[논문]유향 물 추출물의 HL-60 혈액암세포에서 세포사멸 유도효과

박래길; 오광록; 이광규; 문연자; 김정훈

문제 정의

이에 저자들은 활혈화어의 효능을 가지는 유향물추출물이 인체의 백혈병에서 유래된 HL-60 혈액암 세포에 어떠한 영향을 미치는지를 밝히기 위하여, apoptosis 의 기전 중 특히 caspase cysteine protease의 활성도 및 apoptosis와 관련 단백질의 발현변화 등을 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
유향은 활혈화어와 지통작용을 가지고 있고, 또한 에서는 “소옹저제독, 이호심, 활 혈 정통, 신근, 치부인난산, 절상”이라 하였기 때문에 실제 암 치료에 많이 응용될 수 있는 약재라 사료되므로, 成17) 본연구에서는 유향의 항암효과를 규명하고자 유향물추출물을 인체의 백혈병에서 유래된 HL-60 세포주에 직접 투여함으로써 암세포주의 다양한 신호전달 과정에 관여하는 apoptosis가 일어나는지에 대하여 관찰하였다.
유향물추출물이 인체의 백혈병에서 유래된 HL-60 혈액암세포에 어떠한 영향을 미치는지를 규명하기 위하여, caspase cysteine protease의 활성도 및 apop tosis 관련 단백질 발현의 변화 등을 관찰한 결과 아래와 같은 결론을 얻었다.

가설 설정

4 - Effects of Boswellia carterii water extract on the expression of Bcl-2 and Bax in HL-60 cells. A) The treatment oi Boswellia carterii water extract decreased the expression of Bcl-2 in HL-60 cells. B) The treatment of Boswellia carterii water extract increased the expression of Bax in HL-60 cells.
A) The treatment oi Boswellia carterii water extract decreased the expression of Bcl-2 in HL-60 cells. B) The treatment of Boswellia carterii water extract increased the expression of Bax in HL-60 cells. The cells were treated with Boswellia carterii water extract at 300 ㎍/㎖ for various periods, and the cell lysates were analyzed with anti-Bcl-2 and Bax antibodies.

