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제안 방법
- 동물 모델의 제작 -Exp. A의 위장장애군은 ethyl alcohol 4 mZ/kg 과 sodium salicylate 200 ㎎/㎏ 을 매일 동일한 시간에 1일 1회 7일간 강제 경구 투여하여 위장장애를 유발한 후 5일간 sabne을 동일조건으로 공급하며 자연치유로 인한 실험오차를 배제하였다. Treatment 1은 위와 동일한 방법으로 alc-salicylate 7 일간의 투여로 위장장애를 유발한 후 5일 간 마늘-죽염 혼합제제의 수성 현탁액을 용시 혼화, 제조하여 200 mg众g되게 1일 1회 강제 경구투여 하였으며, 공시험 군은 12일간 saline만을 투여하였다.
- Glutathione peroxida暗e(GPx)의 활성측정 -Glutathione peroxidase의 활성측정은 ftglia 등의 방법刽 에 준흐】여 일정량의 0.1 M Ths-HCl buffer(pH 72) 용액에 기질인 H2O2> ImM GSH, 0.2 mM NADPH 및 효소원을 첨가하여 25℃, 5분간 반응시키는 동안에 생성되는 산화형 Glutathione(GSSG)를 환원시키는데 소비된 NADPH의 함량을 340nm에서 측정하여 그 활성을 산정하였다. 효소의 활성은 1분당 Img의 단백질 이산화시킨 NADPH의 양을 nmole로 나타내었다.
- Glutathione reductase(GR)의 활성 츅정 - Glutathione reductase의 활성측정은 Meiz와 Langdon의방법 64)에 준하여 27 mM EDTA-Na와 16.3 mM GSSG이 함유된 0.1M Tris HC1 buffer(pH 8.0)용액일정량에 6mM NADPH를 기질로 하여 효소액을 가한 후 25℃에서 5분간 반응시키는 동안에 GSH를 생성시키는데 소비된 NADPH의 함량을 340nm에서 측정하여 그 활성을 산정 하였다. 효소의 활성은 1분당 Img의 단백질이 산화시킨 NADPH의 양을 nmole로나 타내었다.
- Glutathione익 함량측정 - 위장조직 중 Glutathione (GSH)의 함량측정은 Grffith의 방법6$에 준하여 조직마쇄액 일정량에 4% Sulfosalicylic acid를 가하여 제단 백한 후 얻은 상징액 일정량에 5.5'-dithiobis 2-nitro benzoic acid, 3 mM NADPH, 50 units glutathione reductase를 함유한 0.1 mM sodium phosphate buffer (pH7.5) 일정량을 넣고 반응시켜 생성된 p-nitrothiop- henol의 흡광도를 파장 412 nm에서 측정하여 농도를 산정하였다. GSH함량은 조직 1g당 함유되어 있는 GSH의 양을 pimole로 나타내었다.
- A의 위장장애군은 ethyl alcohol 4 mZ/kg 과 sodium salicylate 200 ㎎/㎏ 을 매일 동일한 시간에 1일 1회 7일간 강제 경구 투여하여 위장장애를 유발한 후 5일간 sabne을 동일조건으로 공급하며 자연치유로 인한 실험오차를 배제하였다. Treatment 1은 위와 동일한 방법으로 alc-salicylate 7 일간의 투여로 위장장애를 유발한 후 5일 간 마늘-죽염 혼합제제의 수성 현탁액을 용시 혼화, 제조하여 200 mg众g되게 1일 1회 강제 경구투여 하였으며, 공시험 군은 12일간 saline만을 투여하였다.
- Exp. 四 공시험군은 saline만을 12일간 투여하였다.
- Exp. 日게 속한 위장장애군은 먼저 saline을 5일간 지속 투여 후 alc-salicylate 로 위장장애 유발을 위한 처치를 7일간 지속하였고 방어군fReatment 2)은 saHne을 5일 투여 후 위장장애 처치 7일과 동시에 마늘-죽염을 병용 투여하였으며, 예방군(Geatment 3) 은먼저 5일간 마늘-죽염을 투여한 후 7일간 위장장애 유발 과정을 시행하였다. Exp.
- 마늘 속의 함유황 성분이 free radical scavenging 능을 통한 항산화작용과 죽염의 소화기계 염증개선 작용을 가지고 있는 것으로 알려졌으므로 마늘과 죽염을 2:1로 혼합한 제재를 구입하고, 알콜과 NSAID로 위염을 유발한 동물 모델을 만든 후 이 실험동물에 대해마늘-죽염제재의 위염에 대한 free radical scavenging 기구와 관련된 효소의 활성에 미치는 효과를 측정하였으며, 두 물질의 혼합제재가 나타내는 치료, 예방, 방어기전을 밝히고자 하였다.
