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문제 정의
- 본 연구에서는 골육종 환자의 골육종조직과 혈청에서 DNase, RNase, 5-nucleotidase, alkaline phosphatase 및 amylase 활성도를 측정하여 그 활성도의 변동을 보았고 이들 효소가 골육종의 표지 자로 이용될 수 있는지 알아보았으며 골육종 조직에서 핵산분해 효소를 분리 정제하여 그 성상을 추구 하였다.
제안 방법
- DNase와 RNase 활성도는 산에 불용인 polynucleotide로부터 산에 용해되는 oligonucleotide로 변하는 양을 자외선 분광측정 방법으로 측정하여 정하였다. Acid DNase 는 pH 5.5(acetate 완충액)에서 기질로서 double stranded(ds) DNA(Worthington Biochemical C o . )를 사용하였고 neutral DNase는 pH 7.5(trisHCl 완충액)에서 ds DNA 를 사용하였으며 a l k aline DNase는 pH 9.2(glycine-KOH 완충액)에서 single stranded(ss) DNA(열변성된 DNA )를 사용 하여 활성도를 측정하였다. RNase 활성도는 polycytidylate(poly C; Sigma Chemical Co.
- 5’-Nucleotidase 활성도는 3 7℃에서 60분간에 무기인 1 μM을 유리하는 활성도를 1 unit 로 표시하였다. Alkaline phosphate 활성도는 pH 8.6(barbiturate 완충액)에서 b e t a - glycerophosp hate로부터 유리되어 나오는 무기인의 양을 측정하여 정하였다2 ). Alkaline phosphatase 활성도는 37℃에서 6 0분간에 무기인 1 μM을 유리하는 활성도를1 unit로 표시하였다.
- DEAE-cellulose column chromatography에 의해서 골육종조직의 acid DNase, neutral RNase, RNase inhibitor와 단백을 분리하였다. DEAE-cellulose(Sigma Chemical Co.
- )을 표준단백으로 사용하였다. DNase와 RNase 활성도는 산에 불용인 polynucleotide로부터 산에 용해되는 oligonucleotide로 변하는 양을 자외선 분광측정 방법으로 측정하여 정하였다. Acid DNase 는 pH 5.
- 2(glycine-KOH 완충액)에서 single stranded(ss) DNA(열변성된 DNA )를 사용 하여 활성도를 측정하였다. RNase 활성도는 polycytidylate(poly C; Sigma Chemical Co.) 또는 RNA(Worthington Biochemical Corp.)를 기질로 사용하여 acid RNase는 pH 6.0에서, neutral RNase는 pH 7.5에서 alkaline RNase는 pH 9.2에서 측정하였다. DNase와 RNase 활성도는 3 7℃에서60분간 산에 용해되는 oligonucleotide 1 μM ( mole ) 를 유리하는 활성도를 1 unit로 표시하였다.
- 골육종의 생화학적 표지자를 알아내기 위하여 골육종 환자의 골육종 조직과 혈청에서 d e o x y r i b o n u c l ease(DNase), ribonuclease(RNase), 5’- n u c l e o t idase, alkaline phosphatase와 amylase 활성도를 측정하여 대조 골조직과 대조 혈청의 것과 비교하였다. 그리고 이중 효소활성도의 상승이 크게 나타난 핵산분해 효소인 acid DNase와 neutral RNase를 골육종조직에서 분리정제하여 이들 효소의 성상을 추구하였다.
- 골육종의 생화학적 표지자를 알아내기 위하여 골육종 환자의 골육종 조직과 혈청에서 d e o x y r i b o n u c l ease(DNase), ribonuclease(RNase), 5’- n u c l e o t idase, alkaline phosphatase와 amylase 활성도를 측정하여 대조 골조직과 대조 혈청의 것과 비교하였다. 그리고 이중 효소활성도의 상승이 크게 나타난 핵산분해 효소인 acid DNase와 neutral RNase를 골육종조직에서 분리정제하여 이들 효소의 성상을 추구하였다.골육종조직의 acid DNase, RNase, 5’- n u c l e o - t i d a s e와 alkaline phosphatase 활성도는 유의하게 상승하였고 골육종의 표지자로서 이들 효소활성도의 양성율도 높게 나타났다.
