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문제 정의
- 본 연구에서는 어류질병에 대한 천연 항균제를 개발하기 위한 일환으로 계피로부터 항균성 물질을 추출하여 어류질병세균에 대한 항균효과, 최소발육저지농도 및 최소살균농도 그리고 어류사료 적용시험으로서 계피 추출물에 침지시킨 사료의 항균활성 및 저 장성 등을 검토하였다.
제안 방법
- (Minimum Bactericidal Concentration, MBC) 식염 1% 첨가된 Mueller Hinton broth에 추출물이 일정한 농도가 되도록 첨가한 다음 각 피검균의 최종 농도가 lVCFU/mL 정도 되도록 접종하여 35©에서 24시간 배양하였다. 배양액 0.
- 5 mm)를 계 피 추출물에 10분 간 침지시킨 후 상온에서 건조하였다. 건조된 침지 사료 10개를 100 mL Mueller Hinton broth에 넣어 10분간 방치한 다음 5분간 blending하여 35t에서 배양하면서 생균수를 측정하였다. 이때 대 조구로서 95% 에탄올에 침지시킨 것과 침지시키지 않은 사료를 사용하였다.
- 계피 100g에 에탄올(95%)을 1:5의 비율 (w/v)로 가하여 상 온에서 4시간 이상 진탕 추출한 다음 여과 (Toyo No. 5A)하였다. 여액은 감압 농축하여 용매를 제거한 뒤, 이를 다시 95% 에탄올로 용해시켜 100mL로 정용하여 항균력 측정을 위한 검액으로 사용하였다.
- 계피 추출물에 침지시킨 사료의 생균수 변화를 알아보기 위하여 사료를 계피 추출물에 침지시킨 것과 95% 에탄올에 침지시킨 것 그리고 침지시키지 않은 것을 액체배지에 넣어서 시간 경과에 따른 생균수 변화를 측정하여 Fig. 3에 나타내었다. 침지시키지 않은 사료 대조구는 초기균수 ZlXirCFU/mL인 것이 12시간 배양 후에는 5.
- 계피 추출물에 침지시킨 사료의 어류질병세균에 대한 항균활성을 살펴보기 위하여 사료 (중량 285±20mg, 직경 9±0.5mm)를 계피 추출물에 10분간 침지시킨 후 상온에서 하룻밤 건조하여 에 탄올을 증발시킨 다음 항균활성을 측정하였다.
- 계피 추출물에 침지시킨 사료의 저장온도에 따른 항균력 변화를 알아보기 위하여 사료 (중량 285±20mg, 직경 9±0.5mm)를 계피 추출물에 10분간 침지시킨 후 상온에서 건조하여 10, 20, 35t 에서 28일간 저장하면서 항균활성을 측정하였다. 항균활성은 상기 5와 동일한 방법으로 측정하였으며, 피검균으로는 L.
- 계피 추출물을 사료에 적용하기 위하여 사료를 계피 추출물에 침지시킨 다음 각종 어류질병세균에 대한 항균력을 검토하였으며, 또한 항균성 물질이 흡수된 사료의 적정 공급량을 결정하기 위하여 각 사료의 중량과 흡수되는 추출물 함량과의 상관관계를 분석하였다. 항균활성은 Mueller Hinton agar에 시험균 배양액을 1% 되도록 첨가하여 평판(85×15 mm)에 25mL씩 분주한 직후 항균 성 물질을 흡수시킨 사료를 침지하여 굳힌 다음 35t에서 24시간 배양하여 사료 주변의 저지대의 직경을 측정하였다.
- 계피 추출물이 어류질병세균의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 앞의 실험에서 감수성이 가장 민감한 그람양성세균 및 그 람음성세균을 대상으로 추출물의 농도를 각기 달리한 액체배지에서 시간 경과에 따른 균 사멸 정도를 조사하여 Fig. 1과 2에 각각 나타내었다.
- 계피 추출물이 어류질병세균의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 주줄물을 농도별로 100 mL Mueller Hinton broth에 첨가 한 다음 각 시험균을 정도되도록 접종하여 35t에서 배 양하면서 시간 경과에 따른 생균수 변화를 측정하여 mL당 집락수 (CFU, Colony Forming Unit) 로 나타내었다.
