사람 섬유아세포에서 전호(Anthriscus sylvestris Hoffmann)추출물이 콜라겐 생합성에 미치는 영향 Effects of Anthriscus sylvestris Hoffmann Extract on the Biosynthesis of Collagen in Human Dermal Fibroblasts원문보기
본 연구에서는 전호추출물의 주름개선에 대한 효능을 측정하기 위하여 인간의 섬유아세포에 전호추출물을 처리하여 총콜라겐과 type I procollagen, MMP-1의 생합성에 미치는 영향을 조사하였다. 전호추출물을 인간 섬유아세포에 처리 시 콜라겐의 생합성은 증가시켰지만, MMP-1의 발현에 대해서는 영향을 미치지 못하였다. 이는 전호추출물이 자외선에 의해 영향을 받는 광노화보다는, 노화에 의해 콜라겐 생합성율이 감소되는 내인성노화에 훨씬 유효함을 시사한다. 전호추출물을 처리시 95% EtOH 추출물의 경우 25%까지 총콜라겐의 생합성을 증가시켰고, EtOAc층은 28%, EtOAc의 E6 소분획의 경우 50% 증가시켰으므로, 콜라겐 생합성에 영향을 미치는 유효성분은 EtOAc층에 대부분 함유되어 있을 것으로 사료되고, 이는 확인되지 않은 미지의 효능 성분이 존재하거나, 다양한 활성 성분들의 상호 작용에 의한 것으로 판단된다. 결론적으로 전호추출물은 콜라겐 생합성을 촉진함으로 내인성노화에 의한 주름생성 및 탄력저하를 개선할 수 있는 천연 유용자원으로 이용할 수 있을 것으로 사료된다.
본 연구에서는 전호추출물의 주름개선에 대한 효능을 측정하기 위하여 인간의 섬유아세포에 전호추출물을 처리하여 총콜라겐과 type I procollagen, MMP-1의 생합성에 미치는 영향을 조사하였다. 전호추출물을 인간 섬유아세포에 처리 시 콜라겐의 생합성은 증가시켰지만, MMP-1의 발현에 대해서는 영향을 미치지 못하였다. 이는 전호추출물이 자외선에 의해 영향을 받는 광노화보다는, 노화에 의해 콜라겐 생합성율이 감소되는 내인성노화에 훨씬 유효함을 시사한다. 전호추출물을 처리시 95% EtOH 추출물의 경우 25%까지 총콜라겐의 생합성을 증가시켰고, EtOAc층은 28%, EtOAc의 E6 소분획의 경우 50% 증가시켰으므로, 콜라겐 생합성에 영향을 미치는 유효성분은 EtOAc층에 대부분 함유되어 있을 것으로 사료되고, 이는 확인되지 않은 미지의 효능 성분이 존재하거나, 다양한 활성 성분들의 상호 작용에 의한 것으로 판단된다. 결론적으로 전호추출물은 콜라겐 생합성을 촉진함으로 내인성노화에 의한 주름생성 및 탄력저하를 개선할 수 있는 천연 유용자원으로 이용할 수 있을 것으로 사료된다.
In this study, we investigated the boosting effects on collagen biosynthesis of $Anthriscus$$sylvestris$ ethanol extract (ASE) in human dermal fibroblasts. To obtain more effective fraction and subfraction for collagen biosynthesis, standard solvent partition and open column c...
In this study, we investigated the boosting effects on collagen biosynthesis of $Anthriscus$$sylvestris$ ethanol extract (ASE) in human dermal fibroblasts. To obtain more effective fraction and subfraction for collagen biosynthesis, standard solvent partition and open column chromatography were performed. The EtOH extract, solvent fractions, and 8 EtOAc subfractions were tested for their collagen synthesis capacity by [$^3H$]Proline-incorporation and ELISA assay. ASE increased 25% of total collagen synthesis and 27% of procollagen biosynthesis. The total collagen biosynthesis was increased by EtOAc fraction and E6 subfraction to 28% and 50% respectively. Type I procollagens were also upregulated by EtOAc fraction and E6 subfraction to 30% and 47%, each. Taken together, our data suggest that potential anti-aging effect of ASE on skin is via increasing collagen biosynthesis and effective subtraction is E6 subfraction of EtOAc fraction.
