[논문]엄나무 추출물이 3T3-L1 지방세포에서 인슐린 민감성과 인슐린 유사성 작용에 미치는 영향

김호경; 박선민; 고병섭

엄나무 추출물이 3T3-L1 지방세포에서 인슐린 민감성과 인슐린 유사성 작용에 미치는 영향
Insulin Sensitizing and Insulin-like Effects of Water Extracts from Kalopanax pictus NAKAI in 3T3-L1 Adipocyte 원문보기

한국농화학회지 = Journal of the Korean society of Agricultural Chemistry and Biotechnology, v.45 no.1, 2002년, pp.42 - 46

김호경 (한국한의학연구원 검사사업부) , 박선민 (호서대학교 식품영양학과) , 고병섭 (한국한의학연구원 검사사업부)

초록
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국내의 한약재 시장 등에서 당뇨병의 민간요법 약재로 많이 판매되고 있는 엄나무(Kalopanax pictus NAKAI)수피의 열수 추출물에서 인슐린성 물질과 인슐린 민감성 약제로서의 가능성을 탐색하기 위해 3T3-L1 섬유아세포(fibroblast)가 3T3-L1 지방세포(adipocytes)로 분화할 때 미치는 영향과 지방 세포내로의 포도당 섭취(glucose uptake)에 미치는 영향을 조사하였다. 엄나무의 수피를 열수 추출하고 동결건조하여 만든 분말 엑스시료를 증류수에 녹여 각각 $10{\mu}g/ml$ 및 $l{\mu}g/ml로$ 3T3-L1 섬유아세포를 처리한 후, 분화유도 물질만을 첨가한 대조군의 분화 정도를 100%로 정하였을 때 이에 대한 백분율로 환산하여 결정하였다. 분화유도물질이 첨가되지 않은 경우 $1{\mu}g/ml$와 $10{\mu}g/ml$의 농도에서 각각 $115.4{\pm}5.1%(p<0.05)$와 $122.3{\pm}2.1%(p<0.05)$로 유의성있게 분화를 촉진시켰다. 분화유도물질을 첨가하였을 때, $1{\mu}g/ml$에서는 $127.0{\pm}5.3%(p<0.001)$ 분화를 촉진시켰고, $10{\mu}g/ml$에서는 분화에 거의 변화가 없었다. 3T3-L1 지방 세포내로의 포도당 섭취량은 소량의 인슐린(3ng/ml)과 함께 $0{\sim}10%$ 메탄올 분획층(Fr. 1)과 30% 메탄올 분획층(Fr. 3)을 0.3와 $3{\mu}g/ml$ 첨가하였을 때 분획층을 첨가하지 않은 대조군에 비해 모두 $3.3{\pm}0.5$배 증가시켜 인슐린 50ng/ml에서 반응하였을 때와 유사한 섭취 정도를 나타내었다. 엄나무의 수피는 인슐린성 물질을 함유하고 있으며, 추출물을 분획한 Fr. 1과 Fr. 3은 인슐린 저항성을 감소시키는 물질이 함유되어 있어 인슐린 민감성 제재로 개발할 수 있는 가능성을 암시하고 있다.

Abstract ▼ AI-Helper

Effects of the water extract from Kalopanax pictus NAKAI on insulin-like action and glucose uptake in 3T3-L1 cells were investigated. The bark of K. pictus NAKAI was treated with hot water and the extract was freeze-dried. Total extract of K. pictus NAKAI was fractionated into 6 fractions with increasing gradients from 0 to 100% MeOH on Amberlite XDA-4. Treatment of 3T3-L1 fibroblasts with 1 ${\mu}g/ml$ and 10 ${\mu}g/ml$ of K. pictus NAKAI total extracts significantly increased the differentiation of the cells. When co-treated with inducers such a dexamethasone, 1-methyl-3-isobutylxanthine and insulin, the differentiation was increased at 1 ${\mu}g/ml$ of total extract, but not at 10 ${\mu}g/ml$. In 3T3-L1 adipocytes, glucose uptake was increased by 3.3 times with addition of 0.3 and 3 ${\mu}g/ml$ of Fr. 1 (0-10% MeOH) and Fr. 3 (30% MeOH) at 3 ng/ml insulin. In conclusion, K. pictus NAKAI contains such compounds that play a role of insulin-like action and insulin sensitizer.

