음성으로 판독하고, oxidase test는 Tryptic Soy Agar (Difco)에서 24시간 배양된 집락 위에 Kovac's 시약을 떨어 뜨린 후 15초 내에 진한 자주빛으로 변하면 양성으로 확인하였다. 결과가 Gram(-), catalase(+), oxidase(+) 인 분리균을 대상으로 H2S 생성시험, nitrate 환원시험, 운동성시험, 25℃ 및 42℃에서의 발육시험 등의 생화학적 검사23)를 실시하여 1차적으로 Campylobacter-like strain균을 분리하였다. 이렇게 선택배지로부터 분리된 균을 동정하기 위해서 PCR을 실시하였다.
- 생계육에서부터 증균된 후 Campy-BAP 선택배지에서 생육이 이루어지는 집락으로부터 Campylobacter-like strain 총 205개의 균주를 분리하였다. 그러나 이들 선택배지에서 분리된 균주가 전부 Campylobacter인지를 동정할 필요가 있기 때문에 Campylobactere] 생리화학적인 검사18-20)를 실시하였다. 여기에서 여러가지 Campylobacter에 공통적인 특성을 이용하여 동정을 시작하였다.
- 닭고기 25 g을 무균적으로 채취하고 0.85% 생리 식염수 225 ml을 가하여 stomaching(60sec., 8.0 strokes/sec) th 후 0.1 ml을 취하여 Plate Count Agar(Difco) 배지에 도말하고 35℃에서 24시간 동안 배양한 후 계측하여 총균수로 사용하였다. 특히 통닭의 표피와 표피 내부의 살부위에서의 총균 수 측정을 위하여 무균적으로 각각의 시료 25 g씩을 채취하였다.
- 따라서 미호기적인 배양장치가 구비되어 있는 않은 상태에서도 간단히 candle을 사용하여 Campylobacter의 배양이 가능한 조건을 충족시킬 수 있는 것으로 보이고 Campylobacter 를 쉽게 배양할 수 있다는 것을 알았다. 본 실험에서도candle method와 microaerophilic chamber를 병행하여 사용하였다.
- 그러나 이들 선택배지에서 분리된 균주가 전부 Campylobacter인지를 동정할 필요가 있기 때문에 Campylobactere] 생리화학적인 검사18-20)를 실시하였다. 여기에서 여러가지 Campylobacter에 공통적인 특성을 이용하여 동정을 시작하였다. 따라서 이들 1차 분리 균주로부터 우선 Gram test를 실시하여 107개의 Gram(-) 균주를 선발하였다.
- 위와 같은 선택배지로부터 Gram test20-21), catalase test, oxidase test끄를 실시하였다. Gram test는 슬라이드에 한 방울의 3% KOH를 떨어뜨린 후 각각의 세균 집락을 따서 2 mm 직경의 loop로 60초까지 회전시켜 string 현상이 나타나면 Gram negative로 확인하였고, catalase test는 24시간 배양한 후 집락을 따서 slide 이ass에 도말하고, slide glass 위에 피펫으로 3% H2O2 한 방울을 떨어뜨리고 즉시 거품이 생기는지를 관찰해 거품이 생기면 양성이며 거품 발생이 없으면 음성으로 판독하고, oxidase test는 Tryptic Soy Agar (Difco)에서 24시간 배양된 집락 위에 Kovac's 시약을 떨어 뜨린 후 15초 내에 진한 자주빛으로 변하면 양성으로 확인하였다.
- 사용된 primer의 염기서열은 Tablel과 같으며 주문(Genotech, Taejon, Korea)에 의하여 합성하였다. 이 primer중 target gene이 16S rRNA인 pA, pB pmmeB는 Genus Campylobactere 동정 에 사용하였으며 Campylobacter jejunie: 동정하기 위해서는 이 균 ceuE의 JEJ 1과 JEJ 2 primer를 사용하여 PCR을 수행하였다.