In this study, we investigated the boosting effects on collagen biosynthesis of $Anthriscus$$sylvestris$ ethanol extract (ASE) in human dermal fibroblasts. To obtain more effective fraction and subfraction for collagen biosynthesis, standard solvent partition and open column chromatography were performed. The EtOH extract, solvent fractions, and 8 EtOAc subfractions were tested for their collagen synthesis capacity by [$^3H$]Proline-incorporation and ELISA assay. ASE increased 25% of total collagen synthesis and 27% of procollagen biosynthesis. The total collagen biosynthesis was increased by EtOAc fraction and E6 subfraction to 28% and 50% respectively. Type I procollagens were also upregulated by EtOAc fraction and E6 subfraction to 30% and 47%, each. Taken together, our data suggest that potential anti-aging effect of ASE on skin is via increasing collagen biosynthesis and effective subtraction is E6 subfraction of EtOAc fraction.
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문제 정의
따라서 본 연구는 전호 추출물의 피부세포에서의 콜라겐 생합성에 미치는 효능을 연구하고, 가장 높은 효능을 보이는 분획을 선정하여 피부노화의 징후인 주름 및 탄력을 개선할 수 있는 천연물 소재로서의 가능성을 파악하기 위하여 수행하였다.
본 연구에서는 전호추출물의 주름개선에 대한 효능을 측정하기 위하여 인간의 섬유아세포에 전호추출물을 처리하여 총콜라겐과 type I procollagen, MMP-1의 생합성에 미치는 영향을 조사하였다. 전호추출물을 인간 섬유아세포에 처리 시 콜라겐의 생합성은 증가시켰지만, MMP-1의 발현에 대해서는 영향을 미치지 못하였다.
제안 방법
, 37℃ 배양기에서 배양하였다. 24시간 후 섬유아세포를 L-[2,3,4,5-3H]-Proline(PerkinElmer, Waltham, MA)과 시료를 함유한 배지로 갈아주고 24시간 동안 더 배양한 후 배지 중에 생합성되어 분비된 콜라겐을 trichloroacetic acid(TCA)로 침전시켜 그 양을 scintillation counter (Pharmacia, Stockholm, Sweden)를 사용해서 측정하였다.
24시간 후에 전호추출물을 1, 10, 100 μg/mL의 농도로 처리하고 72시간 후 MTS assay(Promega, Medison, WI, USA)시약을 사용하여 생존 여부를 520 nm에서 흡광도를 측정하여 아무 처리도 하지 않은 대조군에 대한 비율로 나타내었다.
Phosphate-buffered saline(PBS)로 1회 세척하고, 새로운 PBS를 100 mL 가한 상태에서 자외선조사기(UVA-tec, Grafelfing, Germany)를 사용하여 자외선 A(UVA) 15 J/cm2를 조사하였다. PBS를 제거하고, 시험물질이 포함된 혈청이 없는 배지에서 48시간 더 배양하고, 배지 중에 유리된 MMP-1의 양은 시판되는 MMP-1 expression assay kit(RPN2610, Amershampharmacia, UK)을 사용하여 측정하였으며, 섬유아세포의 총 단백질 양으로 보정하였다.
cells/well의 밀도로 분주하고, 10% FBS를 함유한 DMEM 배지에서 24시간 배양한 후에 혈청이 없는 배지에서 24시간 더 배양하였다. Phosphate-buffered saline(PBS)로 1회 세척하고, 새로운 PBS를 100 mL 가한 상태에서 자외선조사기(UVA-tec, Grafelfing, Germany)를 사용하여 자외선 A(UVA) 15 J/cm2를 조사하였다. PBS를 제거하고, 시험물질이 포함된 혈청이 없는 배지에서 48시간 더 배양하고, 배지 중에 유리된 MMP-1의 양은 시판되는 MMP-1 expression assay kit(RPN2610, Amershampharmacia, UK)을 사용하여 측정하였으며, 섬유아세포의 총 단백질 양으로 보정하였다.
cells/well의 밀도로 분주하고, 10% FBS를 함유한 DMEM 배지에서 24시간 배양한 후에 시험물질이 포함된 혈청이 없는 배지에서 24시간 더 배양하였다. 배지 중에 유리된 procollagen의 양은 procollagen type I C-peptide EIA kit(MK101, Takara, Japan)을 사용하여 측정하였으며, 섬유아세포의 총 단백질 양으로 보정하였다.
