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문제 정의
- 또한 초봄의 새순은 개 두릅이라 하여 천연식품으로서 맛과 향기가 독특하여 기호도가 높은 산채로 이용되고 있다. 본 실험은 한방 및 민간에서 약용 및 식용으로 사용되고 있는 음나무 내피의 항돌연변이 및 항암 효과를 검색하기 위하여, 음나무 내피 메탄올 추출물 및 그 분획물을 제조하여 직접 및 간접 변이원에 대한 항돌연변이 효과와 함께 암세포 성장 억제 효과를 실험하고자 하였다.
제안 방법
- 본 실험은 돌연변이원성 억제작용을 검토하기 위하여 Ames test에서 양성반응을 나타내며, 물질 그 자체로서 돌연변이를 유발하는 직접 변이원물질로 MNNG와 4NQ0 그리고 대사활성을 필요로 하는 간접 변이원 물질인 B(a)P를 사용하여 각각의 농도에 따른 돌연변이원성 억제효과를 검토하였다.
- 얻었다. 메탄올 추출물을 증류수에 현탁시킨 후 n-hexane, EtOAc, BuOH 순으로 용매분획을 실시하였으며, 3회 반복하였다. 위에서 얻은 각 분획을 감압농축한 결과 핵산 분획, 에칠아세테이트 분회 부탄올 분획 및 물 분획물을 각각 42.
- 0〜7. 2)를, 그리고 293 세포주는 MEM(Minimum Essential Medium, 1 I 당 RPMI Ipack, NaHCQ 2g, Hepes 2g, gentamycin sulfate 0.057g, serum 10%(v/ v), pH 7.0~7.2)를 이용하여 10% fetal bovine serum (Intergen, Purchase, NY) 을 첨가하여 95%, 370 C, 5% CO에 적응시켜 각각 배양(24시간마다 교환) 시켰다.
- 이것을 37 ℃에서 30분간 예비배양하였다. Histidine/biotin이 첨가된 45 ℃의 top agar를 2ml씩 각 tube에 붓고 3초간 vortex하고 minimal glucose agar plate상에 도말하고 평판 고화시켜 37 ℃ 에서 48시간 배양하여 생긴 복귀 돌연변이 (his+ revertant colony)수를 측정하여 돌연변이원성의 유무를 판정하였다.
- 및 B(a)P을 사용하였다. 미리 건열 멸균시킨 glass cap tube 에 엄나무 내피 주줄물 및 분획물을 각각 50μl 첨가한 다음 대사 활성물질이 필요한 경우에는 본 실험실에서 제조한 S~9 mix(MgC12-KCl salts 0.2ml, 0. 2M phosphate buffer, pH 7.4 5ml, 0. IM NADP 0. 4mZ, IM glucose-6-phosphate Q.05ml, Rat liver S-9 fraction ImZ, Sterile distilled water 3.35诚)를 250 以씩 각각 첨가하였다. 여기에 하룻밤 배양된 균주를 100 以씩 주입한 후, 0.
- 4)로 전체량이 700以가 되도록 하였다. 이것을 20분간 preincubation한 다음 histidine/biotin이 첨가된 45 ℃ 의 top agar를 2ml씩 각 tube에 붓고 3초간 vortex하고 minimal glucose agar plate상에 도말하고 평판 고화시켜 37 ℃에서 48시간 배양하여 생긴 복귀 돌연변이(his+ revertant colony)수를 측정하여 돌연변이원성의 유무를 판정하였다. 돌연변이 억제효과의 정도(Inhibition rate) 는아래의 식에 의하였다.
- 실험에 사용된 음나무 내피 추출물 및 분획물과 돌연변이 유발물질의 농도는 예비실험 (Maron & Ames, 1983) (dose reponse 및 독성검사)을 통하여 결정하였다.
- typhimurium 계통 중 TA98은 frame shift형의 병이원성을, TA100은 base-pair substitution 형변이원을 검출하는데 이용되는 균주이다. 각 균주에 대하여 음나무 내피 추출물들이 독성을 나타내지 않는 범위에서 직접 돌연변이원(MNNG, 4NQO)과 간접 돌연변이 원(B(a)D에 대하여 실험을 실시하였다.
