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문제 정의
- 활성을 관찰하였다. 따라서 ethylacetate분획을 각종 칼럼크로마토고라피를 실시하여 멜라닌 생성 억제 물질들을 분리하였으며, 각종 spectral data를 바탕으로 각각의 구조를 동정하여 이를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 9 Hz로부터 cis configuration임을 확인하였다.12) Ester 결합 위치는 HMBC를 이용하여, oxymethine proton(H-3' and H4)과 ester 결합의 carbonyl carbon 사이의 3J (C, H) couplingsvalue로 확인하였다.
- 4(30 g) 에서 강한 활성을 확인하였다(1C50=10㎍/ml). Fr.4를 실리카겔 칼럼 크로마토그라피 (300 g, 230-400 mesh, Merck n- hexane:EtOAc-5/lX 실시하여 3개의 성분을 분리하였으며, 이를 EtOAc/n-hexane으로 재결정하여 compound 1(200 mg), compound 11(250 mg), compound 111(400 m* g) 순수하게 얻었으며, spectral(lH and 13C NMR, MS) data(Table Ⅰ, Ⅱ)를 바탕으로 구조를 확인하였다.
- 5715)를 사용하였다. HPLC columne YMC pack-sil column을, mass spectra는 AutoSpec mass spectrometer(Micromass, Manchester, UK)를, NMR spectra는 Bruker DRX-400 를 사용하여 측정하였다. 세포배양을 위해 DMEM(Dulbecc(Ys modified Eagle's medium), FBS (fetal bovine serum), antibiotics와 Tryptsin(2.
- Khellactone 모 핵에 결합된 angeloyl기와 senecioyl기는 기존 문헌의 NMR spectra value와 비교하여 확인하였다11-13)
- 또한, 각 시료들의 멜라닌 생성 저해 효과를 정량화하기 위해 아래와 같은 실험을 수행하였다. 상기에서 얻은 cell pellet들을 각각 phosphate buffered saline용액 에 현탁하여 세 포수를 coulter counter (ZM, Coulter Co.)로 측정하여 1X106 세포 수당 1 N NaOH 용액 1ml을 넣고 세포를 녹인 다음, 490nm에서 흡광도 (A490/106 cells)를 측정하여, 각각의 cell pellet에 존재하는 멜라닌 양을 합성 멜라닌을 사용하여 미리 작성한 표준 직선으로부터 계산하였으며, 시험물질을 처리하지 않은 cell pellet 의 멜라닌 양과 비교하여 각 시험물질이 멜라닌 생성에 미치는 영향을 알아보았다.
- , 개의 세포를 깔아주고 4시간 경과 후, 각 시험물질을 처리한다. 시료처리 3일 후 0.25% Trypsin-EDTA 용액을 처리하여 세포를 수확한 다음, 이를 원심 분리하여 cell pellet을 얻었으며, cell pellet의 색깔을 육안으로 판정하였다. 또한, 각 시료들의 멜라닌 생성 저해 효과를 정량화하기 위해 아래와 같은 실험을 수행하였다.
- 시험물질 조제 - 0.3% DMSt)를 음성대조군으로, 1 mmol (273 gg/ml) arbutirr을 양성태조군으로 사용하였으며, compound Ⅰ, compound Ⅱ, cbmpound Ⅲ의 농도는 모두 0.01 mmol로 조제하였다.
대상 데이터
- HPLC columne YMC pack-sil column을, mass spectra는 AutoSpec mass spectrometer(Micromass, Manchester, UK)를, NMR spectra는 Bruker DRX-400 를 사용하여 측정하였다. 세포배양을 위해 DMEM(Dulbecc(Ys modified Eagle's medium), FBS (fetal bovine serum), antibiotics와 Tryptsin(2.5%)을 Gibco에서 구입하였으며, 그 외 각종 시약은 특급 시약을 사용하였다.
- 시약 및 기기 - 칼럼크로마토그라피는 siUca gel 60(230-400 mesh, Merck)과 Sephadex LH-20(20-100μ, Pharmacia) 을, 박층크로마토그라피용 precoated plate는 silica gel 60F254(Merck Art.5715)를 사용하였다. HPLC columne YMC pack-sil column을, mass spectra는 AutoSpec mass spectrometer(Micromass, Manchester, UK)를, NMR spectra는 Bruker DRX-400 를 사용하여 측정하였다.
- 실험재료 - 본 실험에서 사용된 전 호는 Peucedanum praeruptorum Dunn의 뿌리로 중국 연변에서 구입하여 사용하였다. 감정은 중국 연변의학원 약학부 호일 교수가수가 했으며, 표본은 LG생활건강 화장품연구소에 보관하였다.
성능/효과
- Compound Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ의 구조분석 - Compound Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ는 모두 흰색의 분말로, El-mass spectrum에서 분자이온 피크가 세 물질 모두 m/z 426.47이었으며, molecular composi- tion분석결과 탄소, 수소 및 산소의 비율은 각각 67.59%, 6.15% 및 26.26%였다. 이로부터 compound Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ의 분자식이 C24H26O7임을 확인하였다.
