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문제 정의
- 밝혀졌다. 그래서 본 연구도 도계장에서 최종단계의 가공된 도계를 수집하여 Camp의 obacter균의 오염에 대한 연구를 실시하였다. 이 연구에서 최종단계의 도체로 부터 C jejuni가 발견되었는데 이것은 도계장에서 기계적인 처리과정중에 장내용물 또는 분변에 도계가 오염될 수 있음을 시사하고 있다.
- 균에 의한 집단식중독이 발생하고 있는 추세 이 고 미 국질 병센타의 자료에 의 하면 미국에서 유통되고 있는 닭고기의 70-90% 가 tampy/obacfer균에 의해 오염되었다는 보고가 있으며 국내에서도 2003년에 215명의 집단 식중독 환자가 발생되었다. 따라서 본 실험의 목적은 도계장에 출하된 닭의 분변과 도축된 닭의 시료에서 PCR법의 적용에 의한 C jejuni 검출을 실시하여 향후 집단 식중독의 역학조사에 이용하고자 한다.
제안 방법
- 2005년 1월부터 12월까지 광주지역의 도계장에 출하된 닭분변 80건과 도계과정을 마쳐 최종단계에 도달하여 포장되기 전의 닭고기 20건을 채취하여 세균배양과 PCR 방법을 통하여 Campylobacter 균의 검줄률을 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- Campylobacter로 의심되는 세균집락을 동 정하기 위해 각각 primer HIP400F와 HIP1134R 그리고 primer CC18F와 CC519R 을 사용하여 C jejunie C coli로 구분하였다. PCR 반응 조건은 template DNA 2 #, 각 10 pmol/,# primer 1 fd, ExPrime Taq Premix (GENET BIO, Korea) 10 #를 첨 가 하고 멸균증류수로 총 20#로 조정 하였다.
- Campylobacter를 분리하기 위해 항생제 혼합액 (Hunt Supplent A, Oxoid) 이첨 가된 Hunt broth (Oxoid) 100 mfl 닭 세척 액 25 를 첨 가하고, stomacher로 균질화 하였다. 35 ℃에서 4-5시간 동안 미호기적으로 1차 증균하였다.
- Modified Camy blood free 한천배지 (Oxoid)상에서 원형 또는 불규칙한 형태로서 반투명한 흰색 또는 투명한 집락을 취하여, 위상차 현미경으로 검경하거나 또는 대비 염색하여 지그재그 모양을 관찰하였다. 이 때 대비염 색은 10I식 염수에 2방울의 crystal violet을 혼합한 용액을 이용하였다.
- 사용하였다. PCR 반응 조건은 제조사의 지시에 따라 실시하였다.
- 현미경상으로 확인된 균에 대하여 Gram 염색, catalase test, oxidase test를 실시하였다. 결과가 Gram (-), catalase (+), oxidase (+)인 분리균을 대상으로 H2S 생성시험, nitrate 환원시험, 운동성시험, 25℃ 및 42℃ 에서의 발육시험 등의 생화학적 검사를 실시하여 1차적으로 Campylobacter spp를 분리하였다. 이렇게 선택배지로부터 분리된 균들은 PCR을 실시하여 동정하였다.
- 결과가 Gram (-), catalase (+), oxidase (+)인 분리균을 대상으로 H2S 생성시험, nitrate 환원시험, 운동성시험, 25℃ 및 42℃ 에서의 발육시험 등의 생화학적 검사를 실시하여 1차적으로 Campylobacter spp를 분리하였다. 이렇게 선택배지로부터 분리된 균들은 PCR을 실시하여 동정하였다.
- 이어서 catalase test를 실시하여 catalase (+) 균주를 분리하고 이렇게 분리된 균주로부터 다시 oxidase (+) 균주를 선발하였다. 이렇게하여 재 분리 된 9개의 Gram (-), catalase (+), oxidase (+), hippurate 분해 양성 , 황화수소 비생성, nalidixic acid 감수성, 25℃에서 비생육, 42 ℃ 에서 생육하는 것 생화학시험결과를 얻게 되었다.