제안 방법

배양하였다. 약 时]간주기로 RPMI 1640 배양액을 교체하여 주었으며, log phase에 있는 세포에 phosphate-buffered saline(pH 7.0)으로 용해시킨유향물추출물을 처리하여 세포의 apoptosis 현상과 이에 연관된 생화학적 실험을 수행하였다.
이용하였다.'紛 세포배양 판(24-weIl plate)에 welT당 lx 105 cell/mZ씩 분주하여, 실험에 필요한 각 조건의 한약재 등을 처리하고 일정 시간 배양한 후, 배양액에 MTT를 최종농도 100 이 되도록 넣어주었다. 생존율의 판정은 MTT 처리 3시간 후에 살아있는 세포에 의해 생성된 보라색 불용성의 formazan을 100 W의 10% SDS가 포함된 0.
'紛 세포배양 판(24-weIl plate)에 welT당 lx 105 cell/mZ씩 분주하여, 실험에 필요한 각 조건의 한약재 등을 처리하고 일정 시간 배양한 후, 배양액에 MTT를 최종농도 100 이 되도록 넣어주었다. 생존율의 판정은 MTT 처리 3시간 후에 살아있는 세포에 의해 생성된 보라색 불용성의 formazan을 100 W의 10% SDS가 포함된 0.01N HC1 용액으로 24시간 동안 37°C, 5% C02 세포 배양기에서 방치하여 녹인 다음, ELISA reader로 540 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
5, 1 mM PMSE 1 卩矽m/ apro- tinin, 1 jig/m/ leupeptin, 2 mM DTT)에 희석시킨 후, 형광표지된 기질과 37°C 에서 30분간 반응시킨 후 fluorometer(Molecular Devices Co, Sunnyvale, USA) 로 측정하였다. Caspase-1 과 caspase-3의 활성측정은 각각 기질로 Anorogenic substrate 인 7-amino4cou- marin(AMC)-YVAD(Calbiochem, San Diego, CA, USA) 50 J1M 및 7-amino-4-coumarin(AMC)-DEVD(Calbio - chem Co, San Diego, CA) 50 pM을 사용하였으며, 이들의 proteolytic cleavage를 측정하여 caspase 활성을 결정하였다. 이때의 파장은 excitation wavelength (380 nm) 와 emission wavelength(460 nm) 를 사용하였다.
이때의 파장은 excitation wavelength (380 nm) 와 emission wavelength(460 nm) 를 사용하였다. Caspase-6 효소 활성은 기질로서 Ac-VEID- AMC(Calbiochem, San Diego, CA, USA) 50 jiM 人]" 용하였으며 이들의 proteolytic cleavage를 380 nm (excitation wavelength) 오丰 460 nm(emission waveleng- th)의 파장 하에서 즉정하였다. Caspase-8과 caspase- 9 효소활성은 기질로서 Z-IETD-AFC, Ac-LEHD- AFC(Calbiochem, San Diego, CA, USA) 를 각각 50jiM 사용하였으며 이들의 proteolytic cleavage를 400 nm(excitation wavelength) 와 505 nm(emission wa velength)^ 파장에서 측정하였다.
Caspase-6 효소 활성은 기질로서 Ac-VEID- AMC(Calbiochem, San Diego, CA, USA) 50 jiM 人]" 용하였으며 이들의 proteolytic cleavage를 380 nm (excitation wavelength) 오丰 460 nm(emission waveleng- th)의 파장 하에서 즉정하였다. Caspase-8과 caspase- 9 효소활성은 기질로서 Z-IETD-AFC, Ac-LEHD- AFC(Calbiochem, San Diego, CA, USA) 를 각각 50jiM 사용하였으며 이들의 proteolytic cleavage를 400 nm(excitation wavelength) 와 505 nm(emission wa velength)^ 파장에서 측정하였다.
DNA 추출 및 전기영동 -DNA 분절현상을 알아보기 위해 genomic DNA 추출은 Wizard genomic DNA purification kit(Promega Co, Medison, WI) 를 이용하여 추출하였다. 먼저 유향물추출물이 처리되어진 세포를 수확하고 nuclear lysis solution을 첨가하여 세포를 파괴하였다.
RNase를 37°C에서 5분 처리하여 RNA를 제거한 후 단백질 침전용 완충용액으로 단백질을 제거하고 isopropanol 침전에 의하여 응죽된 DNA를 70% 에탄올에 세척한 후 진공건조기로 건조하였다. 여기에 TE 완충용액(10 mM Tris-HCl, pH 8.0, ImM EDTA, pH 8.0)를 가하여 DNA pellet을 용해한 후 260 nm와 280 nm의 적외선 분광광도계 (Beckman, Du-7 Model, Palo Alto, CA, USA) 하에서 OD 값을 측정하여 DNA를 정량하였다. DNA 5 pig을 1.
0)를 가하여 DNA pellet을 용해한 후 260 nm와 280 nm의 적외선 분광광도계 (Beckman, Du-7 Model, Palo Alto, CA, USA) 하에서 OD 값을 측정하여 DNA를 정량하였다. DNA 5 pig을 1.2% agarose gel에서 전기영동(50V 2시간)을실시한 후 ethidium bromide로 염색하여 UV등 아래에서 DNA 분절을 관찰하였다.
Bcl-2나 Bax 등에 대한 항체를 Tris-buffered saline 에 1:1000으로 희석하여 nitrocellulose membrane과 상온에서 2시간 반응시켰다. 이차항체인 anti-rabbit IgG conjugated horseradish peroxydase(Amersham, England)와 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후 enhanced chemiluminescence kit(ECL kit: Amer- sham, England)를 사용하여 필름에 노출시켰다.
DNA fragmentationoil 미치는 영향 - 유향물추출물을 처리한 HL-60 세포의 죽음의 기전이 apoptosis 혹은 괴사(necrosis) 과정에 의하여 매개되는지를 확인하기 위해 apoptosis 현상의 특징인 agarose electro- phoresis법을 이용한 ladder형 DNA분절을 획인하였다. 유향물주줄물을 300 |ig/mZ 농도가 되도록 HL-60 세포주에 4시간 간격으로 처리하여 DNA를 추출한 후 1.
획인하였다. 유향물주줄물을 300 |ig/mZ 농도가 되도록 HL-60 세포주에 4시간 간격으로 처리하여 DNA를 추출한 후 1.2% agarose gel에 전기영동하여 ethidium bromide 염색을 통하여 조사한 결과, &시간 이후부터 ladder형의 DNA분절을 확인하였다(Fig. 2).
Caspase 활성화에 미치는 영향 - 유향물추출물에 의한 HL-60 백혈병 유래 혈액 암세포의 apoptosis가 caspase의 활성화와 관계가 있는지를 확인하기 위하여 caspase계 cysteine proteases 인 caspase-1, caspase- 3, caspase-6, caspase-8 및 caspase-9의 활성 변화의 정도를 조사하였다(Figs. 3A, 3B, 3C). 먼저 유향물추출물을 500 |ig/m/ 농도로 처리 후 처리 시간에 따른 caspase의 활성 변화를 조사한 결과, caspase-1, caspase- 6, caspase-8 및 caspase-9는 시간 경과에 따른 변화가 없었다(Figs.