주제어

AI 본문요약
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제안 방법

배양용기에 있는 지방세포의 수를 세어 12 well plate의 well을 빈 공간없이 완전히 채울 수 있도록 분주하였다. WeU plate에 옮긴 지방세포를 PBS로세 척한 후 1% bovine serum albumin을 함유하고 있는 저농도의 포도당을 함유한 DMEM에서 12시간 이상 지난 후에 HEPES 용액에서 37℃에서 30분 동안 배양한 후 1 μCi/m/의 [¹⁴C]2-deoxyglucose와 1 mM 포도당을 첨가하고 22℃에서 30분 동안 배양하여 포도당의 세포내로의 섭취 정도를 ¹⁴C이 세포 내로 이동한 양으로 측정하였다. 비특이적인 포도당 섭취를 배제하기 위해서 glucose transporter 4(GLUT4)의 작용을 억제하는 cyto B와 함께 배양하였을 때의 포도당 이동량을 빼고 세포 내로 이동한 포도당의 양을 측정하였다.
혈구계산기 (Hemocytometer)로 계산된 5×10³ cells/ml의 세포를 24 well plate의 각 well에 넣고 PBS로 세척한 후 10% FBS을 함유하고 있는 DMEM 배지에서 2일 동안 배양한 후, 새로운 DMEM배지로 갈아주고 열수로 추출한 엄나무 시료를 각각 10μg/ml 및 1 μg/mZ로 첨가하여 5일간 배양하였다. 그리고, 인슐린과의 관계를 알아보기 위해, 분화유도물질인 dexamethasone(DEX, Aldrich) 0.25 M, l-methyl-3-isobutykanthine(MIX, Aldrich) 0.5 mM, insulin(10 μg/ml, Sigma)이 함유된 DMEM 배지에 증류수로 녹인 시료를 각각 10 μg 및 1 μg/mZ로 첨가하여 5일간 배양하였다. 대조군은 분화유도물질만이 함유된 DMEM 배지를 사용하였다.
5 mM, insulin(10 μg/ml)들을 첨가여부에 따라 분화정도를 백분율로 환산하여 측정하였다. 대조군은 분화유도물질만을 첨가한 것을 100%로 하였다. 분화유도물질을 첨가하지 않고 추출물 1 μg/ml와 10 μg/ ml의 농도를 첨가하였을 때 대조군에 비해 각각 115.
대조군으로 인슐린 0 ng/ml(basal), 3 ng/ml, 인슐린 50 ng/mZ을 사용하였다. 모든 실험은 세변 반복하였고, 분리한 물질이 인슐린의 작용에 관계없이 detergent로 작용하여 세포막을 파괴시켜 포도당 섭취를 증가시키는 것을 배제하기 위해서 인슐린이 0 ng/ml에서 분리한 물질과 함께 포도당 섭취를 측정하였을 때 이 값이 기저(basal) 값보다 높은 것은 포도당 섭취를 증가시킨다고 해도 인슐린 민감성 제재로서의 작용이 없는 것으로 간주하였다.
3T3-L1 섬유아세포를 계대배양과 동일한 방법으로 완전히 채워질(confluent 상태)때까지 배양하였다. 배양용기 바닥을 완전히 채운지 2일 후에 유도분화 물질을 넣어 3일 동안 배양한 후 2일에 한번씩 DMEM을 새로 바꾸어 주어 지방세포로 완전히 전환된 10-15일 사이에 포도당 섭취 실험을 하였다. 배양용기에 있는 지방세포의 수를 세어 12 well plate의 well을 빈 공간없이 완전히 채울 수 있도록 분주하였다.
8 g을 만들었다. 분말 엑스시료를 물에 현탁시킨 후 메탄올을 증량시켜 극성을 변화시키면서 Amberlite XAD-4 gel을 중진한 column chromatography를 실시하여 0-10% 메탄올 (Fr 1), 10-30% 메탄올(Fr. 2), 30% 메탄올(Fr 3), 30-50% 메탄올(Fr 4), 60-90% 메탄올(Fr 5) 및 90-100% 메탄올(Fr 6)으로 나누어 분획하여 저온에서 감압농축 후 동결건조하여 사용하였다.
5 N NaOH로 세포를 분해하였다. 분해된 세포를 초산으로 중화시키고 함유된 ¹⁴C의 함량을 베타 counter(Tri-Carb 2100TR, Packard Bioscince, IL)로 측정하였다. 한편, 인슐린 dosage에 따라 3T3-L1 지방세포의 포도당 섭취에 미치는 영향을 조사하기 위해서 인슐린 0, 1, 3, 5, 10, 25, 50, 75ng/m/에서의 포도당 섭취 정도를 측정하였다.
대조군은 분화유도물질만이 함유된 DMEM 배지를 사용하였다. 분화정도의 측정은 Oil-Red-O로 염색하여 측정하였는데, PBS로 2회 세척 후, 10% formalin을 50μl씩 첨가(최종농도 3% formalin)으로 30분간 세포를 고정시키고, 증류수로 3회 반복하여 세척하고, 공기 중에서 건조한 다음 Oil-Red-O로 2시간 동안 염색하였다. 염색후 증류수로 3회 세척하고, 공기 중에서 건조시키고 isopropyl alcohol 100 μl씩 분주하여 1시간 동안 용출시켜 ELISA reader(Spectra 340, Molecular Devices)로 510nm에서 흡광도를 측정하였다.
