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문제 정의
- 이러한 추세에 따라 효능이 우수한 항산화제를 개발하려는 노력이 이루어지고 있으며 효력이 높으나 독성이 문제시되는 BHT, BHA 등의 합성 항산화제 (Choe & Yang, 1982) 에 대한 기피로 천연자원에 대한 관심이 고조되고 있다. 본 연구는 오랜 기간동안 한의학에서 질환 치료의 목적으로 사용되어 왔으며 그 어떤 자원보다 건강 증진, 질병 예방 및 치료의 가능성이 높은 한약재를 대상으로 천연 항산화제를 탐색하기 위한 기초연구를 수행하였으며 그 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 9%의 에탄올에 녹인 2. 51% linoleic acid 200 μl로 구성된 반응액을 만든 후 뚜껑을 닫아 40 P 의 암소에서 반응시키고 이 반응액 100 μl를 취하여 75% ethanol 2, 700 μl와 30%- ammonium thiocyanate 100 μl를 혼합한 다음 3.5% HC1 에 녹인 0.02 M ferrous chloride 100 μI를 가하고 3분 후에 500nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료 대신 시료를 녹이는 데 사용한 DMSO를 사용하였고 결과는 대조군과 실험군의 흡광도의 차를 대조군의 흡광도로 나눈 값을 백분율로 하여 나타내었다.
- 02 M ferrous chloride 100 μI를 가하고 3분 후에 500nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료 대신 시료를 녹이는 데 사용한 DMSO를 사용하였고 결과는 대조군과 실험군의 흡광도의 차를 대조군의 흡광도로 나눈 값을 백분율로 하여 나타내었다.
- 5x10-4 M DPPH 2, 970 μI를 일정농도의 추출물 30 μl와 함께 vortex 하고 3분 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료대신 시료를 녹이는 데 사용한 DMSO를 사용하였으며 결과는 각 농도별로 대조군과 실험군의 흡광도의 차를 대조군의 흡광도로 나눈 값을 백분율로 하여 소거율을 얻고 이를 다시 농도와 소거율의 상관관계에 의해 얻어진 방정식으로부터 50%의 소거율을 나타내는 추출물의 농도 (RG30) 를 산출하였다.
- 시료 중량의 10배에 해당하는 70% 메탄올로 74℃에서 2시간씩 2회 환류냉각하여 모아진 추출액을 여과하고 rotary vacuum evaporator (EYELA, Japan)로 농축한 후 남은 용매 및 수분은 동결건조로 제거하여 추출물을 얻었고 이 추출물을 - 20℃의 냉동고에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 이 혼합물을 95t 에서 15분 동안 가열, 발색시킨 후 얼음 중에서 냉각시킨 것을 600Xg에서 15분 동안 원심분리하고 540 nm에서 분리된 상등액 1 ml에 대한 흡광도를 측정하였다. 한편, TBARS (thiobarbituric acid reactive substance) 검량 선식은 Botsoglou 등의 방법에 따라 tetramethoxypropane을 표준물질로 사용하여 얻었으며 시료의 흡광도를 이 검량 선식에 대입하여 TBARS의 함량을 구하였고 LDL 산화 저해 효과는 대조군의 TOARS 함량과 시료의 TEARS 함량의 차이를 대조군의 TBARS 함량으로 나눈 값을 백분율로 하여 나타내었다.
이론/모형
- Blois의 방법에 따라 조제된 에탄올성 1.5x10-4 M DPPH 2, 970 μI를 일정농도의 추출물 30 μl와 함께 vortex 하고 3분 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료대신 시료를 녹이는 데 사용한 DMSO를 사용하였으며 결과는 각 농도별로 대조군과 실험군의 흡광도의 차를 대조군의 흡광도로 나눈 값을 백분율로 하여 소거율을 얻고 이를 다시 농도와 소거율의 상관관계에 의해 얻어진 방정식으로부터 50%의 소거율을 나타내는 추출물의 농도 (RG30) 를 산출하였다.
- LDL의 산화에 대한 항산화 활성 측정은 Yang 등의 방법에 준해 실험하였다. DMSO에 녹인 시료 50 μI를동량의 LDL (50-100 μg protein), 10 mM phosphate- buff ered saline (PBS) 110 μl 및 0.
- 약용식물 추출물의 생체 막 지질에 대한 산화저해 활성을 Haraguchi 등이 사용한 ferrithiocyanate 법에 준해 다음과 같이 실험하였다. 반응액 중에서 25 μl/ml의 최종 농도가 되도록 조제한 시료 30 μl 0.
성능/효과
- 36, 11. 45, 15.26, 16.15 μG/ML로서 알파-토코페롤의 RC50 (13.52 μg/ml)보다 우수한 유리기 소거 효과를 보였다. 그리고 박하는 30.