- 계피 추출액에 침지시킨 사료는 사용된 모든 어류 질병 세균의 증식을 억제하였으며, 그것의 항균 활성은 저장온도 10~35t에서 28일까지 안정하였다. 또한 침지 사료를 액체배지에 넣어 배양했을 때, 사료에 존재하는 미생물의 증식을 억제시켰다.
- 사료 중량에 따른 계피 추출물의 흡수량을 알아보기 위하여 중량이 각기 다른 사료 (평균 중량 285 mg 10개, 42.2 mg 20개, 5.35 mg 200개)를 계피 '추출물에 10분간 침지시킨 후 개체당 흡수되는 추 출물의 중량을 구한 다음, 계피 추출물을 가용성 고형분 함량으로 환산하여 개체당 중량과 흡수되는 계피 추출물 함량과의 상관관계를 그래프로 나타내어 분석하였다.
- 사료의 적정 침지 시간을 알아보기 위하여 사료 (중량 285±20 mg, 직경 9 ±0.5 mm)를 계피 추출물에 일정시간 (3, 5, 10, 20, 30 분) 침지시킨 후 상온에서 하룻밤 건조하여 에탄올을 증발시킨 다음 항균활성을 측정하였다. 항균활성 측정을 위한 피검균으로는 S.
- 등의 그람양성세균 4 균주와 Edwardsiella tarda 및 Listonella anguillarum 등의 그람음성세균 2 균주를 국립 수산진홍원 병리과로부터 분양받아 -7(忙 (15% glycerol)에서 보 존하면서 사용하였다. 시험균의 배양 및 항균력 측정에는 Mueller Hinton medium (Difco)에 식염을 1% 첨가하여 사용하였다.
- 식염 1% 첨가된 Mueller Hinton agar에 계피 추출물을 일정 농도로 첨가하고, 25mL씩 멸균된 평판에 분주하여 굳힌 후, 24시간 증균 배양된 시험균액을 접종한 다음 35t에서 48시간 배양하여 균 증식 여부를 관찰하였다. 이때 첨가되는 에탄올의 항균력을 배 제하기 위하여 모든 시험은 대조구를 설정하여 실시하였다.
- 식염 1% 첨가된 Mueller Hinton agar에 계피 추출물을 일정 농도로 첨가하고, 25mL씩 멸균된 평판에 분주하여 굳힌 후, 24시간 증균 배양된 시험균액을 접종한 다음 35t에서 48시간 배양하여 균 증식 여부를 관찰하였다. 이때 첨가되는 에탄올의 항균력을 배 제하기 위하여 모든 시험은 대조구를 설정하여 실시하였다.
- 어류질병에 대한 천연 항균제를 개발하기 위한 일환으로 계피 로부터 항균성 물질을 추출하여 어류질병세균에 대한 항균효과, 최소발육저지농도, 최소살균농도 및 어류 사료에 적용 시험 등을 실시하였다.
- 식염 1% 첨가된 Mueller Hinton agar에 계피 추출물을 일정 농도로 첨가하고, 25mL씩 멸균된 평판에 분주하여 굳힌 후, 24시간 증균 배양된 시험균액을 접종한 다음 35t에서 48시간 배양하여 균 증식 여부를 관찰하였다. 이때 첨가되는 에탄올의 항균력을 배 제하기 위하여 모든 시험은 대조구를 설정하여 실시하였다.
- 식염 1% 첨가된 Mueller Hinton agar에 계피 추출물을 일정 농도로 첨가하고, 25mL씩 멸균된 평판에 분주하여 굳힌 후, 24시간 증균 배양된 시험균액을 접종한 다음 35t에서 48시간 배양하여 균 증식 여부를 관찰하였다. 이때 첨가되는 에탄올의 항균력을 배 제하기 위하여 모든 시험은 대조구를 설정하여 실시하였다.
- 식염 1% 첨가된 Mueller Hinton agar에 계피 추출물을 일정 농도로 첨가하고, 25mL씩 멸균된 평판에 분주하여 굳힌 후, 24시간 증균 배양된 시험균액을 접종한 다음 35t에서 48시간 배양하여 균 증식 여부를 관찰하였다. 이때 첨가되는 에탄올의 항균력을 배 제하기 위하여 모든 시험은 대조구를 설정하여 실시하였다.
