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문제 정의
- , PG) 의추출물을 일정량 첨가함으로서 두 식재료의 조합이 가지는 항 발암 상승효과를 함께 측정 하였다. 즉, 50% 암세포 성장을 억 제 시 키는(ICg) 도라지 의 butanol 분획 물 일정량을 돌나물의 각 분획물에 첨가함으로서 도라지 butanol 첨가에 의한 돌나물의 각 분획별 항발암 상승효과를 함께 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었으므로 이에 보고하는 바이디-.
- 본 연구는 다른 산채류에 비 해 칼슘이 특히 많은 우수한 식품으로 엣부터 물김치나 겉절이 무침, 돌나물 김치로 많이 이용되 어 온 돌나물의 암세포 증식 억 제 및 암예방 효과를 검색 하고 나아가 도라지 추출물과의 암세포 증식 억 제 상승효과를 보기 위하여 실시하였다. 돌나물의 암세포 증식 억제 효과를MTT assay로실험한 결과, 3종의 암세포주(HepG2, HeLa, MCF-7) 모두 돌나물의 ethylether 분획층(SSMEE)에서 아주 높은 암세포 증식 억 제 효과를 보였으며, ethylacetate 분획 층(SSMEA)에서도 유의적인 암세포 증식억제 효과를 나타내 었다.
제안 방법
- 민간요법에서는 잎의 즙을 곪은 상처에 붙이거나 식욕증진, 볼걸이 등에 사용하였고, 최근에는 항암 작용이 있다고 알려져 간암의 치료제로 이용되고 있다(20). 본 연구에서는 돌나물을 각 용매별로 분획 하여 각각 인체 암 세포주 HepG2, Hela 및 MCF-7에 첨 가함으로써 시료의 농도별 암세포 증식 억 제 효과와 암예 방 QR 유도 활성 등 생리 활성 물질의 영 향을 밝혀내었다. 또한, 일상 식 생활에서 돌나물의 조리 시와 같이 초고추장 등 유사 부재료를 사용하여 음식으로 섭 취 하는 도라지 (.
- 본 연구에서는 돌나물을 각 용매별로 분획 하여 각각 인체 암 세포주 HepG2, Hela 및 MCF-7에 첨 가함으로써 시료의 농도별 암세포 증식 억 제 효과와 암예 방 QR 유도 활성 등 생리 활성 물질의 영 향을 밝혀내었다. 또한, 일상 식 생활에서 돌나물의 조리 시와 같이 초고추장 등 유사 부재료를 사용하여 음식으로 섭 취 하는 도라지 (.Platycodon grandiflorum A., PG) 의추출물을 일정량 첨가함으로서 두 식재료의 조합이 가지는 항 발암 상승효과를 함께 측정 하였다. 즉, 50% 암세포 성장을 억 제 시 키는(ICg) 도라지 의 butanol 분획 물 일정량을 돌나물의 각 분획물에 첨가함으로서 도라지 butanol 첨가에 의한 돌나물의 각 분획별 항발암 상승효과를 함께 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었으므로 이에 보고하는 바이디-.
- 이 시료를 추출 . 분획하여 각 암세포주에 대한 암세포증식 억 제 효과(cytotoxicity)와 quinone reductase(QR) 유도 활성 물질 검색에 사용하였다.
- 시료로 사용된 돌나물(SS)은 건조 후 분말화하여 메탄을을 첨 가흐]: 후 37°C에 서 진탕한 후 4시 간 동안 3회 반복 추출하고 회 전식 진공 농축기 로 감압 농축시 킨 후 동결 건조하여 돌나물의 methanol 추출물(SSM)을 얻고, 이 추출물을 각 용매 별로 분획 하여 hexane층(S$MH), ethylether층(SSMEE), ethylacetate층(SSMEA), butanol층(SSMB) 및 수층분획 물 (SSMA)로 각각 분획 하고 각 층을 감압 농축 후 동결 건조하여 분말로 만들어 시료로 사용하였다. 첨가시료인 도라지의 butanol 분획 물(PGMB)도 위 와 같은 조작으로 제조하여 사용하였다.
- 원리를 이용한다. 이를 위 해 각 세포주를 1 X 105 cells/ well의 농도로 맞추고 24 well에 각각 ImL씩 첨가하여 24시간 동안 37°C, 5% COa incubator에서 배 양한 후 용매 종류별 분획 물을 각각 일 정 량의 dimethyl sulfoxide(DMSO) 에 녹여서 50, 100, 150, 200 및 250 ug/m丄의 농도로 첨 가하였다. 48시간 동안 배 양한 후 각 well에 PBS 완충액 에 녹인 MTT 용액 (3 mg/mL)을 100 虬씩 첨 가하여 4시 간 동안 다시 배 양시킨 후, well 바닥에 형성 된 formazan이 홉어 지 지 않게 상등액을 제거 하고 DMSO와 ethanol을 1:1로 혼합한 용액 1 mL를 첨가하여 천천히 녹인 후 UV-visible spectrophotometer를 이용하여 570 nm, 690 nm에서 각각 흡광도를 측정 하여 대조 군세 포수를 100%로 하였을 때의 상대적 인 세포성장 억 제율을 구하였다.