- 돌연변이 유발 억제효과를 나타내는 음나무 내피 추출물들의 특성을 자세히 조사하고자 용매의 극성을 이용한 용매 분획을 실시하여 핵산, 에칠아세테이트, 부탄올 그리고 물분획물로 세분화 하였다. 그 결과는 Fig.
- 3). Microsomal enzyme의 대사활성에 의해서만 돌연변이원성을 나타내는 간접변이원으로서 실제로 식품을 통해 흡수될 수 있는 polycyclic aromatic hydrocarbon인 B(a)P를 사용하여 실험을 수행하였다. B(a)P(10 μg/plate)에서 S.
대상 데이터
- 직접 돌연변이원인 4-nitroquinoline-l-oxide(4NQO), N'-methyl-N'-nitro-N-nitrosogu如idine(MNNG)는 Sigma사 (USA)로부터 구입하였고, 간접 돌연변이원인 benzo(a) pyrene(B(a)P) 그리고 기타시약은 일본 和光糸嶙 특급시약을 구입하였다. 이들 변이원 물질은 DMSO(Aldrich chemical Co.
- 본 실험에 이용된 세포주는 페암 세포주인 A 549(lung carcinoma, human), 유방암 세포주인 MCF- 7(breast adenocarcinoma, human), 간암 세포주인 Hep 3B (hepatocellular carcinoma, human), 정상 세포로는 간세포 주인 293(human embryo liver)을 Korea Cell Line Bank (KCLB)로부터 구입하여 실험실에서 배양하면서 사용하였다. A549, MCF-7세포주는 RPMKGibco; Grand Island, NY) Medium 1640 복합배지 (1Z 당 RPMI Ipack, NaHCO3 2g, Hepes 2g, gentamycin sulfate 0.
- 항돌연변이 실험에 사용된 발암물질은 MNNG, 4NQO 및 B(a)P을 사용하였다. 미리 건열 멸균시킨 glass cap tube 에 엄나무 내피 주줄물 및 분획물을 각각 50μl 첨가한 다음 대사 활성물질이 필요한 경우에는 본 실험실에서 제조한 S~9 mix(MgC12-KCl salts 0.
- 구입하였다. 이들 변이원 물질은 DMSO(Aldrich chemical Co., USA)에 녹여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 실험에서 측정된 결과는 실험군당 평균(mean)과 표준편차(SEM)로 나타냈으며, 이들 데이터들은 SAS (Statistical Analysis System) program을 이용하여 분산분석을 한 후 Student's test 와 Duncans multiple range test로서 분석하였다.
이론/모형
- 돌연변이원성 실험에 사용한 Salmonella typhimurium 의 histidine 영양 요구성 변이주는 TA98, TA100의 두 종류를 이용하여 Ames test를 개량한 preincubation Mutagenicity test (Matsushima et al, 1980) 를 이용하였다. 음나무 내피 추출물 및 분획물을 미리 건열 멸균시킨 glass cap tube에 각각 50μl씩 가하고 여기에 미리 TA culture배지 (Difco nutrient broth 0.
- 본 실험에 사용된 Ames 검사법을 위한 균주는 S. typhimurium TA98과 TA100이며, preincubation test 법에 준하였다. S.
성능/효과
- 3%로 가장 높은 억제 효과가 나타났다. 또한, 핵산, 부탄올 분획물에서도 각각 75.53, 72.68%로 높은 억제효과를 보였다. 4NQO(0.
- 15μg/plate)에 대한 S typhymurium TA98 균주에서 시료농도 100μg/plate에서 메탄올 추출물이 79. 29%로 가장 높은 억제효과를 나타냈으며, TA100 균주의 경우에서는 핵산 분획물에서 79.49%로 가장 높은 억제 효과를 나타내었다. 또한, B(a)P(lμg/plate)에서는 TA98, TA100 두 균주에서 모두, 75μg/plate의 시료농도에서 메탄올 추출물이 75.
