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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 예로부터 폐결핵, 구충, 복통, 통경, 변비, 어혈과 여인경맥 불통에 효과가 있는 것으로 알려져 약용 및 식용으로 사용되고 있는 옻나무 박피를 메탄올로 추출하여분획하고 생리활성이 우수한 분획층에서 분리, 정제한 물질의 생리활성을 검색하고자 한다.
제안 방법
- 사용하였다. MTT 분석 방법은 MTT를 각 well에 넣은 후 4시간동안 배양을 하고 그 과정에서 생성되는 formazane을 DMSO를 이용하여 용해시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540nm에서 각 well의 흡광도를 측정하였다. Crystal violet 염색법은 생존하는 세포를 0.
- Xanthine oxidase 저해 활성 및 저해 형태 측정: Xanthine oxidase 저해 활성 측정은 Beyer와 Fridovich의 방법20)을 변형하여 측정하였다. 1ml cuvette에 0.
- 항산화 효과는 대조군에 대한 50% 흡광도의 감소를 나타내는 검체의 농도(SC50)로 표시하였다. 각 시료를 3회 반복 실시하여 평균하였다.
- 기질인 xanthine의 농도를 변화시키면서 두 농도의 에틸 아세테이트 분획을 첨가하여 위의 방법으로 활성을 측정하여 저해 형태를 결정하였다.
- 대조구로는 분리물질 대신에 증류수를 첨가하여 동일한 방법으로 실험하였으며, 아질산염 분해작용은 시료를 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우의 아질산염 백분율로 나타내었다.
- 9 ml에 용해] 10㎕ 가하고 혼합한 후 UV/VIS spectrophotometer를 사용하여 295 nm에서 3분간 흡광도의 변화량을 측정하였다. 대조군으로는 분리물질 용액 대신에 완충액을 첨가하여 사용하였다.
- 변형하여 측정하였다. 메탄올을 이용하여 분리물질 용액을 농도별로 조제한 후 희석한 용액 4ml와 메탄올로서 1.5×10-4 M의 농도가 되도록 한 DPPH 용액 1ml씩을 가하고 진탕기를 이용하여 균일하게 혼합한 다음 실온에서 20분간 방치시킨 후 UV/VIS spectrophotometer(LKB Novaspec Ⅱ, Sweden)를 이용하여 520 nm에서의 흡광도 치를 측정하였다. 농도는 100, 50, 25, 12.
- 본 실험에서는 옻나무를 메탄올 추출하여 추출물을 극성에 따른 용매 분획을 실시하여 분리된 분획의 생리활성검증을 한 후 그 결과 생리활성이 우수하였던 에틸 아세테이트 분획에서 생리활성 물질을 분리하기 위해 RLCCC와 LH-20 column chromatography와 HPLC를 병행하여 RLCCC만으로 단일 물질을 분리하여 화합물 1을 얻었다. 또한 LH-20 column chromatography# 이용하여 화합물 2와 3을 분리하였다.
- 수소공여능 측정 (DPPH assay): 수소공여 능 측정은 1, 1- diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH) 를 사용하여 Yoshida 등의 방법18)을 변형하여 측정하였다. 메탄올을 이용하여 분리물질 용액을 농도별로 조제한 후 희석한 용액 4ml와 메탄올로서 1.
- 아질산염 소거눙 측정: 아질산염 소거능 측정은 Kato와 Lee 등의 방법21)을 변형시켜서 측정하였다. 1mM NaNO2 용액 2ml에 분리물질 (1,000, 500, 250 및 125㎍/ml 증류수) 용액을 1 ml씩 가하고, 0.
- 3일 후 여과를 하여 여액을 30℃ 이하의 온도에서 감압 농축하여 메탄올 추출물을 얻었다. 이 물질을 극성에 의해 용매 분획하고 간단한 생리활성을 통해 가장 활성이 우수하였던 에틸아세테이트 분획을 연속용매 추출 장치 (rotatory locular counter current chromatography, RLCCC) 와 Sephadex LH-20 column chromatography에 의해 화합물 1, 2 및 3을 얻었다(Fig. 1).
- 또한 LH-20 column chromatography# 이용하여 화합물 2와 3을 분리하였다. 이렇게 분리된 물질들은 NMR, IR, UV 및 GC-MS를 이용하여 그 구조를 확인한 결과 화합물 1, 화합물 2와 화합물 3을 확인하였으며 분리한 화합물의 생리활성을 측정하였다.
