합성보존제(benzalkonium chloride)와 천연보존제(chitosan)의 세포독성 및 항균 활성에 관한 연구 A Study on the Cytotoxicity and Antimicrobial activity of Synthetic preservative(benzalkonium chloride) and Natural preservative(chitosan)원문보기
점안약에 광범위하게 사용되는 보존제(preservatives)의 세포독성 및 항균 활성 및 항진균 활성을 검정하였다. 세포독성은 L929세포를 사용하였으며, 항균 항진균 활성 검정에 사용된 균주는 눈의 정상 세균총의 일종이거나 각막염을 일으키는 세균인 Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Staphylococcus aureus ATCC25923, Eschenchia coli ATCC25922 등 3가지이고, 진균은 Trichoderma reesei ATCC6967을 사용하였다. 사용된 시약은 합성 보존제인 benzalkonium chloride(BAC)와 천연 보존제인 키토산이며 키토산의 분자량은 60,000, 탈아세틸화도는 95%, 점도는 2 cps였다. L929세포에 대해 24 hr, 48 hr, 72 hr 동안 각각의 농도로 세포독성 검정 결과 세포의 30% 이상 성장저해를 일으키는 농도는 BAC의 경우 0.005~0.001%였고, 키토산의 경우는 0.6~0.55%였으며, 이 결과는 시간에 따라 거의 변화가 없었다. 각각의 균에 대한 BAC의 항균 항진균 활성을 나타내는 최소저해농도는 P. aeruginosa에는 0.1~0.01%였고, S. aureus에는 0.001~0.0001%였으며 E. coli에는 0.001~0.0001%, T. reesei에는 0.1~0.01%였다. 키토산은 P. aeruginosa의 경우 2%, S. aureus가 1%에서 2일간 균 성장 정시작용을 나타내었으며, E. coli에서는 성장저해를 일으키지 않았다. 진균에 대해서는 농도 의존적으로 생육을 촉진시켰다. 천연보존제는 합성보존제에 비해 항균성은 다소 떨어지지만 세포독성을 일으키지 않으며 여러 약리 작용이 있으므로 이에 대한 연구가 더 필요하다.
점안약에 광범위하게 사용되는 보존제(preservatives)의 세포독성 및 항균 활성 및 항진균 활성을 검정하였다. 세포독성은 L929세포를 사용하였으며, 항균 항진균 활성 검정에 사용된 균주는 눈의 정상 세균총의 일종이거나 각막염을 일으키는 세균인 Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Staphylococcus aureus ATCC25923, Eschenchia coli ATCC25922 등 3가지이고, 진균은 Trichoderma reesei ATCC6967을 사용하였다. 사용된 시약은 합성 보존제인 benzalkonium chloride(BAC)와 천연 보존제인 키토산이며 키토산의 분자량은 60,000, 탈아세틸화도는 95%, 점도는 2 cps였다. L929세포에 대해 24 hr, 48 hr, 72 hr 동안 각각의 농도로 세포독성 검정 결과 세포의 30% 이상 성장저해를 일으키는 농도는 BAC의 경우 0.005~0.001%였고, 키토산의 경우는 0.6~0.55%였으며, 이 결과는 시간에 따라 거의 변화가 없었다. 각각의 균에 대한 BAC의 항균 항진균 활성을 나타내는 최소저해농도는 P. aeruginosa에는 0.1~0.01%였고, S. aureus에는 0.001~0.0001%였으며 E. coli에는 0.001~0.0001%, T. reesei에는 0.1~0.01%였다. 키토산은 P. aeruginosa의 경우 2%, S. aureus가 1%에서 2일간 균 성장 정시작용을 나타내었으며, E. coli에서는 성장저해를 일으키지 않았다. 진균에 대해서는 농도 의존적으로 생육을 촉진시켰다. 천연보존제는 합성보존제에 비해 항균성은 다소 떨어지지만 세포독성을 일으키지 않으며 여러 약리 작용이 있으므로 이에 대한 연구가 더 필요하다.
This study was performed to examine the cytotoxicity and antimicrobial activity of synthetic or natural preservative. Fibroblast cells L929 were used for cytotoxicity test and Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Staphylococcus aureus ATCC25923, Escherichia coli ATCC25922, Trichoderma reesei ATCC6967 w...
This study was performed to examine the cytotoxicity and antimicrobial activity of synthetic or natural preservative. Fibroblast cells L929 were used for cytotoxicity test and Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Staphylococcus aureus ATCC25923, Escherichia coli ATCC25922, Trichoderma reesei ATCC6967 were used for antibacterial and antifungal activities. Benzalkonium chloride(BAC) as a synthetic preservative and chitosan as a natural preservative were used for this study. Minimum inhibitory concentration(MIC) of BAC was 0.1~0.01% for P. aeruginosa and 0.001~0.0001% for S. aureus and 0.1~0.01% for T. reesei, MIC of chitosan was 2% for P. aeruginosa and 1I % for S. aureus. This study suggest that chitosan might be useful as an eyedrop.
This study was performed to examine the cytotoxicity and antimicrobial activity of synthetic or natural preservative. Fibroblast cells L929 were used for cytotoxicity test and Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Staphylococcus aureus ATCC25923, Escherichia coli ATCC25922, Trichoderma reesei ATCC6967 were used for antibacterial and antifungal activities. Benzalkonium chloride(BAC) as a synthetic preservative and chitosan as a natural preservative were used for this study. Minimum inhibitory concentration(MIC) of BAC was 0.1~0.01% for P. aeruginosa and 0.001~0.0001% for S. aureus and 0.1~0.01% for T. reesei, MIC of chitosan was 2% for P. aeruginosa and 1I % for S. aureus. This study suggest that chitosan might be useful as an eyedrop.