- 13±3, TA100은 192±8이었다. 각 시료 자체의 돌연변이원성을 실험한 결과, 집락수가 음성 대조군에 비하여 농도 의존성을 나타내지 않으므로 돌연변이원성을 나타내지 않는 것으로 판단되었다.
- 1은 음나무 내피를 먼저 메탄올로 추출한 후, 돌연변이원을 달리하여 Ames mutagenicity test로서 주줄 물의 농도 증가에 따른 돌연변이 유발 억제효과를 실험한 결과이다. 음나무 내피 추출물의 메탄올 추출물은 활성화를 위해 S9 mix를 필요로 하는 B(a) P(10μg/plate)에대해 75昭/plate의 농도까지는 유의적으로 돌연변이 유발 억제 효과를 나타내나 그 이후로는 감소함을 보였으며, 대체적으로 TA98에서 더 강한 돌연변이 억제 효과를 보였다. 활성화를 필요로 하지 않는 직접 돌연변이 원인 MNNG(0.
- 음나무 내피 추출물의 메탄올 추출물은 활성화를 위해 S9 mix를 필요로 하는 B(a) P(10μg/plate)에대해 75昭/plate의 농도까지는 유의적으로 돌연변이 유발 억제 효과를 나타내나 그 이후로는 감소함을 보였으며, 대체적으로 TA98에서 더 강한 돌연변이 억제 효과를 보였다. 활성화를 필요로 하지 않는 직접 돌연변이 원인 MNNG(0.4μg/plate)와 4NQO(0.15μg/plate)에 대해서 추출하였으나 메탄올보다는 낮은 억제효과를 보였다. 그러나 어떠한 분획에서도 낮은 활성을 보이지 않는 것으로 보아 아마도 여러 성분들에 의한 상승효과로 사료된다.
- 결과 Table 1과 같이 나타났다. 폐암 세포주인 A 549에서는 핵산 분획물(1000μg/ml)이 81.54%로 가장 높은 억제효과를 나타내었으며, 간암 세포주인 Hep3B, 유방암 세포주인 MCF-7에서도 핵산 분획물(1000μg/ml)에서 각각 78.57, 81.92%로 가장 높은 억제효과를 보였다. 뿐만 아니라 에칠아세테이트 분획물(78.
- 84%)에서도 우수한 성장 저해효과를 나타냈다. 핵산 및에칠아세테이트 분획물에서 우수한 것으로 보아 수용성 성분보다는 페놀성 저분자 화합물이 암세포 성장 저해 효과를 나타내는 것으로 사료되며 핵산 분획물만이 시료의 농도가 증가함에 따라 억제효과가 증가하는 것으로 나타났을 뿐 다른 시료에서는 암세포의 성장을 저해 및 촉진시키는 현상을 보이기도 했다. 이러한 현상은 한등 (Han et al, 2000)이나 정등(Chung et al, 1997)의 연구 결과에서도 나타나며, 특히 김등(Kim et al, 1999) 의결과에서는 농도가 증가함에 따라 억제효과가 감소하는 현상을 나타내게도 하였다.
- 2);">~4에나타내었다. MNNG(0.4 μg/plate)의 경우 S. typhimurium TA100 균주에서 시료농도 100μg/plate에서 핵산 분획물이 75.53%의 억제효과가 나타냈으며, 부탄올 분획물에서도 72.68%의 억제효과를 보였으나 메탄올 추출물 보다는 효과가 낮았다(Fig. 2). 4NQOC0.
- typhymurium TA98과 TA100 균주 실험 결과는 다음과 같았다. S. typhymurium TA98 균주에서 시료농도 100μg/plate에서는 모든 분획물에서 60% 이상의 억제효과를 나타냈으며, 에칠아세테이트 및 물 분획물에서 74.21, 73.5%의 높은 억제효과를 나타내었지만 이 또한 메탄올 추출물보다는 효과가 낮았다. S.
- 5%의 높은 억제효과를 나타내었지만 이 또한 메탄올 추출물보다는 효과가 낮았다. S. typhymurium TA100 균주의 경우에는 물 분획물을 제외한 모든 분획물에서 70% 이상의 억제효과를 보였다. 특히 핵산 분획물에서 79.