- 실험재료로 사용한 골육종 환자의 혈청과 종양조직은 한양대학병원에 입원한 골육종 환자 1 2예로부터 얻었으며 종양조직은 수술에 의해 진행암의 중심부에서 절취하였고 이에 대한 대조조직은 동일 환자의 종양 병소로부터 멀리 떨어진 정상 부위에서 채취하였다. 채취한 골조직은 우선 aluminum oxide mort a r와 p e s t l e에 의하여 분말로 마쇄한 후 완충액 (0.01M tris-HC1, pH 7.2)을 가하여 혼합 추출하여 균등액을 만들었고 이를 4℃에서 10,000 r.p.m 으로 15분간 원심분리하여 골조직 추출액(상청액)을얻었으며 이를 핵산과 단백함량 그리고 효소활성도의 측정에 사용하였다.
- 0M NaCl 사이의 용액으로 순차적으로 추출하였다. 추출한 각분액(각 2.0 ml)에서 D N a s e , RNase, RNase ingibitor 활성도와 단백함량을 측정하였다.
대상 데이터
- 실험재료로 사용한 골육종 환자의 혈청과 종양조직은 한양대학병원에 입원한 골육종 환자 1 2예로부터 얻었으며 종양조직은 수술에 의해 진행암의 중심부에서 절취하였고 이에 대한 대조조직은 동일 환자의 종양 병소로부터 멀리 떨어진 정상 부위에서 채취하였다. 채취한 골조직은 우선 aluminum oxide mort a r와 p e s t l e에 의하여 분말로 마쇄한 후 완충액 (0.
데이터처리
- 통계적 방법으로는 Student T-test를 사용하였다.
이론/모형
- RNase inhibitor 활성도는 total RNase 활성도( f r e e RNase 활성도와 inhibitor bound RNase 활성도의합; PHMB 존재하에서 측정한 RNase 활성도)로부터 free RNase 활성도(PHMB 없이 측정한 RNase 활성도)를 빼낸 활성도로 표시하였다1 2 ). 5’- Nucleo - tidase 활성도는 이 효소에 의하여 pH 7.5(tris-HC1완충액)에서 AMP(Sigma Chemical Co.)로부터 유리되어 나오는 무기인의 양을 측정하여 정하였고2 2 ) ,이 무기인의 양은 F i s k e와 SubbaRow방법7)에 의하여 측정하였다. 5’-Nucleotidase 활성도는 3 7℃에서 60분간에 무기인 1 μM을 유리하는 활성도를 1 unit 로 표시하였다.
- DNA 함량은 diphenylamine 반웅방법으로 측정 하였고3),표준 deoxyribonucleotide 로 d A M P ( C a l - biochemical Co.)를 사용하였다. RNA 함량은 orcinol 반응방법에 의해 측정하였고, 표준 ribonucleotide로 AMP(Sigma Chemical Co.
- )를 사용하였다. RNA 함량은 orcinol 반응방법에 의해 측정하였고, 표준 ribonucleotide로 AMP(Sigma Chemical Co.)를 사용하였다. 단백함량은 Lowry 등의 방법으로 측정하였고 Bovine plasma albumin(Armour Pharmaceutical Co.
- )를 사용하였다. 단백함량은 Lowry 등의 방법으로 측정하였고 Bovine plasma albumin(Armour Pharmaceutical Co.)을 표준단백으로 사용하였다. DNase와 RNase 활성도는 산에 불용인 polynucleotide로부터 산에 용해되는 oligonucleotide로 변하는 양을 자외선 분광측정 방법으로 측정하여 정하였다.
성능/효과
- 1, Table 8). 고 찰 골육종 조직에서 DNA, RNA 및 단백함량이 유의하게 상승하였으며 골육종의 표지자로서 이들 핵산과 단백함량의 양성율도 높게 나타났다. 이는 골육종 조직 핵산과 단백함량이 이 육종의 생화학적 지표의 하나로 이용될 수 있음을 시사한다.
- 골육종 조직 DNA, RNA와 단백함량은 유의하게 상승하였고 골육종의 지표로서 이들 핵산과 단백함량의 양성율도 높게 나타났다(50% 이상)(Table 1).
- 분리정제된 acid DNase는 활성화 되었고 single stranded DNA 보다는 double stranded D N A에 높은 활성을 보였다. 골육종 조직에서 분리된 5개의 RNase isozyme 중에서 2개의 i s o z y m e 이 골육종에 특이한 효소로 나타났다. 이는 a c i d D N a s e와 neutral RNase가 골육종의 발생과 억제 과정에 작용하리라는 가능성을 시사한다.