대상 데이터

실험재료 - 실험에 사용된 유향 (Bostvdlia carterii)& 우석대학교 부속 한방병원에서 구입한 후 정선하여 사용하였으며, 시료는 유향 100g을 물 U에 넣고 100°C에서 3시간 환류 냉각장치에서 추출 여과하고 3, 200 rpm으로 20분간 원심분리 후 상등액을 감압 농축한 다음 -70°C에서 12시간 이상 동결건조 시켜, 유향물추출물 22.63 g(수득률 : 22.63%)을 얻어 시료로 사용하였다.
HL-60 혈액암 세포주 배양 - 인체 백혈병으로부터 유래된 암세포주인 HL-60은 C02 세포 배양기 (37°C, 5% CO, 에서 10% fetal bovine serum이 포함된 RPMI 1640(Gibco BRL Co, Gaithersburg, MD, USA) 배지에서 배양하였다. 약 时]간주기로 RPMI 1640 배양액을 교체하여 주었으며, log phase에 있는 세포에 phosphate-buffered saline(pH 7.
Caspase-1 과 caspase-3의 활성측정은 각각 기질로 Anorogenic substrate 인 7-amino4cou- marin(AMC)-YVAD(Calbiochem, San Diego, CA, USA) 50 J1M 및 7-amino-4-coumarin(AMC)-DEVD(Calbio - chem Co, San Diego, CA) 50 pM을 사용하였으며, 이들의 proteolytic cleavage를 측정하여 caspase 활성을 결정하였다. 이때의 파장은 excitation wavelength (380 nm) 와 emission wavelength(460 nm) 를 사용하였다. Caspase-6 효소 활성은 기질로서 Ac-VEID- AMC(Calbiochem, San Diego, CA, USA) 50 jiM 人]" 용하였으며 이들의 proteolytic cleavage를 380 nm (excitation wavelength) 오丰 460 nm(emission waveleng- th)의 파장 하에서 즉정하였다.