- typhymurium TA100 균주의 경우에는 물 분획물을 제외한 모든 분획물에서 70% 이상의 억제효과를 보였다. 특히 핵산 분획물에서 79.49%로 가장 높은 억제 효과를 나타냈으며, 에칠아세테이트 및 부탄올 분획물도 78.93, 79.34%의 높은 억제효과를 나타내었다(Fig. 3). Microsomal enzyme의 대사활성에 의해서만 돌연변이원성을 나타내는 간접변이원으로서 실제로 식품을 통해 흡수될 수 있는 polycyclic aromatic hydrocarbon인 B(a)P를 사용하여 실험을 수행하였다.
- Microsomal enzyme의 대사활성에 의해서만 돌연변이원성을 나타내는 간접변이원으로서 실제로 식품을 통해 흡수될 수 있는 polycyclic aromatic hydrocarbon인 B(a)P를 사용하여 실험을 수행하였다. B(a)P(10 μg/plate)에서 S. typhymurium TA98 균주에서는 시료 농도 100μg/ plate에서 부탄올 분획물이 74.53%의 억제효과를 나타냈으며, S. typhymurium TA100 균주에서는 시료 농도 75μg/plate에서 핵산 분획물이 68.79%의 억제효과를 보였으나, 메탄올 추출물 보다는 낮은 억제효과를 보였다 (Fig. 4). 또한 이 실험에서는 시료의 농도 증가에 따른 항돌연변이 유발 억제효과가 증가하는 것으로 나타났으나 부분적으로는 억제와 촉진 작용이 나타나기도 하였다.
- 음나무 항돌연변이 효과에서 메탄올 추출물이 항돌연변이 유발 억제효과가 매우 우수하였으므로, 효과가 우수한 부분을 분획하기 위하여 극성이 다른 용매들로에 대한 높은 억제효과에 비해 정상세포에 대해서는 비교적 낮은 독성효과를 나타냄을 알 수 있었다.
- 이상에서 살펴본 것과 같이 음나무 내피 추출물의 항돌연변이 및 암세포 성장 저해효과 실험에서 보면 항돌연변이 실험에서는 메탄올 추출물이 가장 우수하였으며, 다른 분획물에서도 우수하게 나타났다. 암세포 성장 저해실험에서는 핵산 분획물이 가장 우수하였으며 에칠아세테이트 분획물도 우수하였다.
- 분획물에서도 우수하게 나타났다. 암세포 성장 저해실험에서는 핵산 분획물이 가장 우수하였으며 에칠아세테이트 분획물도 우수하였다. 이것으로 보아 핵산에 잘 용해되는 페놀성 성분들의 작용이 더 클것으로 추측되어지나 다른 분획에서도 효과가 있었으므로 여러 성분들의 상승작용으로 사료된다.
- 그 결과 직접 변이원으로 사용된 MNNG(0.4μg/plate) 의 경우 S. typhimurium TA100 균주에서 시료농도 100μg/plate에서 메탄올 추출물이 89.3%로 가장 높은 억제 효과가 나타났다. 또한, 핵산, 부탄올 분획물에서도 각각 75.
- 49%로 가장 높은 억제 효과를 나타내었다. 또한, B(a)P(lμg/plate)에서는 TA98, TA100 두 균주에서 모두, 75μg/plate의 시료농도에서 메탄올 추출물이 75.38, 68.85%로 가장 높은 억제 효과를 보였다.
- 81. 54%로 가장 높은 억제효과를 나타내었으며, 간암 세포주인 Hep3B에서도 핵산 분획물(1000μg/ml)이 78.57%로 가장 높은 억제효과를 나타냈다. 유방암 세포주인 MCF-7에서도 핵산 분획물(1000μg/ml)이 81.
후속연구
- 현재 활성이 높게 나타난 분획물들을 대상으로 화합물을 분리하여 화학적으로 구조해석을 실시 중에 있으며 이러한 결과를 바탕으로 신기능성 식품, 의약품 등의 소재로 활용이 기대된다.
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