- 골육종 조직의 5’- nucleotidase와 alkaline phosphatase 활성도는 대조 골조직의 것에 비해 유의하게 상승(각 42 %와 45% 상승)하였고 골육종의 표지자로서 이 효소들의 양성율은 50% 이었다(Table 5). 대조 골조직의 amylase 활성도는 아주 낮거나 검출되지 않았고 본 연구의 대상이 된 골육종조직 10예 중 8예에서도 amylase 활성도가 아주 낮거나 검출되지 않았다.
- 골육종 조직의 acid, neutral 및 alkaline RNase 활성도는 대조 골조직의 것에 비해 현저하게 높게 나타났고( 3 . 4배 이상) 골육종의 표지자로서 이들 효소 활성 도의 양성율도 높게 나타났다(67% 이상). 골육종조직에서 이들 3개의 RNase 중에서 neutral RNase 활성 도가 가장 높게 나타났고 대조조직의 것에 비해 활성도의 증가도도 neutral RNase에서 가장 크게 나타났다 (Table 3).
- 골육종 조직의 neutral DNase와 alkaline DNase 활성도는 유의하게 변동되지 않았으나 acid DNase 활성도는 대조 골조직의 것에 비해 현저하게 상승(약3 . 6배 상승) 하였으며 골육종의 표지자로서 이 효소활성도의 양성율이 높게 나타났다(80%)(Table 2).
- 본 연구대상이 된 혈청 효소 중에서 acid DNase 활성도는 혈청에서 검출되지 않았고(연구결과 표시 되지 않음), 혈청 골육종조직 5’- nucleotidase와 alkaline phosphatase 활성도는 골육종 환자의 혈청에서 변동되지 않았다. 골육종 환자의 혈청 n e utral RNase 활성도는 유의하게 상승(76% 상승) 하였고 골육종의 표지자로서 이 효소활성도의 양성율도 높게 나타났다(60%)(Table 7).
- 골육종 환자의 혈청에서 acid DNase 활성은 검출되지 않았고 5’- n u c l e o t i d a s e와 alkaline phosphatase 활성도는 변동되지 않았으며 n e u t r a l RNase 활성도는 유의하게 상승하였고, 골육종의 표지자로서 RNase 활성도의 양성율도 높게 나타났다. 이는 혈청 neutral RNase 활성도의 측정이 골육종의 임상적 표지자의 하나로 이용될 가능성을 보여준다.
- 골육종조직에서 neutral 및 alkaline DNase 활성도는 그 활성도 자체가 아주 낮았고 대조 골조직의 것에 비해 변동되지 않았으나 acid DNase는 그 활성도가 D N a s e중에서 가장 크게 나타났고 대조조직의 것에 비해 유의하게 상승하였으며 골육종의 표지자로서 이 효소활성도의 양성율도 높게 나타났다. 이는 골육종조직의 acid DNase가 생화학적 표지자로 이용될 수 있음을 시사하였으나, 골육종 환자의 혈청에서 D N a s e활성이 검출되지 않았으며 이는 이 효소가 골육종의 임상적 표지자로 이용될 수 없음을 말한다.
- 그리고 대조 골조직에서 분리된 RNase isozyme II와 I I I 는 골육종조직에서 분리되지 않았다. 골육종조직에서 분리된 isozyme 중에서 그 활성도가 크게 나타난 isozyme I과 V는 기질로서 RNA 보다 poly C에 높은 활성을 나타내어 RNA/poly C 활성도비가 낮게 나타났고 이 i s o z y m e과 결합하고 있는 inhibitor 활성도도 크게 나타났다(Fig.1, Table 8). 고 찰 골육종 조직에서 DNA, RNA 및 단백함량이 유의하게 상승하였으며 골육종의 표지자로서 이들 핵산과 단백함량의 양성율도 높게 나타났다.
- 4배 이상) 골육종의 표지자로서 이들 효소 활성 도의 양성율도 높게 나타났다(67% 이상). 골육종조직에서 이들 3개의 RNase 중에서 neutral RNase 활성 도가 가장 높게 나타났고 대조조직의 것에 비해 활성도의 증가도도 neutral RNase에서 가장 크게 나타났다 (Table 3). 골육종조직의 neutral RNase는 기질로서 RNA보다 poly C에 높은 활성을 보이고 RNA / poly C 활성도비는 작게 나타났다(RNA/poly C 활성도비=0.