WeU plate에 옮긴 지방세포를 PBS로세 척한 후 1% bovine serum albumin을 함유하고 있는 저농도의 포도당을 함유한 DMEM에서 12시간 이상 지난 후에 HEPES 용액에서 37℃에서 30분 동안 배양한 후 1 μCi/m/의 [¹⁴C]2-deoxyglucose와 1 mM 포도당을 첨가하고 22℃에서 30분 동안 배양하여 포도당의 세포내로의 섭취 정도를 ¹⁴C이 세포 내로 이동한 양으로 측정하였다. 비특이적인 포도당 섭취를 배제하기 위해서 glucose transporter 4(GLUT4)의 작용을 억제하는 cyto B와 함께 배양하였을 때의 포도당 이동량을 빼고 세포 내로 이동한 포도당의 양을 측정하였다. 세포는 포도당을 함유한 PBS으로 세척하고 0.
엄나무의 각 분획에 인슐린 민감성제재가 함유되어 있는지의 여부를 조사하기 위해서 3T3-LI 지방세포에 인슐린 3 ng/ml와 함께 각 분획을 넣고 1시간 동안 배양한 후에 포도당 섭취 정도를 인슐린 50ng/ml에서의 결과와 비교하였다. 대조군으로 인슐린 0 ng/ml(basal), 3 ng/ml, 인슐린 50 ng/mZ을 사용하였다.
엄나무의 수피 추출물 분획을 DMSO에 100μg/ml로 녹인 후 이것을 PBS에 0.3와 3 μg/ml로 희석시켜 두 가지 농도에서 포도당 섭취를 측정하였다.
엄나무의 수피를 열수추출하고 동결건조하여 만든 분말 엑스시료를 증류수에 녹여 각각 l0μg/ml 및 1μg/ml로 처리하였는데, 분화유도물질인 DEX 0.25 M, MIX 0.5 mM, insulin(10 μg/ml)들을 첨가여부에 따라 분화정도를 백분율로 환산하여 측정하였다. 대조군은 분화유도물질만을 첨가한 것을 100%로 하였다.
분화정도의 측정은 Oil-Red-O로 염색하여 측정하였는데, PBS로 2회 세척 후, 10% formalin을 50μl씩 첨가(최종농도 3% formalin)으로 30분간 세포를 고정시키고, 증류수로 3회 반복하여 세척하고, 공기 중에서 건조한 다음 Oil-Red-O로 2시간 동안 염색하였다. 염색후 증류수로 3회 세척하고, 공기 중에서 건조시키고 isopropyl alcohol 100 μl씩 분주하여 1시간 동안 용출시켜 ELISA reader(Spectra 340, Molecular Devices)로 510nm에서 흡광도를 측정하였다.
3μg/ml에서 포도당 섭취를 현저히 증가시켰다. 이때 분리한 물질이 포도당의 이동을 증가시키는 것이 세포에 detergent로 작용하여 포도당을 세포내로 비특이적으로 이동하는 것인지를 조사하기 위해 인슐린을 첨가하지 않은 상태에서 포도당을 섭취하는 정도를 측정하였는데 그 값이 기저값과 유사하거나 오히려 낮았다. 즉, Fr.
인슐린성 물질과.인슐린 민감성 약제로서의 가능성을 탐색하기 위해 3T3-L1 지방세포 모델을 이용하여 3T3-L1 섬유아세포(fibroblast)가 3T3-L1 지방세포로 분화할 때 미치는 영향과 지방세포로의 포도당 섭취를 살펴보았다.
인슐린성 물질 탐색. 전지빙세포(preadipocyte)인 3T3-L1 세포는 생물학적 특성이 잘 밝혀져 있고, 적절한 조건하에서 배양하면 지방세포로 분화하는 성질을 갖고 있어 지방세포의 대사과정에 있어 지방분해 억제 혹은 합성 연구에 사용하고 있는데 인슐린과 같은 유도물질의 존재 하에서는 효소활성을 급격히 증가시켜 분화를 촉진하는 특성을 이용하여 인슐린성 물질의 존재 여부를 탐색하였다.
분해된 세포를 초산으로 중화시키고 함유된 ¹⁴C의 함량을 베타 counter(Tri-Carb 2100TR, Packard Bioscince, IL)로 측정하였다. 한편, 인슐린 dosage에 따라 3T3-L1 지방세포의 포도당 섭취에 미치는 영향을 조사하기 위해서 인슐린 0, 1, 3, 5, 10, 25, 50, 75ng/m/에서의 포도당 섭취 정도를 측정하였다.
인슐린성 물질 탐색 실험. 혈구계산기 (Hemocytometer)로 계산된 5×10³ cells/ml의 세포를 24 well plate의 각 well에 넣고 PBS로 세척한 후 10% FBS을 함유하고 있는 DMEM 배지에서 2일 동안 배양한 후, 새로운 DMEM배지로 갈아주고 열수로 추출한 엄나무 시료를 각각 10μg/ml 및 1 μg/mZ로 첨가하여 5일간 배양하였다. 그리고, 인슐린과의 관계를 알아보기 위해, 분화유도물질인 dexamethasone(DEX, Aldrich) 0.