섬유아세포에 전호추출물을 1, 10, 100 μg/mL의 농도로 처리하고 72시간 후 MTS 방법으로 세포성장에 미치는 영향을 관찰하였다. 상기 농도에서 전호추출물은 섬유아세포에 대한 증식효능 및 독성을 보이지 않아서, 100 mg/mL 이하의 농도에서 이후 연구를 수행하였다(Fig. 1.).
섬유아세포에 전호추출물을 1, 10, 100 μg/mL의 농도로 처리하고 72시간 후 MTS 방법으로 세포성장에 미치는 영향을 관찰하였다.
) 증가시켜 양성대조군으로 사용한 TGFb에 의한 총콜라겐 생합성량(21%)보다는 통계학적으로 유의성있게 우수하거나 또는 procollagen 생합성량(26%)에서는 동등한 효능을 보여, 유효한 분획임을 확인할 수 있었다. 이후 좀더 유효한 소분획을 얻기 위하여 활성이 우수했던 EtOAc분획을 open column chromatography에 silica gel 을 packing한 후에 n-hexane-EtOAc gradient 시스템(10 : 1 to 100% MeOH)을 사용하여 E1~E8의 8개의 소분획으로 나누어 다시 총콜라겐 양과 type I procollagen의 양을 측정하였다. 10 μg/mL 의 농도로 섬유아세포에 처리시 소분획은 독성을 보이지 않았으며(data not shown), 소분획 중 E6소분획이 총콜라겐에 대하여는 50%(Fig.
전호 500 g을 95% EtOH로 60℃에서 3회 초음파 추출한 후 추출액은 여과지를 이용하여 여과하고, 45℃에서 감압농축하여 95% EtOH 엑기스 88 g을 얻었으며, 이 중 85 g을 500 mL의 증류수에 현탁시키고 계통학적 분획방법에 따라 동량의 n-Hexane, EtOAc, n-BuOH로 각각 3회씩 추출하여 분획한 후 감압농축하여 n-Hexane층 0.8 g, EtOAc층 8.0 g, n-BuOH층 17.8 g, 물층 52.1 g을 획득하였다. 이 중 EtOAc분획 7 g을 open column chromatography에 silica gel을 packing한 후에 n-hexane-EtOAc gradient 시스템 (10:1 to 100% MeOH)을 사용하여 E1~E8의 8개의 소분획으로 구분하였으며, 각각의 소분획은 감압농축하여 실험에 사용하였다.
전호추출물의 배양한 섬유아세포에서 콜라겐 생합성에 미치는 영향을 측정하기 위하여 섬유아세포에 0.1, 1, 10 μg/mL의 농도로 전호추출물을 처리하였다.
전호추출물이 자외선 조사에 의한 MMP- 1 발현 증가를 억제할 수 있는지를 조사하기 위하여 15 J/cm2 세기의 자외선A를 조사한 후 0.1, 1, 10 μg/mL 농도의 전호추출물로 48시간 동안 처리한 후 ELISA법으로 그 발현 양을 측정하였다.
콜라겐 생합성에 우수한 효능을 나타내는 분획을 얻기 위하여 계통학적 분획방법에 따라 얻은 n-Hexane, EtOAc, n-BuOH, 물층(DW)에 대하여 총콜라겐 및 type I procollagen 생합성 양을 측정하였다. 그 결과 10 μg/mL의 농도로 처리하였을 때, 모든 분획에서 섬유아세포에 대한 독성을 나타내지 않았으며(data not shown), EtOAc층이 총콜라겐 양은 28%(Fig.
대상 데이터
본 실험에 사용한 전호(Anthriscus sylvestris Hoffmann)의 뿌리는 서울 경동시장의 약재상에서 구입하였으며, 정확히 동정한 후 표준품은 한국과학기술연구원 강릉분원 식물표본실(표본번호 : KIST-201)에 보관되어 있다.