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제안 방법
과 Fungizone(30“l/ml). Antibiotics(10^1 /'仁] 를 첨가하여 사용하였으며 세포는 3일마다 계대배양 하7 다. 세포의 배양은 37℃.
72 hr 졍과 후. MTT가 포함된 배양액으로 J 환하여 3시간 배양한 다음, DimetylsulfoxideCDMSO'S formazan을 용해시켜 ELISA Reader로 570nm에서 흡광도를 측정하였으며 대조군과 비교하여 30%이상 세포중식저해가 있을 때를 독성이 있는 것으로 하였다
85紡 NaCI)로 희석한 다음. 고체 평판배지에 conlarge 봉을 이용하여 고르게 펴서 37C에서 48hr 배양 후 집락수 (CFU)를 세어 균감소율을 알아보았다. 감소율은 다음 식에 의해 구하였다.
85% NaCI)로 희석하어 도말하였다. 배양조건은 각 균의 최적 생장온도에 맞추고 24 hr, 48 hr. 72 hr에서 배양하여 균의 증식이 억제된 정도를 대조군과 비교하여 MIC값을 구하였다莅.
이에 본 연구는 식품의약품안전청의 세포독성검사에 제시한 방법과 유사한 방법을 이용하여. 보존제의 세포독성을 검정하기 위해 생쥐의 섬유모세포를 배양하여세포중식 저해정도를 비색반응에 의해 비교하였고, 항균성을 검정하여 합성보존제의 문제점을 보완해 줄 천연보존제로서의 키토산을 검중해 보았다, 키토산은 여러 용도로 광범위하게 이용되지만 점안약의 보존제로서의 연구는 아직 없으므로. 이 연구가 키토산을 보존제로 응용하기 위한 기초연구로서 향후 이 분야의 웅용에 기초자료로 사용될 수 있을 것이다.
세포독성검정£ Mosmann(1983)의 방법에 따라 MTT assay를 시행하2 는데. 세포소기관인 mitochondria의 활성을 조사해 세포§ 성을 측정하는 방법이며 96 Well plate에서 세포주를 4 배양한 후 세포가 well당 &0~70%정도 채워졌을 때 BA( 와 키토산이 농도별로 포함된 medium을 처리하였다. 각z 24 hr.
본 연구에 사용된 BAC(Sigma co.)와 키토산(키톤라이프)은 각각 일급시약을 사용하였는데 고분자량의 불용성키토산이 강산에만 녹는 성질이 있어서, 점안약이나 콘택트렌즈의 관리용액의 성분으로 이용되기 위해서는 수용성이라는 점이 전제되어야 하므로 저분자량(60, 000)의 수£ 성 키토산을 사용하였다. 수용성 키토산의 탈아세틸화도으측정은 콜로이드 적정법을 이용하였는데 방법은 키토。 0.
세포독성 검정에 사용된 세포주는 생쥐의 섬유모세드 (L929 Cell) 이며 배양액은 a -MEM( Minimum Essen揆 Medium Alpha Medium(GIBCO))에 10%의 Fetal Bov二 Serum(FB* 과 Fungizone(30“l/ml). Antibiotics(10^1 /'仁] 를 첨가하여 사용하였으며 세포는 3일마다 계대배양 하7 다.
항잔균 활성은 한천 1.5% 배지용액을 만들어 이것에 보존제를 농도별로 처리한 후 멸균되어진 petri dish (87x15mm)에 분주하여 웅고시킨 위에 각각의 실험 균주를 생리식염수(0.85% NaCI)로 희석하어 도말하였다. 배양조건은 각 균의 최적 생장온도에 맞추고 24 hr, 48 hr.
이론/모형
4xl0‘cell/m]의 세포를 96 well plate(NUNC)^ 200 “1/well 분주해 실험에 사용하였다. 세포독성검정£ Mosmann(1983)의 방법에 따라 MTT assay를 시행하2 는데. 세포소기관인 mitochondria의 활성을 조사해 세포§ 성을 측정하는 방법이며 96 Well plate에서 세포주를 4 배양한 후 세포가 well당 &0~70%정도 채워졌을 때 BA( 와 키토산이 농도별로 포함된 medium을 처리하였다.
성능/효과
각각의 균에 대한 BAC의 항균 , 항진균 활성을 나타내는 최소저해농도는 P. aeruginosa에서 0.1 ~ 0.01 %였고. S.
본 연구의 결과를 종합해 보면 키토산이 BAC보다 서포독성이 낮아 각막이나 결막에 독성이 없을 것으로 사토되며. 자체적인 항균작용과 완충효과.
후속연구
3. 천연보존제는 합성보존제에 비해 항균성은 다소 떨어지지만 세포독성을 일으키지 않으며 여러 약리 작용이있으므로 이에 대한 연구가 더 필요하다.
보존제의 세포독성을 검정하기 위해 생쥐의 섬유모세포를 배양하여세포중식 저해정도를 비색반응에 의해 비교하였고, 항균성을 검정하여 합성보존제의 문제점을 보완해 줄 천연보존제로서의 키토산을 검중해 보았다, 키토산은 여러 용도로 광범위하게 이용되지만 점안약의 보존제로서의 연구는 아직 없으므로. 이 연구가 키토산을 보존제로 응용하기 위한 기초연구로서 향후 이 분야의 웅용에 기초자료로 사용될 수 있을 것이다.
자체적인 항균작용과 완충효과. 세포활성효과 등。 있으며 점성이 높아 약물 서방출효과도 높아지므로 점《 약의 성분으로 사용이 가능할 것으로 사료된다.
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