대상 데이터

대조군으로 인슐린 0 ng/ml(basal), 3 ng/ml, 인슐린 50 ng/mZ을 사용하였다. 모든 실험은 세변 반복하였고, 분리한 물질이 인슐린의 작용에 관계없이 detergent로 작용하여 세포막을 파괴시켜 포도당 섭취를 증가시키는 것을 배제하기 위해서 인슐린이 0 ng/ml에서 분리한 물질과 함께 포도당 섭취를 측정하였을 때 이 값이 기저(basal) 값보다 높은 것은 포도당 섭취를 증가시킨다고 해도 인슐린 민감성 제재로서의 작용이 없는 것으로 간주하였다.
5 mM, insulin(10 μg/ml, Sigma)이 함유된 DMEM 배지에 증류수로 녹인 시료를 각각 10 μg 및 1 μg/mZ로 첨가하여 5일간 배양하였다. 대조군은 분화유도물질만이 함유된 DMEM 배지를 사용하였다. 분화정도의 측정은 Oil-Red-O로 염색하여 측정하였는데, PBS로 2회 세척 후, 10% formalin을 50μl씩 첨가(최종농도 3% formalin)으로 30분간 세포를 고정시키고, 증류수로 3회 반복하여 세척하고, 공기 중에서 건조한 다음 Oil-Red-O로 2시간 동안 염색하였다.
한약재료. 본 실험에 사용한 엄나무(Kakpawax pictus NAKAI)의 수피는 서울 경동시장에서 구입하여 한국한의학연구원에서 보관하고 있는 표본과 비교하여 엄격하게 선정한 후, 우석대학교 본초학교실의 주영승교수가 감정한 것을 사용하였고, 일련 번호를 붙이고 한국한의학연구원 표본실에 보관하고 있다.
본 연구에서는 국내의 한약재 시장 등에서 당뇨병의 민간요법 약재로 많이 팔고 있는 엄나무(KaZoponac pictus Nakai)에서 인슐린성 물질과.인슐린 민감성 약제로서의 가능성을 탐색하기 위해 3T3-L1 지방세포 모델을 이용하여 3T3-L1 섬유아세포(fibroblast)가 3T3-L1 지방세포로 분화할 때 미치는 영향과 지방세포로의 포도당 섭취를 살펴보았다.
균주 및 배지. 실험에 사용한 3T3-L1 세포는 한국세포주은행에서 구입하였고 10% fetal bovine serum(FBS), gentamycine(100 units/ml), streptomycin(100 μg/ml) 등을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)에서 배양하였다. 3T3-L1 섬유아세포는 배양 3일 간격으로 배양세포 표면을 phosphate buffered saline(PBS, Sigma) 용액으로 씻어준 후 50 ml flask당 1 ml의 0.

