[논문]녹차카테킨과 에피갈로카테킨갈레이트의 산화적 스트레스에 대한 억제효과

윤여표; 박종범; 허문영

문제 정의

이에, 녹차 카테킨류(GTC)와 EGCG를 대상으로 하여 in。汐。에서 항산화 작용과 free radical 소거능을 비교 연구하고, 이들의 활성산소종들에 대한 효과를 규명하기 위해서 hydroxyl radical(OH) 생성물질로서 玮。2와 superoxide(O广) 생성물질로서 KO2 유도세 포독성에 대한 억제 효과에 미치는 영향을 검정하여 녹차카테킨류의 산화적 스트레스의 억제효과를 규명하였기에 그 연구결과를 보고하는 바이다.
이러한 항혈전 및 심혈관 효과와 함께 녹차 중의 카테킨성분은 폴리페놀화합물로서 항산화 작용과 free radical 소거작용이 큰 물질이다. 따라서 본 연구에서는 이미 밝혀진 항혈전 효과와 함께 녹차 카테킨류의 효능 확보 차원에서 본 연구자 등이 제조한 녹차 카테킨과 주요 성분인 (-)-epigallocatechin gallate (EGCGX 대상으로 하여 in 〃汐o에서의 항산화 작용과 free radical 소거작용을 비교 연구하는 한편, 활성산소 종 (reactive oxygen species, ROS)들에 의한 세포독성에 미치는 영향을 연구하여 산화적 스트레스에 의한 chemopreventive effect를 입증하고자 하였다.
4 妃m/로서 EGCG와 GTC가 Vit-E 보다 훨씬 높았으며 EGCG가 GTC보다 활성이 높았다. 본 실험은 DPPH free radical의 소거능에 관한 실험으로서 DPPH radicale hydroxyl radical 과 비슷한 거동을 하는 버k EGCG 및 EGCG를 다량 함유하고 있는 GTC는 강한 free radical 소거능이 있는 것으로 판단 되었다.
본 연구는 삼아약품(주)의 지원으로 수행되었음을 밝히며 이에 감사드리는 바이다.
본 연구에서는 녹차 카테킨(GTC)과 그 주성분인 EGCG의 항산화 작용과 free radical 소거작용 및 이에 의한 산화적 세포독성 억제효과 등을 검토하였다. EGCG와 GTG의 항산화 효과는 Vit-E보다 강한 활성을 나타내었다.

제안 방법

한편, primary cell culture를 위해서는 C57BL mice splenocyte> 분리하여 실험하였다. C57BL mice(male, 15~25g)로 부터 무균적으로 비장을 적출하여 일회용 50 ml 무균 실린지의 plunger를 이용하여 세포를 분리시킨 후 cell count하여 20X 揷 cell/血로 만들었다. 이 세포현탁액 0.
녹차엽(CameUia sinensis, (주)태평양) 100 g을 취하여 70% Ethanol 1000血로 90~95℃에서 3시간 1차 추출하고 70% Ethanol 500 mE로 같은 조건에서 S시간 2차 추출 후 녹차의 고형 성분을 압착하여 제거하고, 추출액을 합하여 vacuum rotary evaporator에서 45℃로 약 100 mZ가 될 때까지 농축했다. 농축액을 &0로 2~3배 희석시킨 후 23, 700Xg에서 20분간 원심분리하여 고형 성분을 완전히 제거한 후 모아진 상징액에 대하여 1.
이때 DPPH 의 거동은 hydroxyl radical과 유사하여 free radical 소거실험에 활용된다. 본 실험에서는 60皿의 DPPH 2 m2에 sample의 소정농도용액 2mZ를 가하여 5분간 섞고 30분간 방치한 후 520 nm에서 측정하였다.”)
지질과산화 억제효과를 측정하기 위하여 Fenton's reagent를 사용하여 관찰하였다. 증류수에 2% sodium dodecyl sulfate, 0.79 rnM potassium chloride, 0.25 mM Trizma(pH 7.4), 1 pM FeCl2, 0.025 mM H2O2 가 되도록 첨가하여 반응액을 만들고, 이용액 4.89 m2에 10 |1Z ethyl linoleate를 첨가한 후 미리 만들어 보관한 검체의 stock solution을 소정의 농도로 0.1 m/씩 분주하였다. 이 모든 양이 각 sample당 5 m/가 되도록 하였다.
한편, GTC와 EGCG의 자체 세포독성검정을 위해서 상기의 방법에 따라 시험하였으며, 다만 H2O2 또는 KOj처리를 생략하고 시험하여 GTC와 EGCG의 세포독성을 평가하였다.
세포배양은 10% FBS(GIBCO), 1% glutamine(GIBCO), 1% penicillin-streptomycin(GIBCO) 함유 MEM, DMEM(GIBCO) 배지를 사용하였다. 한편, primary cell culture를 위해서는 C57BL mice splenocyte> 분리하여 실험하였다. C57BL mice(male, 15~25g)로 부터 무균적으로 비장을 적출하여 일회용 50 ml 무균 실린지의 plunger를 이용하여 세포를 분리시킨 후 cell count하여 20X 揷 cell/血로 만들었다.