이론/모형

세포 viability 측정 - 세포의 생존율은 MTT assay 방법을 이용하였다.'紛 세포배양 판(24-weIl plate)에 welT당 lx 105 cell/mZ씩 분주하여, 실험에 필요한 각 조건의 한약재 등을 처리하고 일정 시간 배양한 후, 배양액에 MTT를 최종농도 100 이 되도록 넣어주었다.
0)에 용해시키고 14, 000 rpm으로 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리하여 얻은 상층액은 Bicinchoninic acid(BCA, Sigma Co, St. Louis, CA, USA) 법으로 정 링右}여 assay buffer(100 mM Hepes, 10% sucrose, 0.1% Chaps, pH 7.5, 1 mM PMSE 1 卩矽m/ apro- tinin, 1 jig/m/ leupeptin, 2 mM DTT)에 희석시킨 후, 형광표지된 기질과 37°C 에서 30분간 반응시킨 후 fluorometer(Molecular Devices Co, Sunnyvale, USA) 로 측정하였다. Caspase-1 과 caspase-3의 활성측정은 각각 기질로 Anorogenic substrate 인 7-amino4cou- marin(AMC)-YVAD(Calbiochem, San Diego, CA, USA) 50 J1M 및 7-amino-4-coumarin(AMC)-DEVD(Calbio - chem Co, San Diego, CA) 50 pM을 사용하였으며, 이들의 proteolytic cleavage를 측정하여 caspase 활성을 결정하였다.
유향물추출물이 혈액암세포 HL-6Q의 세포 생존율에 미치는 영향 - 유향물추출물이 혈액암 환자로 부터 유래된 HL-60 세포의 생존율에 어떤 영향을 미치는가를 알아보기 위하여 유향물추출물의 농도를 변화시키면서 세포의 치사도를 MTT assay 방법으로 측정하였다. 유향물추출물의 경우 300 临即 농도에서 40% 이하의 생존율을 보였고, 600 ng/m/ 이상의 유향물추출물처리시 대략 20% 정도의 생존율을 나타내었다(Fig.