데이터처리

처리. 세포의 분화능에 미치는 검액의 효과는 대조군의 흡광도에 대한 실험군의 흡광도를 백분율로 환산하여 산정하고, 통계처리는 이항검정 p-value로 처리하였다. 대조군에 대한 p-value는 0.
001(***)로 유의성을 판정하였다. 엄나무 분획을 첨가하였을 때 포도당 섭취가 증가하는 정도는 인슐린 3 ng/ml만을 넣고 측정한 값과 인슐린 3 ng/ml와 엄나무 분획을 함께 넣고 측정한 값을 two sample t-test로 통계적 유의성을 검증하였다. 모든 통계 처리의 유의성 검증은 α = 0.

성능/효과

3T3-L1 섬유아세포는 DMEM/FBS 배지로 통상적인 조건인 37℃의 5% CO₂ 항온기에서 배양되면 doubling time은 20-30 시간 걸린다고 알려지고 있으나, 본 실험에 사용한 3T3-L1 섬유아세포의 표준증식을 조사한 결과 doubling time은 16.7시간이었으며 포화밀도 (saturation density)는 5×10⁴ cells/crrF로 측정되어, 3T3-L1 섬유아세포의 일반적인 증식특성을 보유하고 있는 것으로 확인되었다.
1과 Fr. 3의 첨가가 비특이적으로 포도당을 지방세포로의 이동을 증가시키는 것은 아니라는 것을 확인하였다. 한편 Fr.
. 인슐린 0, 1, 3, 5, 10, 25, 50, 75 ng/ml에서의 포도당 섭취 정도를 측정하였을 때 인슐린 농도가 25 ng/ml까지는 인슐린 농도가 증가함에 따라 포도당 섭취가 증가하였고, 25 ng/ml보다 높은 인슐린 농도에서는 세포내로의 포도당 섭취가 인슐린 농도에 따른 차이가 없었다(Fig. 2). 인슐린 dosage response에서 포도당 섭취는 인슐린이 없는 기저값에 비해 인슐린이 1, 3, 5, 10, 25로 증가하였을 때 포도당 섭취는 각각 1.
2). 인슐린 dosage response에서 포도당 섭취는 인슐린이 없는 기저값에 비해 인슐린이 1, 3, 5, 10, 25로 증가하였을 때 포도당 섭취는 각각 1.3, 2.4, 4.6, 8.2, 8.8 배로 증가하였으나, 인슐린이 50과 75 ng/mZ에서는 25 ng/m/와 통계적으로 차이가 없는 8.8배로 증가가 일정하였다.

후속연구

2);">100μg/ml와 1μg/ml를 처리하였지만 분화에 영향을 미치지 않았다. 이 결과는 3T3-L1 전지방세포의 분화를 촉진시키는 유도물질의 작용점에서 3T3-L1 전지방세포가 인슐린에 더욱 민감하게 작용하여 세포분화와 함께 세포막의 인슐린 수용체가 증가되는 과정에서 검액이 유도물질 사이에 상호작용을 하여 일정 농도이상에서는 분화에 영향을 주지 않는다고 추측되며 추후 더 연구검토되어야 할 것이다. 그러나, 유도물질이 첨가되지 않았을 때 혹은 첨가되어 있더라도 검액의 농도가 저농도에서 3T3-L1 전 지방세포의 분화를 촉진시킨 것은 인슐린성 물질이 함유되어 있음을 시사하는 것이다.
3은 인슐린 저항성을 감소시키는 물질이 함유되어 있어 인슐린 민감성 제재로 개발 가능성을 암시하였다. 한편 이들 생리활성 물질에 대한 분리 · 정제 및 구조 결정의 연구를 금후 계속할 계획이다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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