1 g을 획득하였다. 이 중 EtOAc분획 7 g을 open column chromatography에 silica gel을 packing한 후에 n-hexane-EtOAc gradient 시스템 (10:1 to 100% MeOH)을 사용하여 E1~E8의 8개의 소분획으로 구분하였으며, 각각의 소분획은 감압농축하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
실험 결과는 3회 반복하였으며, 가장 대표적인 실험 결과를 평균 ± 표준편차(mean ± SD)로 나타내었다. 대조군과 실험군사이의 평균값의 차이는 one-way analysis of variance(ANOVA) 방법으로 분석하였으며, 유의성 수준은 *P＜0.05로 표시하였다.
이론/모형
The cells were treated with various concentrations of ASE (1, 10, or 100 μg/mL). The proliferation of fibroblasts was measured using MTS method. Each bar represents mean ± SD of 3 experiments.
성능/효과
10 μg/mL 의 농도로 섬유아세포에 처리시 소분획은 독성을 보이지 않았으며(data not shown), 소분획 중 E6소분획이 총콜라겐에 대하여는 50%(Fig. 4A.), type I procollagen은 47%(Fig. 4B.) 생합성을 증가시켜서, 가장 유효한 소분획임을 확인할 수 있었으며, 이는 양성대조군으로 사용한 TGFb에 비해서도 통계학적으로도 매우 유의성 있게 콜라겐 생합성을 증가시키는 효능을 가지고 있는 소분획임을 확인할 수 있었다.
그 결과 10 μg/mL의 농도로 처리하였을 때, 모든 분획에서 섬유아세포에 대한 독성을 나타내지 않았으며(data not shown), EtOAc층이 총콜라겐 양은 28%(Fig. 3A.), type I procollagen 양은 30%(Fig. 3B.) 증가시켜 양성대조군으로 사용한 TGFb에 의한 총콜라겐 생합성량(21%)보다는 통계학적으로 유의성있게 우수하거나 또는 procollagen 생합성량(26%)에서는 동등한 효능을 보여, 유효한 분획임을 확인할 수 있었다.
그 결과 전호추출물의 농도가 10 μg/mL일 경우 총콜라겐 생합성이 약 25% 증가하여, 양성대조군인 Transforming Growth Factor β(TGFβ; 10 ng/mL) 처리시 20% 증가한 것에 비해 통계학적으로 유의하지는 않았지만 우수함을 알 수 있었다(Fig. 2A.).
1, 1, 10 μg/mL 농도의 전호추출물로 48시간 동안 처리한 후 ELISA법으로 그 발현 양을 측정하였다. 그 결과, 양성 대조군으로 사용한 all-trans Retinoic acid(RA; 1 mM) 처리시에는 MMP-1의 발현양을 약 25% 감소시킴에 비해, 전호추출물을 처리한 군에서는 자외선만 조사한 군과 동일한 결과를 나타내어 MMP-1 발현에는 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다(Fig. 2C).
그리고, type I procollagen 생합성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 전호추출물을 총콜라겐 합성 측정 시와 마찬가지로 섬유아세포에 처리한 후 24시간 후에 ELISA방법으로 조사한 결과 10 μg/mL의 농도로 전호추출물을 처리시 procollagen 생합성이 약 27% 증가하였고, 이는 양성대조군으로 사용한 TGFb 처리시 25% 증가한 것만큼 우수함을 확인할 수 있었다(Fig. 2B).
본 연구에서는 전호추출물의 콜라겐 생합성을 촉진시키는 효능을 확인하였으며, 콜라겐 생합성에 유효한 분획은 EtOAc분획의 6번째 소분획임을 확인하였다. 이전 논문들에서 전호추출물의 항암, 항염증 및 미백의 주성분으로 확인되었던 anthricin을 분리하여 콜라겐 생합성 및 MMP-1 발현에 대한 효능을 측정하였으나, anthricin은 주름개선에 대한 효능을 나타내지는 않았다(data not shown).
실험 결과는 3회 반복하였으며, 가장 대표적인 실험 결과를 평균 ± 표준편차(mean ± SD)로 나타내었다.