대상 데이터
- 재료 본 연구에 사용한 옻나무vemiciflua S.)는 서울 경동시장에서 구입하여 정확히 감정한 것을 껍질만을 분리하여 음지에서 건조시킨 후 세절하여 사용하였다.
- DMSO에 용해시켜 정밀 여과를 실시하여 멸균한 분리물질의 농도가 well 당 200㎍/ml가 되도록 한 후 단계적으로 희석하였다. 각 농도별 시료에 노출된 암세포주를 A549, K562와 SK-OV-3는 48시간, Colo205는 72시간 동안 배양하였다.
이론/모형
- 2. AntiOxidative activities of the compound isolated from Rhus vemiciflua STOKES on the autooxidation of linoleic acid by ferric thiocyanate method (■: Control; ▲: BHT; ◊: BHA; O: EA fraction; □: Compound 1; ♦: Compound 2; .: Compound 3).
- 05% crystal violet으로 염색한 후 증류수로 세척하고 건조한 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. IC50 값은(50% 억제 농도) linear regression 방법을 이용하여 계산하였다.
- 과산화지질 형성 억제능 측정: 과산화지질 형성 억제능 측정은 linoleic acid를 자동산화 모델로 하여 측정하였다. 시험액 조제는 20 ml 유리병에 linoleic acid 용액 (linoleic acid 2.
- 세포 생존율 측정은 MTT 분석 방법과 crystal violet 염색법을 사용하였다. MTT 분석 방법은 MTT를 각 well에 넣은 후 4시간동안 배양을 하고 그 과정에서 생성되는 formazane을 DMSO를 이용하여 용해시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540nm에서 각 well의 흡광도를 측정하였다.
- 세포독성 검사: 세포독성 검사는 3-(4, 5-dimethylthiazol-2- yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) 분석 방법22)으로 측정하였다. 즉, 암세포주(A549: Human lung carcinoma cell, Colo205: human colon cancer cell, K562: human leukemic cell, SK-OV-3: human ovarian cancer cell) 를 96 wells plate 에서 그 농도가 104 cells/well이 되도록 희석시킨 후 24시간 동안 배양시킨다.
- 25 ml를 넣고, 에탄올에 각각 10mg/ml 농도로 희석한 분리물질을 30㎕씩 첨가하였다. 이 시험액을 38~40℃의 차광시킨 배양기에서 자동산화를 진행시키면서 매일 ferric thiocyante 방법19)을 이용하여 생성되는 과산화물의 양을 측정하였으며, 대조군으로는 반응액의 분리물질 대신에 에탄올을 첨가하였다. 시험관에 배양된 시험액 50㎕와 75% 에탄올 4.
성능/효과
- 3에 나타내었다. IC50 값이 화합물 1이 15.9 ㎍/ml, 화합물 2가 9.96p㎍/ml이었고 화합물 3 이 62.71 ㎍/ml이었으며, 이 결과는 에틸 아세테이트 분획 (16.35 ㎍/ml)과 비교하여 화합물 1과 화합물 2는 활성이 우수하였지만 화합물 3은 활성이 현저히 떨어짐을 알 수 있었다.
- 이들의 수소공여능에 대한 결과는 Table 1과 같다. SC50 값은 화합물 l(l, 2, 3-trihydroxy-bezeiie)이 0.54 ㎍/ml, 화합물 2(methyl 3, 4, 5-trihydroxybenzoate)가 0.44㎍/ml이고 화합물 3(3, 4, 5-trihydroxybenzoic acid)이 0.69㎍/ml로 대조군으로 사용된 합성 항산화제인 BHA(5.06㎍/ml)와 BHT(7.05 ㎍/ml) 보다월등히 우수한 결과를 나타내었고, 천연 항산화제인 quercetin (1.05 ㎍/ml 보다도 더 좋은 활성을 갖는 것이 확인되었다.
- Xanthine oxidase 억제 활성 실험결과 화합물 1과 화합물 2 는 활성이 매우 우수하였지만 화합물 3은 활성이 현저히 떨어짐을 알 수 있었다. 이 결과는 탄닌류 및 페놀성 물질들이 xanthine oxidase의 저해한다는 것이 lio 등23) 정 등24), Hatano 등이25) 보고한 내용과 일치함을 확인 할 수 있었으며 , 통풍치료에 옻나무의 사용 가능성을 제시하였다.
- 분리물질의 과산화지질 형성 억제능. 과산화지질 형성 억제능 측정의 결과는 Fig. 2에 나타내었으며 화합물 1과 화합물 3 은 시료를 넣지 않은 대조군과 비교하여 낮은 억제 효과를 나타내었지만, 화합물 2는 합성 항산화제인 BHA나 BHM와 비교하여 우수한 효과를 확인하였다.