성능/효과

1A). 또한 300 농도의 유향물추출물에 의한 시간별 생존율의 변화를 측정한 결과, 시간에 따른 HL- 60 세포의 생존율은 유향물추출물 처리 4시간 이후에 55%였으며, 8시간 이후부터는 40%创하의 생존율을 보였다. 8시간 이후에는 시간에 따른 더 이상의 세포 생존율 저하를 관찰할 수 없었다(Fig.
3A, 3B). Caspase-3은 유향물추출물처리 4시간 이후부터 증가하여 S시간에는 대조군에 비해 활성이 약 5배 이상 증가하다가 점차 둔화되는 양상을 보였고(Fig 3C), western blot으로 확인한 cas pase-3 기질 물질인 R\RP 단백질(116 kDa band) 은시간이 경과함에 따라 caspase-3의 활성정도와 비례하여 R\RP 분해 단백질(85 kDa band)로 나타나는 것을 확인하였다(Fig. 3D).
한편 Bcl-2 계에 속하는 Bax 단백질은 apoptosis를 촉진시키는 단백질로 밝혀졌으며 Bcl-2와의 hetero- 혹은 homo dimer를 형성함으로써 apoptosis의 조절에 깊이 관여하고 있다. 따라서 본 실험에서 유향물추출물 처리시에 Bcl-2 및 Bax의 발현양상의 변화를 조사한 결과, Bcl-2 의 발현은 유향 추출물 처리 4시간 이후부터 점차 시간 의존적으로 감소하였고(Fig. 5A), 이와는 달리 apoptosis를촉진시키는 기능을 수행하는 Bax 단백질의 발현은 시간 의존적으로 증가되어 나타났다(Fig. 4B).
먼저 유향물추출물이 HL-60 세포주에 직접적인 살상작용을 할 수 있는지에 대하여 알아보기 위하여 유향물추출물을 농도별로 처리한 결과 농도에 비례하는 암세포에 대한 세포독성이 있음을 확인하였다(Fig. 1). 유향물추출물을 처리한 HL-60 세포의 독성이 apoptosis 혹은 necrosis 과정에 의하여 매개되는지를 확인하기 위하여 유향물추출물 300 卩以m/를 HL-60 세포주에 4 시간 간격으로 처리하여 DNA를 추출한 후 1.
1). 유향물추출물을 처리한 HL-60 세포의 독성이 apoptosis 혹은 necrosis 과정에 의하여 매개되는지를 확인하기 위하여 유향물추출물 300 卩以m/를 HL-60 세포주에 4 시간 간격으로 처리하여 DNA를 추출한 후 1.2% agarose gel에 전기영동 하여 ethidium bromide 염색을 통해 조사한 결과, 8시간 이후부터 ladder형의 DNA분절이 확인되어(Fig. 2), 유향물추출물에 의한 세포의 독성은 apoptosis 과정으로 확인되었다. 이는 Jing 등2佝 보고한 HL-60 세포에서 유향이 nitroblue tetrazolium(NBT) test 와 DNA fragmentation 분석에 의한 apoptosis 억제유도 효과와 일치하였다.
일단 caspase-3이 활성화가 되면 poly(ADP-ribose), polymerase(PARP), lamin, MEKK 및 다른 caspases 등의 여러 표적 단백질에 작용해서 기능적 활성화나 불활성화를 유도함으로써 세포내 여러 신호전달 활성을 조절하기 때문에 이들은 대부분 apoptosis에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.62729) 그러므로 유향물추출물이 caspase활성화에 어떠한 영향을 미치는지에 대하여 알아본 결과, 유향물추출물에 의한 apoptosis에서도 역시 caspase-3 효소활성이 증가되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 3). 즉 유향의 처리 효과는 시간 의존적으로 작용하여 8시간부터 최고 활성을 보이다가 그 이후부터는 감소되어 유향물추출물이 HL-60 백혈병 유래 혈액암 세포에서 caspase의 활성, 특히 caspase-3 cysteine protease 활성을 증가 시켜 apoptosis가 유도되었음을 알 수 있었다.
3). 즉 유향의 처리 효과는 시간 의존적으로 작용하여 8시간부터 최고 활성을 보이다가 그 이후부터는 감소되어 유향물추출물이 HL-60 백혈병 유래 혈액암 세포에서 caspase의 활성, 특히 caspase-3 cysteine protease 활성을 증가 시켜 apoptosis가 유도되었음을 알 수 있었다.
3°)Bcl-2에 의한 apoptosis 억제의 관련 기전으로서 제시되고 있는 것은 산화 환원 상태조절, 세포 내 이온의 분포조절, caspase 활성, 미토콘드리아 막 전위, 핵 DNA 분 절화, apoptosis 신호전달계의 활성화 (JNK, p38 등) 조절 등 광범위하다. 또한 Bax 단백질은 Bcl-2와는 달리 오히려 apoptosis를 촉진시키는 기능을 수행한다고 알려져 있는데*) 본 연구결과 유향물추출물을 처리하였을 때 Bcl-2의 발현은 감소되었으나(Fig. 4A), Bax 단백질의 발현은 유향물추출물 처리 시에 시간 의존적으로 발현이 증가되었다(Fig. 4B). 따라서 유향물추출물이 Bcl-2 및 Bax 발현조절에 관여함을 알 수 있었고, 또한 Bcl-2 및 Bax 발현조절이유향물추출물 유도성 HL-60apoptosis 에에 중요 기전임을 알 수 있었다.
4B). 따라서 유향물추출물이 Bcl-2 및 Bax 발현조절에 관여함을 알 수 있었고, 또한 Bcl-2 및 Bax 발현조절이유향물추출물 유도성 HL-60apoptosis 에에 중요 기전임을 알 수 있었다.
이상의 연구 결과, 유향물추출물은 apoptosis 신호전달기전인 caspase 3-like cysteine protease와 Bax 같은 세포사멸 유도 단백질을 활성화시킴으로써 apoptosis가 이루어짐을 알 수 있었다.
1. 유향물추출물은 300 瞄個 처리 농도에서 HL- 60세포의 생존율이 40% 정도를 나타냈다.
2. 전기영동에 의한 DNA laddering 관찰 결과, 유향물추출물에 의한 apoptosis시 DNA 분절현상이 관찰되었다.
3. 유향물추출물 300 喝即 농도로 처리 후 시간 경과에 따른 caspase cysteine protease의 활성 변화를 조사한 결과, caspase 3-like cysteine protease 활성을 증가시켰다.
4. 유향물추출물 300 gg/m/ 농도로 처리 후 시간 경과에 따라 Bax 단백질의 발현은 증가 되었으나, Bcl- 2 단백질의 발현은 억제되었다.
이상의 결과, 유향물추출물은 apoptosis 신호전달기전인 caspase 3-like cysteine protease와 Bax 단백질의 활성화를 증가시킴으로써 apoptosis가 이루어짐을 알 수 있었다.

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