- 추출물에 대한 최소발육저지농도의 측정은 Lorian (1991)의 방법에 따라 액체배지희석법 (Broth dilution method)으로 행하였다. 즉, 식염 1% 첨가된 Mueller Hinton broth에 추출물이 일정 농도가 되 도록 첨가한 다음 각 시험균의 최종 농도가 IbCFU/mL 정도 되도 록 접종하여 35℃에서 24시간 배양한 후 흡광도(600nm)를 측정하여 최소발육저지농도를 구하였다. 이때 첨가되는 에탄올의 항균 력을 배제하기 위하여 모든 시험은 대조구를 설정하여 실시하였다.
- 항균성 물질을 어류가 직접 섭취할 수 있도록 하기 위하여 사 료를 계피 추출물에 침지시켜 항균성 물질을 흡착시킨 다음 각종 어류질병세균에 대한 항균력을 검토하였다 (Table 3). 계피 추출 물에 침지시킨 사료는 사용된 모든 어류질병세균의 증식을 억제하여 12~24mm의 저지대를 형성하였으며, 특히 S.
- 계피 추출물을 사료에 적용하기 위하여 사료를 계피 추출물에 침지시킨 다음 각종 어류질병세균에 대한 항균력을 검토하였으며, 또한 항균성 물질이 흡수된 사료의 적정 공급량을 결정하기 위하여 각 사료의 중량과 흡수되는 추출물 함량과의 상관관계를 분석하였다. 항균활성은 Mueller Hinton agar에 시험균 배양액을 1% 되도록 첨가하여 평판(85×15 mm)에 25mL씩 분주한 직후 항균 성 물질을 흡수시킨 사료를 침지하여 굳힌 다음 35t에서 24시간 배양하여 사료 주변의 저지대의 직경을 측정하였다. 이때 첨가되는 에탄올의 항균력을 배제하기 위하여 모든.
- 5mm)를 계피 추출물에 10분간 침지시킨 후 상온에서 건조하여 10, 20, 35t 에서 28일간 저장하면서 항균활성을 측정하였다. 항균활성은 상기 5와 동일한 방법으로 측정하였으며, 피검균으로는 L. anguillarum 을 사용하였다.
대상 데이터
- 계피는 시중 한약재 건재상에서 구입하여 20~30mesh로 분쇄 하여 -20t에 보관하면서 시험에 사용하였다. 항균성 물질의 추출 용매로 사용된 에탄올은 Hayman Limited사 (England) 제품을 사용하였다.
- , Lactococcus garvieae 및 Staphylococcus sp. 등의 그람양성세균 4 균주와 Edwardsiella tarda 및 Listonella anguillarum 등의 그람음성세균 2 균주를 국립 수산진홍원 병리과로부터 분양받아 -7(忙 (15% glycerol)에서 보 존하면서 사용하였다. 시험균의 배양 및 항균력 측정에는 Mueller Hinton medium (Difco)에 식염을 1% 첨가하여 사용하였다.
- 계피는 시중 한약재 건재상에서 구입하여 20~30mesh로 분쇄 하여 -20t에 보관하면서 시험에 사용하였다. 항균성 물질의 추출 용매로 사용된 에탄올은 Hayman Limited사 (England) 제품을 사용하였다. .
- 5 mm)를 계피 추출물에 일정시간 (3, 5, 10, 20, 30 분) 침지시킨 후 상온에서 하룻밤 건조하여 에탄올을 증발시킨 다음 항균활성을 측정하였다. 항균활성 측정을 위한 피검균으로는 S. iniae와 L. anguillarum을 사용하였다.
이론/모형
- 추출물에 대한 최소발육저지농도의 측정은 Lorian (1991)의 방법에 따라 액체배지희석법 (Broth dilution method)으로 행하였다. 즉, 식염 1% 첨가된 Mueller Hinton broth에 추출물이 일정 농도가 되 도록 첨가한 다음 각 시험균의 최종 농도가 IbCFU/mL 정도 되도 록 접종하여 35℃에서 24시간 배양한 후 흡광도(600nm)를 측정하여 최소발육저지농도를 구하였다.
성능/효과
- 8俸/mL 이었으며, 그람양성균보다 음성균에 대하여 보다 강한 살균작용을 나타내었다. 계피 추출물은 본 실험에 사용된 그람양성세균 및 그 람음성세균 모두에 대하여 폭 넓은 항균스펙트럼을 나타내었으며, 특히 Streptococcus iniae, Edwardsiella tarda 및 Listonella angui- "anim에 대하여 강한 증식 억제력을 보였다.