- 또한 DPPH에 대해 높은 소거활성을 보였던 가자, 소목, 지유, 복분자, 초두구 등의 LDL 산화에 대한 저해 효과를 실험한 결과 5가지 한약재 모두 알파 토코페롤보다 높은 효력을 나타내었다. 특히 가자는 실험된 42종의 한약재 중에서 DPPH 소거능 (3.
- 본 연구는 천연 항산화제를 찾아내기 위해 42종의 한약재를 대상으로 항산화능을 검색하였으며 그 결과 DPPH에 대해서는 가자, 소목, 지유, 복분자, 초두구 등이 Linoleic Acid 과산화에 대해서는 정향, 양강, 건강, 창이자, 괴화, 마두령, 초두구 등이 높은 항산화력을 나타내었다. 또한 DPPH에 대해 높은 소거활성을 보였던 가자, 소목, 지유, 복분자, 초두구 등의 LDL 산화에 대한 저해 효과를 실험한 결과 5가지 한약재 모두 알파 토코페롤보다 높은 효력을 나타내었다.
- (Esterbauer etal, 1991 ; Crastes etal, 1990). 본 연구에서 실험된 한약재 중에서 특히 가자는 21.55 μg/ml의 낮은 농도에서도 2배 이상의 항산화 효과를 발휘하는 것으로 확인되어 LDL 산화와 밀접한 관련이 있는 동맥경화 (Haberland etal, 1988) 등의 질환 예방이나 치료에 유용한 재료로 개발될 가능성이 매우 높다고 판단된다.
- 또한 DPPH에 대해 높은 소거활성을 보였던 가자, 소목, 지유, 복분자, 초두구 등의 LDL 산화에 대한 저해 효과를 실험한 결과 5가지 한약재 모두 알파 토코페롤보다 높은 효력을 나타내었다. 특히 가자는 실험된 42종의 한약재 중에서 DPPH 소거능 (3.08 μg/ml) 이 가장 높았으며 이 값은 알파-토코페롤의 13.52 μg/ml 보다 4배 이상 높은 수치였고 LDL 산화 억제 효능에 있어서도 21.55 및 43.10 μg/ml의 농도에서 각각 53% 및 73%로서 알파-토코페롤의 21% 및 23%보다 2~3배 이상 높은 수치였다,
- 한약재 추출물의 linoleic acid 과산화 억제 효과를 25 μg/ml의 농도에서 반응 5일째에 측정한 결과 정향 (98.03 %), 양강 (97.99%), 건강 (97.59%), 창이자 (94.24 %), 괴화 (94.21%), 마두령 (92.40%) 그리고 초두구 (91.89%) 등이 90%이상의 높은 수치를 나타내었으며, 이외에도 실험된 18종의 한약재들이 천연 항산화제인 토코페롤 (0%)보다 높은 효과를 가지는 것으로 확인되었다 (Table 2). 이러한 결과는 Choi 등이 보고한 검색 결과에서 정향, 박하, 황백 및 포공영 등이 높은 산화 유도 기간을 나타낸 것 그리고 Saleem 등이 보고한 가자의높은 지질과산화 저해 효능과도 일치되는 결과이다.
- 또한 Kim 등이 보고한 황금의 linoleic acid에 대한 유도기간이 BHA와 동일한 정도인 점도 본 실험에서 황금이 67% 가량의 항산화력을 나타낸 것과는 상이한 결과인 데 이처럼 동일 재료의 연구 결과가 상이한 것은 분석된 지질산화 단계의 차이 때문으로 사료된다. 한편, 한약재 추출물과 토코페롤의 경시적인 항산화 효과를 Fig. 1에 나타낸 바 한약재를 무첨가한 control이 3일째에 그리고 토코페롤이 4일째에 최대흡광도를 나타낸 것과 달리 한약재 추출물의 경우 반응 6일째에도 낮은 흡광도를 보여 linoleic acid로부터의 과산화물 형성이 효과적으로 저해되었음을 알 수 있었다. 이상의 결과로부터 실험된 42종의 한약재 중에서 25종이 생체 막에서 연쇄적으로 진행되는 산화반응을 효과적으로 차단할 뿐만 아니라 지질과산화의 증가와 관련성이 높은 선천성 사구체염과 같은 질환의 완화에 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
후속연구
- 1에 나타낸 바 한약재를 무첨가한 control이 3일째에 그리고 토코페롤이 4일째에 최대흡광도를 나타낸 것과 달리 한약재 추출물의 경우 반응 6일째에도 낮은 흡광도를 보여 linoleic acid로부터의 과산화물 형성이 효과적으로 저해되었음을 알 수 있었다. 이상의 결과로부터 실험된 42종의 한약재 중에서 25종이 생체 막에서 연쇄적으로 진행되는 산화반응을 효과적으로 차단할 뿐만 아니라 지질과산화의 증가와 관련성이 높은 선천성 사구체염과 같은 질환의 완화에 이용될 수 있을 것으로 판단된다. (Halliwell & Gutteridge, 1985 ; Solin etal, 2001).
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