- 증폭된 PCR 산물은 20-80 mM Tris-acetate-EDTA(TAE) 완축용 액 과 DNA 염색을 위한 ethidium bromide (0.5 /g /m)가 함유된 1.5% agarose gel에서 전기영동 하여 최종산물을 UV transiliumnator와 AlphaEase5.5 software (Alpha Innotech Co, CA, USA)를 이용하여 확인 분석하였다.
- 증폭은 PCR thermocycler (PTC-200, MJ Research, USA)를 사용하여 PCRe 95 ℃ 에서 5분간 수행한 후 94℃/20초, 60℃/30초 그리 고 72 ℃/30초간 3단계로 40 cycles 수행하고, post elongation을 72 ℃ 에서 5분간 DNA 합성을 실시하였다.
- 한편 닭 분변을 채취한 면봉에서 추출된 DNA을 이용하여 C jejuni의 존재 여부를 확인하기 위해서 RapiGEN사 (Korea)의 PCR kit을 사용하였다. PCR 반응 조건은 제조사의 지시에 따라 실시하였다.
- 이 때 대비염 색은 10I식 염수에 2방울의 crystal violet을 혼합한 용액을 이용하였다. 현미경상으로 확인된 균에 대하여 Gram 염색, catalase test, oxidase test를 실시하였다. 결과가 Gram (-), catalase (+), oxidase (+)인 분리균을 대상으로 H2S 생성시험, nitrate 환원시험, 운동성시험, 25℃ 및 42℃ 에서의 발육시험 등의 생화학적 검사를 실시하여 1차적으로 Campylobacter spp를 분리하였다.
대상 데이터
- 닭 분변에 Campylobacter의 존재 여부를 확인하기 위해 광주광역시에 소재한 도계장에 출하된 육계로부터 닭 분변 80건을 멸균된 시료컵에 채취하여 ice box에 넣어 신속히 이동하여 본 실험에 사용하였다. 채취된 닭 분변은 멸균된 면봉을 이용하여 Tryptic soy broth 3 #에 분변 1g을 첨가하여 5-18 시간 37℃ 에서 250 rpm으로 진탕배양하여 PCR 실험에 사용하였다.
- 도계장에 출하되어 도축되는 일 련의 도계과정을 거쳐 포장되기 직전의 도체 20건을 채취하여 멸균된 비닐봉지에 500ml의 1% peptone water를 멸균 비닐봉지에 담아 도체를 세척하고 그 세척액을 증균시료로 사용하였다.
- 또한 분리된 9균주에 대한 생화학적 특성은 1차균주에서 Gram 염색을 실시하여 15 개의 Gram (-) 균주를 선택했다. 이어서 catalase test를 실시하여 catalase (+) 균주를 분리하고 이렇게 분리된 균주로부터 다시 oxidase (+) 균주를 선발하였다.
이론/모형
- Campylobacter의 균분리를 위해 재래적인 방법 인 candle jar method와 microaerophilic chamber (Bug box, Ruskin Tech, Co UK) 를 병행하여 식품공전법에 준하여 비교 실험하였다. Campylobacter를 분리하기 위해 항생제 혼합액 (Hunt Supplent A, Oxoid) 이첨 가된 Hunt broth (Oxoid) 100 mfl 닭 세척 액 25 를 첨 가하고, stomacher로 균질화 하였다.
- RapiGEN사 (Korea)의 사용방법에 따라서 닭 분변과 배양된 세균으로부터 DNA을 추출하였다. 채취된 닭분변의 상층액과 세균배양액 1 microcentrifuge tube에 옳긴 후 13, 000 rpm에서 3분간 원심분리하였다.
성능/효과
- 1. 닭분변 80건에 대하여 PCR kit로 검사한 결과 Campylobacter 균이 분리되지 않았다.