- 마늘-죽염 혼합제제의 수성 현탁액을 alcohol- salicylate로 7일간 위장장애를 유발한 동물 모델에게 5~7일간 투여하였다. 위 손상 후 마늘-죽염 혼합제제를 투여하여 마늘-죽염 혼합제제의 위장장애의 치료에 미치는 영향을 관찰한 Exp.
- 실험동물을 마취 개복한 후 위를 적출, 절개하여 내용물을 제거하고 빙냉 생리 식염수로 세척, 여지로 압박, 이물질을 제거한 후 냉소의 빙판 위에서 가위로 세절하고 조직 1g당 4배량의 0.1M KP buffer(po- tassium phosphate buffer pH 7.4) 를 가하여 빙 냉 상태에서 glass teflon homogenizer로 마쇄하였다. 이 마쇄 균질액을 600Xg에서 10분간 원심분리하여 핵 및 미마쇄 부분을 제거한 다음 lQOOOXg에서 20분간 원심분리하여 mitocondrial 庭ction을 얻고 SOD 활성 측정시료로 하였으며 이것을 15,000Xg에서 1시간 동안 초원심 분리하여 상징액을 얻은 후 GPx, GR 활성 측정원 으로 사용하였다.
- 위장 손상 정도의 측정 -실험동물을 단두도살하고정중선을 따라 개복한 후 대만부를 따라 절개하여 빙냉 생리식염수에 세척하였으며 위장 손상은 수종, 발적, 혈흔, 미란, 부종등 손상 부위의 크기를 확대경을사용하여 측정하고 길이를 잰 후 면적으로 환산, 비교산출 하였다.
- 4) 를 가하여 빙 냉 상태에서 glass teflon homogenizer로 마쇄하였다. 이 마쇄 균질액을 600Xg에서 10분간 원심분리하여 핵 및 미마쇄 부분을 제거한 다음 lQOOOXg에서 20분간 원심분리하여 mitocondrial 庭ction을 얻고 SOD 활성 측정시료로 하였으며 이것을 15,000Xg에서 1시간 동안 초원심 분리하여 상징액을 얻은 후 GPx, GR 활성 측정원 으로 사용하였다. 상기의 모든 조작은 0~4。(3에서 실시하였다.
- 0 mZ가 되게 하였다. 이 반응액을 2RC에서 5 분간 반응시킨 다음 550nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 효소활성을 산정하였다.
대상 데이터
- Bovine serum albumin(BSA), NADPH(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), GSH (reduced & oxydized form of glutathione), TBA (thiobarbituric add sodium salt), SDS(sodium dodecyl sulfate), Sodium salicylate, TCA(trichloro acetic acid), EDTA, DTNB(5, 5Jdithiobis 2-nitro benzoic acid), Sulfo salicylic acid, GR(glutathione reductase), Triethanol amine, Tris-buffei; H2O2> Cytochrome C, KH2PO4, K2HP04, 2-Vinyl pyridine, Absolute ethanol 등은 Sigma사로부터 구입했으며 Aged garlic-bamboo salt mi该tre(2:l)는 (주)인산가 제품을 구입해서 사용하였다. 이 제품은 쪽이 자잘한 밭마늘을 겉껍질 및 속껍질을 제거하고 수세한 후 180。(3에서 40분간 은은히 구워 75~85℃에서 10시간 건조시킨 후 200메쉬체로 걸러 분말로 한 마늘가루 2분량에 죽염제조법47) 에 따라 제조한 9회 죽염 1분량을 결합제 등 일체 부형제를 사용하지 아니하고 강타, 성형한 정제이다.
- A 또는 공시험군(control), 위장장애군(gastropathy), 방어군(treatment 2), 예방 군(treatment 3)의 Exp. B로나누고 매 group당 6마리의 동물을 사육하였으며 12 일에 걸쳐 실험하였다.
- 실험동물 - 실험동물은 오전 7시에 점등되며 오후 7 시에 소등되는 실내온도 20±2℃ 및 적정 습도를 유지하는 조건에서 사육한 외관상 건강한 체중 250 g 내외의 웅성 흰쥐를 사용하였다. 공시험군(control), 위장장애군(gastropathy), 치료군(treatment 1)의 Exp.
- 실험에 사용한 기기로는 UV spectrophotometer (SHIMAZU UV-120), Refrigerated centrifuge(Hanil supra 22K), Ultracentrifuge(Hitachi70P-72)등을 사용하였다.
데이터처리
- 행하였다. 실험결과의 유의성 검증은 student's t-test를 이용하여상호 비교하였다.
이론/모형
- Superoxide dismutaee(SOD)의 활성측정 - Superoxide dismutase 활성측정은 Martin의 방법에 준하여 실시하였다.
- 단백질의 정량은 Lowry등의 방법6©에 준하여 bovine serum albumin을 표준품으로 하여 행하였다. 실험결과의 유의성 검증은 student's t-test를 이용하여상호 비교하였다.
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