이는 전호추출물이 자외선에 의해 영향을 받는 광노화보다는, 노화에 의해 콜라겐 생합성율이 감소되는 내인성노화에 훨씬 유효함을 시사한다. 전호추출물을 처리시 95% EtOH 추출물의 경우 25%까지 총콜라겐의 생합성을 증가시켰고, EtOAc층은 28%, EtOAc의 E6 소분획의 경우 50% 증가시켰으므로, 콜라겐 생합성에 영향을 미치는 유효성분은 EtOAc층에 대부분 함유되어 있을 것으로 사료되고, 이는 확인되지 않은 미지의 효능 성분이 존재하거나, 다양한 활성 성분들의 상호 작용에 의한 것으로 판단된다. 결론적으로 전호추출물은 콜라겐 생합성을 촉진함으로 내인성노화에 의한 주름생성 및 탄력저하를 개선할 수 있는 천연 유용자원으로 이용할 수 있을 것으로 사료된다.
후속연구
전호추출물을 처리시 95% EtOH 추출물의 경우 25%까지 총콜라겐의 생합성을 증가시켰고, EtOAc층은 28%, EtOAc의 E6 소분획의 경우 50% 증가시켰으므로, 콜라겐 생합성에 영향을 미치는 유효성분은 EtOAc층에 대부분 함유되어 있을 것으로 사료되고, 이는 확인되지 않은 미지의 효능 성분이 존재하거나, 다양한 활성 성분들의 상호 작용에 의한 것으로 판단된다. 결론적으로 전호추출물은 콜라겐 생합성을 촉진함으로 내인성노화에 의한 주름생성 및 탄력저하를 개선할 수 있는 천연 유용자원으로 이용할 수 있을 것으로 사료된다.
따라서, 향후 전호추출물의 EtOAc분획의 6번째 소분획을 중심으로 콜라겐 생합성을 증가시키는 유효한 화합물을 분리하여 활성성분을 밝히는 연구를 추진할 계획이다. 그리고, 콜라겐 생합성에 영향을 미치는 활성 성분들을 더욱 상세하게 규명하여 각 성분들 간의 구조와 활성관계를 연구함으로써 전호추출물의 주름 개선 활성 성분에 대한 명확한 규명과 함께 피부의 콜라겐 대사를 촉진시켜 주름을 개선시키는 in vivo 작용기전 연구가 병행된다면, 전호 뿌리는 새로운 주름개선 소재로 개발될 가치가 높은 것으로 사료된다.
그러므로 전호추출물의 콜라겐 생합성에 대한 효과는 다른 효능 성분이 존재하거나, 다양한 활성 성분들의 상호 작용에 의한 것으로 판단된다. 따라서, 향후 전호추출물의 EtOAc분획의 6번째 소분획을 중심으로 콜라겐 생합성을 증가시키는 유효한 화합물을 분리하여 활성성분을 밝히는 연구를 추진할 계획이다. 그리고, 콜라겐 생합성에 영향을 미치는 활성 성분들을 더욱 상세하게 규명하여 각 성분들 간의 구조와 활성관계를 연구함으로써 전호추출물의 주름 개선 활성 성분에 대한 명확한 규명과 함께 피부의 콜라겐 대사를 촉진시켜 주름을 개선시키는 in vivo 작용기전 연구가 병행된다면, 전호 뿌리는 새로운 주름개선 소재로 개발될 가치가 높은 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
전호는 한방에서 무엇에 사용되는가?
전호의 주성분으로는 anthricin, lignin, anthriscinol 등이 있고, 그 밖에 stigmasterol, β-sitosterol, campesterol, stigmasteryl-d-glycoside, fatty acid, glyceride, diterpene 등을 함유하고 있다. 한방에서는 두통, 감기, 백일해 등에 사용되고 있다(Kim, 1988). 전호의 성분 중 anthricin(= deoxypodophyllotoxin)에 대해서는 항암(Yong et al.
피부노화 과정은 무엇에 의해 일어나는가?
피부노화 과정은 일반적으로 내인성 노화(intrinsic aging)와 광노화(photoaging)에 의해 일어난다(Gilchrest, 1989; Ma et al., 2001; Jenkins, 2002).
광노화된 피부의 특징은 무엇인가?
, 2001; Jenkins, 2002). 임상적으로 보면, 자연적으로 노화된 피부는 두께가 얇아지며, 부드럽고, 창백하며, 미세한 주름이 생겨있는 반면, 광노화된 피부는 거칠고, 깊은 주름이 있으며, 기미, 주근깨 등의 색소침착이 주 특징이다(Gilchrest, 1989; Lavker and Kligman, 1988; Jee, 2009; Kim et al., 2010).
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