대상 데이터

5 m/씩을 배지에 가하여 실험하였다. Complete medium 은 15% heat inactivated fetalbovine serum(Gibco No. 200-6140), 1% sodium heparin(l, 000 unit, Invenex No. 33-1), 1% penicillin-streptomydn(Gibco No. 600-5145), 2% concanavalin A(Con A, Sigma No. C-5275), 0.01% P-mercapto- ethanol(0.05M, Sigma No. M-6250) 이 되도록 RPMI 1640 cxilture medium으로 조제하여 사용하였다. 배양은 37℃, 5% CO2 배양기에서 이루어졌다.
사료는 삼양유지의 마우스용 pellet사료를 주었으며, 물은 자유롭게 먹게 하고, 12h/12h(iyD) cycle의 조건에서 실험하였다. 녹차카테킨(GTC)은 직접 조제하였고 EGCG> 비롯한 대부분의 시약은 Sigma사로부터 공급받아 사용하였다.
본 실험에 사용된 C57BL mice는 (주)한국실험동물에서 공급받아 강원대 약대 동물사육실 내에 있는 양압 의무균동물챔버에서 23±1℃ 및 상대 습도 55±7%의 조건으로 7~10일 적응시킨 후 사용했다. 사료는 삼양유지의 마우스용 pellet사료를 주었으며, 물은 자유롭게 먹게 하고, 12h/12h(iyD) cycle의 조건에서 실험하였다.
본 연구의 in vitro 실험에 사용된 cell linee 식품의약품안전청 국립독성연구소로부터 분양빋<斗 강원대 약대 액체질소 탱크에 있는 Chinese Hamster Lung (CHL) cell을 사용하여 수시로 계대하여 실험 목적에 맞게 배양하였다. 세포배양은 10% FBS(GIBCO), 1% glutamine(GIBCO), 1% penicillin-streptomycin(GIBCO) 함유 MEM, DMEM(GIBCO) 배지를 사용하였다.
본 실험에 사용된 C57BL mice는 (주)한국실험동물에서 공급받아 강원대 약대 동물사육실 내에 있는 양압 의무균동물챔버에서 23±1℃ 및 상대 습도 55±7%의 조건으로 7~10일 적응시킨 후 사용했다. 사료는 삼양유지의 마우스용 pellet사료를 주었으며, 물은 자유롭게 먹게 하고, 12h/12h(iyD) cycle의 조건에서 실험하였다. 녹차카테킨(GTC)은 직접 조제하였고 EGCG> 비롯한 대부분의 시약은 Sigma사로부터 공급받아 사용하였다.
본 연구의 in vitro 실험에 사용된 cell linee 식품의약품안전청 국립독성연구소로부터 분양빋<斗 강원대 약대 액체질소 탱크에 있는 Chinese Hamster Lung (CHL) cell을 사용하여 수시로 계대하여 실험 목적에 맞게 배양하였다. 세포배양은 10% FBS(GIBCO), 1% glutamine(GIBCO), 1% penicillin-streptomycin(GIBCO) 함유 MEM, DMEM(GIBCO) 배지를 사용하였다. 한편, primary cell culture를 위해서는 C57BL mice splenocyte> 분리하여 실험하였다.

데이터처리

실험을 통하여 얻어진 data들은 Student's t-test를 사용하여 유의성검정을 행하였다.