- 9998)으로 매우 밀접한 상관관계를 가지고 있었다 (data is not shown). 개체당 사료 중량이 적 을수록 단위 중량당 흡수되는 추출물의 양은 많았으며, 이는 사료 중량이 적을수록 단위 중량당 차지하는 표면적이 크기 때문인 것으로 사료되었다.
- 항균성 물질을 어류가 직접 섭취할 수 있도록 하기 위하여 사 료를 계피 추출물에 침지시켜 항균성 물질을 흡착시킨 다음 각종 어류질병세균에 대한 항균력을 검토하였다 (Table 3). 계피 추출 물에 침지시킨 사료는 사용된 모든 어류질병세균의 증식을 억제하여 12~24mm의 저지대를 형성하였으며, 특히 S. iniae, E. tarda 및 L. 辺arum에 대하여 강한 항균활성을 나타내었다.
- 계피 추출물에 침지시킨 사료를 저장온도 10~35t에서 28일간 저장하였을 때 잔존 항균활성은 97~100%로서 매우 안정하였다 (data is not shown). 따라서 겨울철은 물론 여름철에 상온에서 보존해도 항균활성의 감소는 거의 없을 것으로 생각된다.
- 계피 추출물은 S. iniae에 대하여 113.8 pg/mL 첨가로 살균작용을 보여 12시간 배양 후 3 log 정도의 균수를 감소시켰고, 189.6/jg/mL 첨가구는 초기 균수 1俨CFU/mL인 것이 12시간 배양 후 세균이 검 출되지 않았다. 또한 L.
- 계피 에탄올 추출물의 어류질병세균에 대한 항균활성은 Table 1과 같다. 계피 추출물은 그람양성 및 음성세균에 대하여 높은 항 균활성을 나타내었으며, 특히 S. iniae, E. tarda 및 L. anguilla- rum에 대하여는 0.3% 첨가로 균 증식을 억제하였다.
- 계피 추출물은 그람양성세균인 S. iniae에 대하여 75.8/jg/mL 첨가로 균 증식을 억제시켰으며, 113.8pg/mL 이상 첨가시에는 살 균작용을 보여 113.8俸/mL 첨가로 12시간 배양 후 31og 정도 감 소시켰고, 189.6陽/mL 첨가구에서는 초기 균수 llTCFU/mL인 것이 12시간 배양 후 균이 검출되지 않았다 (Fig. 1).
- 계피 추출물의 그람양성세 균에 대한 최소발육저지 농도는 75.8 ~189.6*g/mL이었고, 그람음성세균에 대하여는 75.8~113.8俸/mL 이었으며, 그람양성균보다 음성균에 대하여 보다 강한 살균작용을 나타내었다. 계피 추출물은 본 실험에 사용된 그람양성세균 및 그 람음성세균 모두에 대하여 폭 넓은 항균스펙트럼을 나타내었으며, 특히 Streptococcus iniae, Edwardsiella tarda 및 Listonella angui- "anim에 대하여 강한 증식 억제력을 보였다.
- 계피 추출물의 어류질병세균에 대한 최소발육저지농도 및 최소 살균농도를 Table 2에 나타내었다. 계피 추출물의 그람양성세균에 대한 최소발육저 지농도는 75.8~ 189.6 户g/mL이 었으며 , 그람음성 세 균에 대하여는 75.8~113.8 咫/1试, 으로 모든 시험균에 대하여 폭넓은 항균스펙트럼을 나타내었다. 최소살균 농도는 그람 양성 균에 대하여 는 n3.
- 9998)이었다. 계피 추출액에 침지시킨 사료는 사용된 모든 어류 질병 세균의 증식을 억제하였으며, 그것의 항균 활성은 저장온도 10~35t에서 28일까지 안정하였다. 또한 침지 사료를 액체배지에 넣어 배양했을 때, 사료에 존재하는 미생물의 증식을 억제시켰다.
- 8pg/tnL 첨 가시에는 12시간 배양까지는 균수 변화가 거의 없었고, 24시간 후 초기균수에 비하여 약 2log 정도 감소하였다. 그리고 151.6俸/mL 첨가구에서는 12시간 배양 후 약 31og 정도 균수가 감소하였으며, 24시간 후에는 세균이 검출되지 않았다 (Fig. 2).