- 암세포에서 이 효소활성도의 변동과 성상의 변화가 초래된다고 하는데 이는 정상세포가 암세포로 변할 때 세포막의 구조와 그 성분의 변화가 일어나 그 결과 세포막에 결합되어 있는 이 효소의 활성이 변동되고 그 성상의 변화가 나타난다고 하며 이 5’- n u c l e o t i d a s e의 변화를 관찰함으로써 세포막의 변화를 추정할 수 있다고 한다9 ). 골육종조직의 5’-nucleotidase 활성도는 유의하게 상승하였고 이 골육종의 지표로서 이 효소활성 도의 양성율도 높게 나타났으나 혈청 효소활성도는 변동되지 않았다. 이는 이 효소가 골육종의 생화학적 표지자로 유용될 가능성을 보여주었으나 임상적 표지자로는 이용되지 못함을 시사한다.
- Amylase 활성은 연구 대상이 된 1 0례중 2례에서 검출되었고 나머지 8례와 대조 골조직에서는 검출되지 않았다. 골육종조직의 R N a s e중에서 가장 높은 활성을 나타내는 n e u t r a l R N a s e는 기질로서 RNA 보다는 poly C에 높은 활성을 보여 분비성 효소의 성상을 나타내고 이와 복합을 이루고 있는 RNase inhibitor 활성도도 유의하게 증가하였다. 이는 이들 효소의 병용이 골육종의 생화학적 표지자로 이용될 수 있음을 시사한다.
- 10). 골육종조직의 RNase inhibitor 활성도는 그자체가 아주 낮아 inhibitor/RNase 활성도비가 0 .0 4에 불과하였으나 대조 골조직의 것에 비해 높게 나타났 으며 골육종의 표지자로서 RNase inhibitor 활성도의 양성율도 높게 나타났다(75%)(Table 4).
- 그리고 이중 효소활성도의 상승이 크게 나타난 핵산분해 효소인 acid DNase와 neutral RNase를 골육종조직에서 분리정제하여 이들 효소의 성상을 추구하였다.골육종조직의 acid DNase, RNase, 5’- n u c l e o - t i d a s e와 alkaline phosphatase 활성도는 유의하게 상승하였고 골육종의 표지자로서 이들 효소활성도의 양성율도 높게 나타났다. Amylase 활성은 연구 대상이 된 1 0례중 2례에서 검출되었고 나머지 8례와 대조 골조직에서는 검출되지 않았다.
- 골질환 환자의 병변부위 골조직의 alkaline phosphatase 활성도가 변동될 뿐만 아니라 혈청의 이 효소활성도도 변동되며 이것이 골질환의 표지자로 이용된다고 한다. 골육종조직의 alkaline phosphatase 활성도는 유의하게 상승하였고 골육종의 표지자로서 이 효소활성도의 양성율도 높게 나타났다. 이는 골육종조직의 alkaline phosphatase가 이 육종의 생화학적 지표의 하나로 이용될 수 있음을 의미한다.
- 골육종조직에서 이들 3개의 RNase 중에서 neutral RNase 활성 도가 가장 높게 나타났고 대조조직의 것에 비해 활성도의 증가도도 neutral RNase에서 가장 크게 나타났다 (Table 3). 골육종조직의 neutral RNase는 기질로서 RNA보다 poly C에 높은 활성을 보이고 RNA / poly C 활성도비는 작게 나타났다(RNA/poly C 활성도비=0.10). 골육종조직의 RNase inhibitor 활성도는 그자체가 아주 낮아 inhibitor/RNase 활성도비가 0 .
- DEAE-cellulose column chromatography에 의해 골육종 조직의 acid DNase는 단일효소로 분리되 었고 대조 골조직의 것에 비해 크게 나타났다( T a b l e 8). 그리고 골육종 조직에서 분리정제된 acid DNase 는 ds DNA에 높은 활성을 나타내고 ss DNA에 대한 활성은 낮아 ds DNA에 대한 활성도의 2 2 %에 불과하였다. 기질로서 poly C와 R N A에 대한 활성을 나타내고 있지만 이는 acid DNase 정제 preparation에 RNase의 co ntamination에 기인된 것으로 생각된다(Table 9).