이론/모형

CHL cell과 마우스 splenocyte에 있어서의 H2O2 및 KOz의 세포독성에 대한 검체들의 효과를 MTT법 '© 에 따라 microplate reader로 측정하였다. 이때 CHL cell은 well 당 25,000개로 하고 배지 80 B 중에서 24시간 배양한 후 H2O2 또는 KO2 10 B 및 검체 10 p/를 가흐}고 CO2 incubator에서 20시간 더 배양한 후 MTT시약 15 B를 가하고 4시간 배양 후 DMSO 200 W를 가하고 녹인 후 570 nm에서 흡광도를 측정흐!였다.
만들어진 samplee vortex n前xer로 즉시 혼합하고 lipid peroxidation system 에 빛을 차단시키기 위해 aluminum foil로 감싸서 16시간 동안 55℃에서 incubation시겼다. 그 후 각각의 sample에 50山 4% BHT ethanol solution을 분주하여 산화를 정지시킨 다음 항산화 정도를 535nm에서 TBA법으로 측정하였다「濕4)
지질과산화 억제효과를 측정하기 위하여 Fenton's reagent를 사용하여 관찰하였다. 증류수에 2% sodium dodecyl sulfate, 0.

성능/효과

산화적 DNA손상을 통하여 발암의 전 단계에서 일어나는 돌연변이나 염색체 손상(chromosome aberra- tion)등의 유전 독성에 대한 억제물질들은 암의 initiation, promotion 및 progression 단계에서 항화 반응을 통한 세포 내 대사의 modulation, DNA 반응성 물질들의 blocking, DNA replication이나 DNA repair modulation 작용과 같은 기전으로 돌연변이나 염색체 손상 및 암을 예방할 수 있는 것으로 기대되고 있다.27) 이와 같은 결과들을 종합해 볼 때, 녹차카테킨 과 주성분인 EGCG는 항산화 활성과 free radical 소거작용을 나타내었으며, H2O2 또는 KO2 유도세포독성 에 대해서도 억제적으로 작용하여 cytoprotective effect# 나타내었다. 따라서 녹차카테킨류는 산소 free radical들에 의한 산화적 손상에 억제적으로 작용하는 기전을 활용하여 항산화성 스트레스를 통한 노화와 암의 예방제로서의 응용 가능성이 높은 물질로 사료된다.
본 연구에서는 녹차 카테킨(GTC)과 그 주성분인 EGCG의 항산화 작용과 free radical 소거작용 및 이에 의한 산화적 세포독성 억제효과 등을 검토하였다. EGCG와 GTG의 항산화 효과는 Vit-E보다 강한 활성을 나타내었다. Free radical 소거작용에 있어서도 EGCG와 GTC는 Vit-E보다 높게 나타났다.
Table Ⅱ에 나타낸 것처럼 GTC와 EGCG 및 Vit-E 모두 투여 농도에서 유의성이 있는 free radical소거작 용을 나타내었으며, GTC와 EGCG는 Vit-E보다 강한 free radical소거작용을 나타내었다. SC50< 비교해보면 EGCG가 0.9 昭‘nd, GTC가 4.0 μg/m/, Vit-E는 185.4 妃m/로서 EGCG와 GTC가 Vit-E 보다 훨씬 높았으며 EGCG가 GTC보다 활성이 높았다. 본 실험은 DPPH free radical의 소거능에 관한 실험으로서 DPPH radicale hydroxyl radical 과 비슷한 거동을 하는 버k EGCG 및 EGCG를 다량 함유하고 있는 GTC는 강한 free radical 소거능이 있는 것으로 판단 되었다.
Table Ⅱ에 나타낸 것처럼 GTC와 EGCG 및 Vit-E 모두 투여 농도에서 유의성이 있는 free radical소거작 용을 나타내었으며, GTC와 EGCG는 Vit-E보다 강한 free radical소거작용을 나타내었다. SC50< 비교해보면 EGCG가 0.
4 陷m/로서 EGCG와 GTC가 Vit-E 보다 훨씬 높았으며 EGCG가 GTC보다 활성이 높았다. 본 실험은 ethyl linoleate를 사용하여 Fenton reaction에 의해 생성된 hydroxyl radical의 지질과 산화작용에 대한 억제효과를 관찰하는 것으로서 나타난 결과로 보아, GTC와 EGCG는 강한 지질과산화억제 작용이 있는 것으로 판단되었다.

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