- 0에서도 높은 활성을 나타냄을 확인 하였다. 반면에 pH 6.0에서는 40% 미만의 낮은 활성을 나타내었으며 이 점으로 보아 화합물 1, 2 및 3은 pH 낮을수록 아질산염의 분해능은 높게 나타남을 확인하였다.
- 분리물질의 세포독성 검사. 분리된 물질의 세포독성실험 결과는 Table 2와 같았으며 화합물 1과 화합물 2에서 그 활성이다소 발견됨을 확인하였다. 화합물 1의 경우 human lung carcinoma cell(A549), human leukemic cancer cell(K562) 과 human ovarian cancer cell(SK-OV-3)에서 그 효과가 나타났으며, 화합물 2의 경우는 human lung carcinoma cell(A549) 과 human ovarian cancer cell(SK-OV3)에서 그 효과가 나타남을 확인하였으나 화합물 3의 경우는 그 효과가 미비함을 확인하였다.
- 생리활성 측정 결과 수소공여능 활성은 화합물 1, 2와 3 모두 합성 항산화제인 BHA와 BHH보다 월등히 높은 활성을 나타내었고 과산화지질 형성 억제능'측정 결과는 화합물 1과 3 은 거의 활성이 없었지만 화합물 2는 합성 황산화제인 BHA와 BHT 등과 유사한 활성을 갖는 것을 확인하였으며, 이 결과는 옻나무 중에 수소공여능을 나타내는 물질이 많이 포함되어 있으므로 지질과산화 반응으로 생성된 활성 라디칼에 전자를 공여하여 옻나무가 첨가된 식품 중에서 지질산화를 억제시킬 수 있으며 인체에서도 활성 라디칼에 의한 과산화 지질생성을 억제시키는 작용을 할 것으로 기대하였다.
- 실험 결과 100 ug/ml 농도의 분리 화합물은 pH 1.2에서 모두 80% 이상의 소거 활성을 나타내었으며, pH 3.0에서도 높은 활성을 나타냄을 확인 하였다. 반면에 pH 6.
- 아질산염 소거활성 결과는 화합물 1, 2 및 3 모두 pH 1.2- 3.0에서 우수한 소거 활성을 갖는 것을 확인 할 수 있었다. 이 결과는 아질산염이 Clostridium botulinum의 생육과 독소의 생성을 억제하고 육질의 발색을 양호하게 하는 등 식품 가공이나 저장에 널리 이용되지만 일정 농도 이상 섭취 시에 각종 중독을 일으키고 발암성 물질인 nitrosamine의 전구물질임을 고려할 때 이 아질산염의 분해작용은 필요하며 옻나무는 이의 분해에 유용한 자원으로 생체 내에서도 충분한 해독작용이 있을 것으로 기대하였다.
- 분리된 물질의 세포독성실험 결과는 Table 2와 같았으며 화합물 1과 화합물 2에서 그 활성이다소 발견됨을 확인하였다. 화합물 1의 경우 human lung carcinoma cell(A549), human leukemic cancer cell(K562) 과 human ovarian cancer cell(SK-OV-3)에서 그 효과가 나타났으며, 화합물 2의 경우는 human lung carcinoma cell(A549) 과 human ovarian cancer cell(SK-OV3)에서 그 효과가 나타남을 확인하였으나 화합물 3의 경우는 그 효과가 미비함을 확인하였다.
후속연구
- 세포독성 실험 결과는 화합물 1과 2의 경우 human lung carcinoma cell(A549), human leukemic cancer cell(K562) 과 human ovarian cancer cell(SK-OV-3) 등에서 그 효과가 있음을 확인할 수 있었지만 항암제로서의 가능성을 제시할 만한 수치는 되지 못했다.
- 0에서 우수한 소거 활성을 갖는 것을 확인 할 수 있었다. 이 결과는 아질산염이 Clostridium botulinum의 생육과 독소의 생성을 억제하고 육질의 발색을 양호하게 하는 등 식품 가공이나 저장에 널리 이용되지만 일정 농도 이상 섭취 시에 각종 중독을 일으키고 발암성 물질인 nitrosamine의 전구물질임을 고려할 때 이 아질산염의 분해작용은 필요하며 옻나무는 이의 분해에 유용한 자원으로 생체 내에서도 충분한 해독작용이 있을 것으로 기대하였다.
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