- 또하나의 핵산분해 효소인 RNase 활성도가 골육종 환자의 혈청과 육종조직에서 상승하며 골육종의 표지자로서 이 효소활성도의 양성율도 높게 나타났다. 그리고 골육종조직에서 R N a s e와 복합을 이루고 있는 RNase inhibitor 활성도도 유의하게 상승하였다. 이는 골육종조직에서 상승한 R N a s e가 혈류로 유출되어 혈청 RNase 활성도가 상승하였음을 의미하며 이 효소와 이것과 결합하고 있는 RNase inhibitor활성도가 골육종의 생화학적 표지자로 이용될 수 있음을 시사한다.
- 골육종 조직의 5’- nucleotidase와 alkaline phosphatase 활성도는 대조 골조직의 것에 비해 유의하게 상승(각 42 %와 45% 상승)하였고 골육종의 표지자로서 이 효소들의 양성율은 50% 이었다(Table 5). 대조 골조직의 amylase 활성도는 아주 낮거나 검출되지 않았고 본 연구의 대상이 된 골육종조직 10예 중 8예에서도 amylase 활성도가 아주 낮거나 검출되지 않았다. 그러나 골육종조직 2예에서 아주 높은 효소활성을 보였다(Table 6).
- 또하나의 핵산분해 효소인 RNase 활성도가 골육종 환자의 혈청과 육종조직에서 상승하며 골육종의 표지자로서 이 효소활성도의 양성율도 높게 나타났다. 그리고 골육종조직에서 R N a s e와 복합을 이루고 있는 RNase inhibitor 활성도도 유의하게 상승하였다.
- 본 연구대상이 된 혈청 효소 중에서 acid DNase 활성도는 혈청에서 검출되지 않았고(연구결과 표시 되지 않음), 혈청 골육종조직 5’- nucleotidase와 alkaline phosphatase 활성도는 골육종 환자의 혈청에서 변동되지 않았다. 골육종 환자의 혈청 n e utral RNase 활성도는 유의하게 상승(76% 상승) 하였고 골육종의 표지자로서 이 효소활성도의 양성율도 높게 나타났다(60%)(Table 7).
- DEAE-cellulose column chromatography에 의해 골육종조직의 acid DNase는 단일효소로 분리되었고 neutral RNase는 5개의 i s o z y m e으로 분리되었다. 분리정제된 acid DNase는 활성화 되었고 single stranded DNA 보다는 double stranded D N A에 높은 활성을 보였다. 골육종 조직에서 분리된 5개의 RNase isozyme 중에서 2개의 i s o z y m e 이 골육종에 특이한 효소로 나타났다.
- 골육종조직의 acid DNase에 의한 ds DNA 분해산물에 대한 연구에 의하면 이 효소에 의한 DNA 분해산물의 대부분이 o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e 임이 확인되 었다. 이 골육종조직에서 분리정제된 acid DNase가 활성화 되었고 ds DNA에 높은 활성을 나타내며 그 성상이 endonuclease 인 것으로 보아 골육종조직 acid DNase가 골육종의 발생과정에서 중요한 역할을 하리라는 가능성을 나타낸다. 자궁경부암 조직에서 분리된 acid DNase 활성도가 현저히 상승하였고그 성상이 정상 대조조직의 효소의 성상과 다르며 d s DNA 만을 특이하게 절단하고 그 성상이 e n d o n uc l e a s e인 것으로 보아 이 효소가 자궁경부암의 원인으로 알려진 human papilloma virus DNA의 일부를 자궁경부 세포 chromosomal DNA 속으로 융합시켜 자궁경부암 세포화 하는데 중요한 역할을 한다고 시사되었다.
- 이 골육종조직에서 분리정제된 acid DNase가 활성화 되었고 ds DNA에 높은 활성을 나타내며 그 성상이 endonuclease 인 것으로 보아 골육종조직 acid DNase가 골육종의 발생과정에서 중요한 역할을 하리라는 가능성을 나타낸다. 자궁경부암 조직에서 분리된 acid DNase 활성도가 현저히 상승하였고그 성상이 정상 대조조직의 효소의 성상과 다르며 d s DNA 만을 특이하게 절단하고 그 성상이 e n d o n uc l e a s e인 것으로 보아 이 효소가 자궁경부암의 원인으로 알려진 human papilloma virus DNA의 일부를 자궁경부 세포 chromosomal DNA 속으로 융합시켜 자궁경부암 세포화 하는데 중요한 역할을 한다고 시사되었다.
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