- 따라서 계피 추출물 침지 사료는 어류질병세균에 대하여 항균 활성을 나타내는 것은 물론 1개월 정도 저장하여도 활성에 변화가 없었으며, 사료에 존재하는 세균의 증식을 억제시킬 수 있었다. 또한 계피는 항산화 작용 (Lee et al.
- 6/jg/mL 첨가구는 초기 균수 1俨CFU/mL인 것이 12시간 배양 후 세균이 검 출되지 않았다. 또한 L. angu辺arum에 대하여는 75.8 pg/mL 첨가 시에는 배양 24시간 후 약 21og 정도의 균수가 감소하였고, 151.6 pg/mL 첨가구에서는 24시간 후 세균이 검출되지 않았다.
- 또한 그람음성세균인 L. angu辺arum에 대하여는 37.9 pg/mL 첨 가로 대조구에 비하여 균 증식이 다소 억제되었으며, 75.8pg/tnL 첨 가시에는 12시간 배양까지는 균수 변화가 거의 없었고, 24시간 후 초기균수에 비하여 약 2log 정도 감소하였다. 그리고 151.
- 사료를 계피 추출물에 침지시킬 때 적정 침지 시간을 알아보기 위하여 사료를 계피 추출물에 일정시간 침지시킨 후 에탄올을 증 발시킨 다음 항균활성을 측정한 결과, 침지 10분까지는 항균력이 증가하였으나, 그 이후에는 일정하였다 (data is not shown). 따라서 이하의 실험에서는 10분간 침지시키는 것으로 하였다.
- 8 咫/1试, 으로 모든 시험균에 대하여 폭넓은 항균스펙트럼을 나타내었다. 최소살균 농도는 그람 양성 균에 대하여 는 n3.8~379.6/jg/mL이었으며, 그람음성균에 대하여는 113.8~ eQSug/mL로 양성균보다 음성균에 대하여 보다 강한 살균작용을 나타내었다.
- 3에 나타내었다. 침지시키지 않은 사료 대조구는 초기균수 ZlXirCFU/mL인 것이 12시간 배양 후에는 5.2〉＜l07CFU/mL로 약 5log 정도의 균수가 증가하였으나, 계피 추출물에 침지시킨 사료의 경우는 세균의 증식을 억제하여 배양 12시간 이후에도 거의 균수 변화가 없었다.
- 5 pg/mL 로 계피 추출물보다 다소 강한 항균효과를 나타내었다. 한편, 페 니실린계 (Penicillins) 인 암피실린 (Ampicillin) 및 아목실린 (Amoxyllin) 등은 >100μg/mL로 나타나 계피 에탄올 추출물은 정제하지 않은 것임에도 불구하고 이들 항생제보다는 강한 항균 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다. 그러나 양식장에서 항생제의 사용은 병원균의 약제에 대한 내성과 깊게 관련되므로 모든 경우 동일하게 적용되는 것이 아니기 때문에 실제 양식장에서 질병이 발생할 때마다 매번 감수성 검사를 실시하여야 한다고 권고하고 있다.
- 따라서 이하의 실험에서는 10분간 침지시키는 것으로 하였다. 항균성 물질이 흡수된 사료의 적정 공급량의 기초자료로 활용 하기 위하여 사료 중량별 계피 추출물의 흡수량을 분석한 결과, 관계식 Y=7.2726X+4.5083 (2=0.9998)으로 매우 밀접한 상관관계를 가지고 있었다 (data is not shown). 개체당 사료 중량이 적 을수록 단위 중량당 흡수되는 추출물의 양은 많았으며, 이는 사료 중량이 적을수록 단위 중량당 차지하는 표면적이 크기 때문인 것으로 사료되었다.
후속연구
- 따라서 계피 추출물은 그람양성세균 및 그람음성세균 모두에 대하여 정균작용은 물론 살균작용을 나타내므로 그람양성세균과 그람음성세균이 복합적으로 어류에 감염되어 발병하는 합병증의 치료를 위하여 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 아울러 계피는 항돌연변이원성, 항암효과, 항궤양유발 작용, 계 란의 면역항체 증강효과, 항알러지 효과 및 보체계 활성화 작용 등의 다양한 생리활성 작용을 가지고 있는 것으로 알려져 있어 향후 계피 추출물에 침지시킨 사료의 공급이 어류의 세균성 질병 예방 및 치료와 면역 증강에 미치는 영향 등에 대한 검토가 요구 된다.
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