- 결과가 Gram(-), catalase(+), oxidase(+) 인 분리균을 대상으로 H2S 생성시험, nitrate 환원시험, 운동성시험, 25℃ 및 42℃에서의 발육시험 등의 생화학적 검사23)를 실시하여 1차적으로 Campylobacter-like strain균을 분리하였다. 이렇게 선택배지로부터 분리된 균을 동정하기 위해서 PCR을 실시하였다.
- 따라서 이들 1차 분리 균주로부터 우선 Gram test를 실시하여 107개의 Gram(-) 균주를 선발하였다. 이어서 catalase test를 실시하여 catalase(+) 균 주를 분리하고 이렇게 분리된 균주로부터 다시 oxidase (+) 균주를 선발하였다. 이렇게 하여 재분리된 28개의 Gram(-),catalase(+), oxidase(+)인 분리균주를 얻었다.
- 집단급식을 위하여 공급업체에서 토막으로 분리하지 않은 5마리의 통닭으로부터 총 세균의 오염정도를 분석하였다. Table 2와 같이 닭의 표피와 표피내부의 살부위의 세균 분 포는 이미 많은 오염을 확인할 수가 있었다.
- 1 ml을 취하여 Plate Count Agar(Difco) 배지에 도말하고 35℃에서 24시간 동안 배양한 후 계측하여 총균수로 사용하였다. 특히 통닭의 표피와 표피 내부의 살부위에서의 총균 수 측정을 위하여 무균적으로 각각의 시료 25 g씩을 채취하였다.
대상 데이터
- 경기지역의한 초등학교에 납품되어지는 단체 급식용 계육 제품에서 일반 세균과 Campylobacter를 분리하여 실험에 사용하였다. 수집된 재료들은 식단에 따른 발주 사양에 맞추어 납품업체에서 전처리되어 부위별로 분리 포장되어 5℃ 이하의 온도에서 납품되었다.
- 여기에서 여러가지 Campylobacter에 공통적인 특성을 이용하여 동정을 시작하였다. 따라서 이들 1차 분리 균주로부터 우선 Gram test를 실시하여 107개의 Gram(-) 균주를 선발하였다. 이어서 catalase test를 실시하여 catalase(+) 균 주를 분리하고 이렇게 분리된 균주로부터 다시 oxidase (+) 균주를 선발하였다.
- 수집된 재료들은 식단에 따른 발주 사양에 맞추어 납품업체에서 전처리되어 부위별로 분리 포장되어 5℃ 이하의 온도에서 납품되었다. 부위별 5회에 걸쳐 계육 토막 30개, 닭가슴살 20개, 닭다리살 10개, 닭다리 10개, 통닭 5마리 등 75개의 시료를 사용하였다. 항생제 내성 및 sanitation reagent의 특이성 확인하기 위해 표준 균주로 Campylobacter jejuni ATCC 33291, Campylobacter jejuni A74/C를 사용하였다.
- 생계육에서부터 증균된 후 Campy-BAP 선택배지에서 생육이 이루어지는 집락으로부터 Campylobacter-like strain 총 205개의 균주를 분리하였다. 그러나 이들 선택배지에서 분리된 균주가 전부 Campylobacter인지를 동정할 필요가 있기 때문에 Campylobactere] 생리화학적인 검사18-20)를 실시하였다.
- 부위별 5회에 걸쳐 계육 토막 30개, 닭가슴살 20개, 닭다리살 10개, 닭다리 10개, 통닭 5마리 등 75개의 시료를 사용하였다. 항생제 내성 및 sanitation reagent의 특이성 확인하기 위해 표준 균주로 Campylobacter jejuni ATCC 33291, Campylobacter jejuni A74/C를 사용하였다.