- 기미, 주근깨 등의 색소침착의 치료제를 개발하고자 한방에서 사용되는 200종의 약재들을 대상으로 B16 melanoma assay를 한 결과, 전호추출물이 멜라닌 생성 억제 효과가 우수함을 알 수 있었으며, 이로부터 3종의 khellactone 유도체(3', 4'-diangeloyl-cis-khellactone, 3'-angeloyl-4'-senecioyl- cis-khellactone, 3, , 4'-disenecioyl-cw-khellactone)'l-분리 하였다. 이들 3종의 물질은 B16 melanoma assay를 한 결과, 0.
- <10ug/ml). 따라서, ethylacetate분획을 실리카겔 칼럼크로마토그라피(1000g, 70-230 mesh, Merck, n-hexane: EtOAc=10:l—1:3)하여 5개의 분획(Fr.1-5, each of 2,000ml)으로 나누어 멜라닌생성 억제 효과를 검색한 결과, Fr.4(30 g) 에서 강한 활성을 확인하였다(1C50=10㎍/ml). Fr.
- 2-1). 또한, 육안 판정의 결과를 보다 명확히 하고자 각각의 시료를 처리하여 얻은 cell pellets에서 106 cells을 취하여 각각의 멜라닌양을 측정한 결과, 1 mmol arbutin이 48%의 멜라닌생성을 감소시켰으며 , compound Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ는 모두 0.01 mmol 의 농도에서 각각 47%, 48%, 47%의 멜라닌 생성을 억제하여, 육안 판정의 결과와 유의한 결과를 확인하였다(Fig.2-Ⅱ).
- 멜라닌 생성 억제 효과 평가(B16 mouse melanoma assay) - 각각의 시료를 처리하여 얻은 cell pellets의 색깔을 육안으로 판정한 결과, compound Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ이 0.01 mmol 의 농도로 처리하여 얻은 각각의 cell pellet이 positive control 로 사용된 Immol arbutin의 농도로 처리하여 얻은 cell pellet과 비슷한 색깔을 보였다. 즉, compound Ⅰ,Ⅱ, Ⅲ는 arbutin보다 훨씬 낮은 농도에서도 arbutin과 비슷한 정도로 멜라닌 생성 저해 효과를 보임을 알 수 있었다(Fig.
- 본 실험에서는 피부의 과색소침착에 의한 기미, 주근깨 등의 치료제를 개발하고자 멜라 노마 세포 시험법 (B16 mouse melanoma assay)6)을 이용하여 200여 종의 생약을 대상으로 멜라닌 생성 억제 효능을 검색한 결과, 전 호 추출물이 매우 우수한 활성을 나타냄을 알 수 있었다. 전호는 Peucedanum praeruptorum Dunn의 뿌리로, 예로부터 기침, 천식 및 후두염의 치료제로 사용되어 왔으며,7) 전 호의 주요한 성분으로는 praeruptorins로 명명된 pyranocoumarin과 이들의 glucoside derivative0] 보고되어 있다8,9)
- 이들 3종의 물질은 B16 melanoma assay를 한 결과, 0.01 nmol의 농도에서 1 mmol arbutir과 유사한 정도의 멜라닌 생성 저해 효과를 보임을 확인하였다.
- 전 호를 100% 메탄올로 추출하여 얻은 추출물을 정제수에 현탁한 다음, 극성이 다른 2개의 용매 (ethylacetate and n-butanol)로 순차적으로 분획하여 얻은 용매 분획들에 대해 멜라닌 생성 억제 시험을 한 결과, ethylacetate분획에서 강한 활성을 관찰하였다. 따라서 ethylacetate분획을 각종 칼럼크로마토고라피를 실시하여 멜라닌 생성 억제 물질들을 분리하였으며, 각종 spectral data를 바탕으로 각각의 구조를 동정하여 이를 보고하고자 한다.
- 01 mmol 의 농도로 처리하여 얻은 각각의 cell pellet이 positive control 로 사용된 Immol arbutin의 농도로 처리하여 얻은 cell pellet과 비슷한 색깔을 보였다. 즉, compound Ⅰ,Ⅱ, Ⅲ는 arbutin보다 훨씬 낮은 농도에서도 arbutin과 비슷한 정도로 멜라닌 생성 저해 효과를 보임을 알 수 있었다(Fig. 2-1). 또한, 육안 판정의 결과를 보다 명확히 하고자 각각의 시료를 처리하여 얻은 cell pellets에서 106 cells을 취하여 각각의 멜라닌양을 측정한 결과, 1 mmol arbutin이 48%의 멜라닌생성을 감소시켰으며 , compound Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ는 모두 0.
- 추출 및 분리 - 전 호 2 Kg을 메탄올로 추출하여 수득한 추출물(180 g)을 정제수 5L에 현탁한 다음 ethyl acetate 그리고 n-butanol로 순차적으로 분획하여 얻은 각각의 분획들에 대해 멜라닌 생성저해 효과를 실험한 결과 ethylacetate 분획(95g)이 멜라닌 생성 저해 효과가 있음을 확인하였다(IC50<10ug/ml). 따라서, ethylacetate분획을 실리카겔 칼럼크로마토그라피(1000g, 70-230 mesh, Merck, n-hexane: EtOAc=10:l—1:3)하여 5개의 분획(Fr.
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