- 2. 최종 도계단계의 닭고기 20건에 대한 일반적인 미호기성 세균배양방법과 DNA 검출방법을 통해 9건의 Campylobacter 균이 분리되었다.
- 3. 분리된 9건의 Campylobacter 균은 PCR 방법을 통해서 hip O gene 이 증폭되어 모두 C jejuni 로 동정 되었다.
- 4. 분리된 9건의 Campylobacter 균에 대한 생화학적 검사 결과 Gram (-), catalase (+), oxidase (+), hippurate 분해 양성 , 황화수소 비생성, nalidixic acid 감수성, 25℃에서 비생육, 42℃에서 발육으로 C jejuni 임이 확인되었다.
- 동정하였다본 연구에서, 도축 최종단계의 도체 시료 20건을 증균배양을 하여 균분리 한 결과 Campylobacter균 9건 이 C jejuni 로 확인되어 검출률이 45%로 다른 연구자들의 결과와 큰 차이를 보이지 않았다. 결론적으로 PCR 방법을 통해서 오염된 계육 시료로 부터 Campylobacter균의 오염을 신속하게 확인할 수 있었으며, 도계장에서 생산된 생계육 뿐만 아니라 소매점으로부터 구입된 생계육으로부터 식중독균이 검출됨에 따라 계육의 생고기 섭취을 지양하고 도계의 위생적인 취급과 닭고기의 보다 철저한 위생관리가 요구된다고 할 수 있다.
- 그러나 도계장의 출하 최종과정에서 수집한 20건의 도계에서 미호기성 배양을 통해 9건의 Campylobacter균을 분리할 수 있었다(Table 2).
- 도계장에 출하된 닭분변 80건을 RapiGEN 사의 PCR kit를 이용하여 Campylobacter 을 검출한 결과 모두 음성이었다.
- 3%)을 분리 . 동정하였다본 연구에서, 도축 최종단계의 도체 시료 20건을 증균배양을 하여 균분리 한 결과 Campylobacter균 9건 이 C jejuni 로 확인되어 검출률이 45%로 다른 연구자들의 결과와 큰 차이를 보이지 않았다. 결론적으로 PCR 방법을 통해서 오염된 계육 시료로 부터 Campylobacter균의 오염을 신속하게 확인할 수 있었으며, 도계장에서 생산된 생계육 뿐만 아니라 소매점으로부터 구입된 생계육으로부터 식중독균이 검출됨에 따라 계육의 생고기 섭취을 지양하고 도계의 위생적인 취급과 닭고기의 보다 철저한 위생관리가 요구된다고 할 수 있다.
- 분리된 9건의 Gampylobacte「균으로부터 DNA을 추출하여 C.jejuni만이 보유한 hipO 유전자 primer와 CC18F와 CC519R primer로 PCR을 실시한 결과 모두 735bp만이 증폭되어 C jejuni로 확인되 었다 (Fig 1).
- 그래서 본 연구도 도계장에서 최종단계의 가공된 도계를 수집하여 Camp의 obacter균의 오염에 대한 연구를 실시하였다. 이 연구에서 최종단계의 도체로 부터 C jejuni가 발견되었는데 이것은 도계장에서 기계적인 처리과정중에 장내용물 또는 분변에 도계가 오염될 수 있음을 시사하고 있다.
후속연구
- 그러므로 본 연구에서는 도계과정의 마지 막 단계 에서 C jejuni 부재 계 군의 도체 오염의 주요한 원인은 아직까지 분명하지 않다. 본 연구 결과에서도 보듯 도계과정의 마지막 단계에서의 Campylobacter 식중독을 발생시킬 수 있는 위험성은 존재하지만 계군별의 교차오염에 대한 조사는 본 연구에서 이루어지지 않아 앞으로 좀 더 계군별의 교차오염 조사연구가 필요할 것으로 판단된다.
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