이론/모형
- Campylobacter를 분리하기 위하여 증균 배지로는 Doyle과 Roman 18)의 실험 방법에 따라 Brucella broth(Difco) 1 L를 pH 7.0으로 조정하여 고압 증기멸균(121℃, 15분)한 후 50 ℃로 식혀서 7%의 탈섬유된 sheep blood(Komed Ltd. Co., Korea)외" sodium succinate 3 g, cystein - HCI 0.1 g, vancomycin 15 mg, trimethoprim lactate 5 mg, polymyxin B 20, 000 IU, cycloheximide(Sigma) 50 mg을 첨가한 후 225 ml씩 시험관에 분주하였다. 취한 시료 25 g을 시험관에 넣고 질소를 충진하거나 Bug box(Ruskin Technology, UK)를 이용하여 5% O2> 10% CO2 및 85% N2의 혼합가스를 사용하여 미 호기적인 상태에서 42℃에서 24시간 증균배양하였다'9).
- Campaobacter의 분리를 위한 선택배지는 Blaser6) 등의 방법에 준하여 Campy-BAP agar를 사용하였다. 본 배지는 Brucella agar(Difco) 1 L를 pH 7.
- 여러 생리화학적인 특성을 기준으로 분리된 균주를 PCR 분석기법으로 Campylobacter로 동정하였다. 우선 target gene을 16S iRNA로 하는 primer pA, pB를 사용한 결과는 Fig.
성능/효과
- 그리고 CampylobacterS. 동정된 16개의 분리동정 균주의 생육온도을 분석하면 Table 4와 같이 9균주가 42℃와 25℃ 에서 생육이 가능함을 알았고 단지 7균주만이 42℃에서 생육이 가능하였으나 25℃에서는 생육이 되지 않는 thermophilic Campylobacter임인 것을 알았다. 또한 이들 분리된 Campylobacter는 20℃인 상온에서도 생육할 수 있기 때문에 저온 유통 과정 중에서도 균의 증식이 가능하게 되어 Campylobactere 의한 위해 가능성은 있을 것으로 보인다.
- 에서나 같은 초기 종균을 사용하였을 때 Campylobactere] 배양된 균수는 Table 3에서와 같이 차이를 나타내지 않았다. 따라서 미호기적인 배양장치가 구비되어 있는 않은 상태에서도 간단히 candle을 사용하여 Campylobacter의 배양이 가능한 조건을 충족시킬 수 있는 것으로 보이고 Campylobacter 를 쉽게 배양할 수 있다는 것을 알았다. 본 실험에서도candle method와 microaerophilic chamber를 병행하여 사용하였다.
- 따라서 표피부위에 오염된 균의 분포가 평균 iWcFU/g정 도는 되기 때문에 집단급식을 위한 조리시 충분한 주의가 이루어져야 교차오염을 줄일 수가 있음을 알았고 또한 이를 조 리할 때에는 충분한 열처리가 이루어져야 하는 것으로 보인다.
- coli 등과 더불어 중요한 병원성 세균으로 주목 받고있다. 이러한Campylobactei는 McFadyean과 Stockman이 유산된 면양으로부터 분리해 미호기성 Vibrio로 명명7)하였으나 그 이후 Kinge 이 균의 세균학적 특성을 검토한 결과 Vibrio와는 다른 균임을 확인하고 이 균을 -related Vibrio”라 분류하였다. Veron, Chatelain 및 Smiberte는 DNA의 GC함량이 Vibrio와는 달리 33~35 mole%인 것이 규명되어 새로이 curved rod라는 뜻의 Campylobacter라고 분류하였다.
- 1과 같은데 이 primer를 사용하여 Campylobactere: 다른 균주로부터 동정할 수 있었다. 전체 분리균들 28개 중 Fig. 1에서와 같은 426bp의 DNA단편을 관찰할 수 있어 Campylobactere 확인이 된 균은 16개로 나타나 약 60%의 정확도를 보였다. 또한 이들 Campylobacter sp로 동정된 균주를 JEJ1과 JEJ2 primer를 사용하여 C.
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