- 이를 위 해 각 세포주를 1 X 105 cells/ well의 농도로 맞추고 24 well에 각각 ImL씩 첨가하여 24시간 동안 37°C, 5% COa incubator에서 배 양한 후 용매 종류별 분획 물을 각각 일 정 량의 dimethyl sulfoxide(DMSO) 에 녹여서 50, 100, 150, 200 및 250 ug/m丄의 농도로 첨 가하였다. 48시간 동안 배 양한 후 각 well에 PBS 완충액 에 녹인 MTT 용액 (3 mg/mL)을 100 虬씩 첨 가하여 4시 간 동안 다시 배 양시킨 후, well 바닥에 형성 된 formazan이 홉어 지 지 않게 상등액을 제거 하고 DMSO와 ethanol을 1:1로 혼합한 용액 1 mL를 첨가하여 천천히 녹인 후 UV-visible spectrophotometer를 이용하여 570 nm, 690 nm에서 각각 흡광도를 측정 하여 대조 군세 포수를 100%로 하였을 때의 상대적 인 세포성장 억 제율을 구하였다.
- QR생성 유도 효과는 Prochaska와 Santamaria의 빙법 (23, 24)을 일부 변형하여 측정하였다. 즉 T-75 flask에서 배양 중인 HepG2세포가 80%이 상 증식 하게 되 면 24 well plate의 각 well에 lx# cells/mL 되도록 HepG2세壬를 분주하여, 37 °C 5% CO2 incubator에 24시 간 동안 배 양한 후 돌나물 추출물을 각각 DMSO 에 녹여 40, 60, 80 및 100 Ug/mL의 농도로첨 가하고, 다시 24시 간 동안 배 양한 다음 배 양액을 제 거 하였다.
- 일부 변형하여 측정하였다. 즉 T-75 flask에서 배양 중인 HepG2세포가 80%이 상 증식 하게 되 면 24 well plate의 각 well에 lx# cells/mL 되도록 HepG2세壬를 분주하여, 37 °C 5% CO2 incubator에 24시 간 동안 배 양한 후 돌나물 추출물을 각각 DMSO 에 녹여 40, 60, 80 및 100 Ug/mL의 농도로첨 가하고, 다시 24시 간 동안 배 양한 다음 배 양액을 제 거 하였다. 배지가 제거된 각 well에 250 UL의 lysis buffer (10 mM Tris HC1, pH 8.
- 돌나물의 메탄올 추출물과 각 용매별 분획 물에, 돌나물 조리 시 에 쓰이는 초고주장 등 유사한 부재료를 사용하는 도라지 (Platycodon grandiflorum A.) 일정 량을 첨가하여 돌나물에 미치는 도라지 분획물 항발암 효과를 실험하였다. 즉 도라지 의 butanol 분획 물을 ICso의 농도 인 40 Ug/mL를 취 해 돌나물 각 분획물에 동량 첨가하여 도라지 일정량 첨가에 의한 돌나물의 항발암 상승효과를 보기 위해서 암세포 증식억제 효과(MTT assay)와 암예방 QR 유도 상승효과를 측정하여도 라지 첨가전의 돌나물 분획물만의 효과와 비교 검토하였다.
- ) 일정 량을 첨가하여 돌나물에 미치는 도라지 분획물 항발암 효과를 실험하였다. 즉 도라지 의 butanol 분획 물을 ICso의 농도 인 40 Ug/mL를 취 해 돌나물 각 분획물에 동량 첨가하여 도라지 일정량 첨가에 의한 돌나물의 항발암 상승효과를 보기 위해서 암세포 증식억제 효과(MTT assay)와 암예방 QR 유도 상승효과를 측정하여도 라지 첨가전의 돌나물 분획물만의 효과와 비교 검토하였다.
- 돌나물(SS)을 메탄올로 추출하여 추출물(SSM)을 얻었으며 , 이 메탄올 추출물을 hexane(SSMH), ethylether(SSM- EE), ethylacetate(SSMEA), butanol(SSMB) 및 수증(SS- MA)의 용매별로 분획 하였다. 각 시 료의 용매 별 추출 분획 물의 수율은 Table 1과 같다.
- 돌나물과 유사한 조리 방법으로 자주 식 탁에 오르는 도라지 를 분획 한 후 ICso이 되 는 butanol 분획층 일정 성 분을 돌나물 시료에 각각 첨 가하여 항발암 상승효과를 측정 하였다. Ta ble 2는 도라지 의 butanol 분획 층인 PGMB를 3종의 인체 암 세포주(HepG2, HeLa, MCF-7) 에 20, 40, 60, 80 및 100 Ug/mL 첨 가시 농도별 증가에 의 한 암세포 증식 억 제 효과를 나타낸 결과로서, 이 결과에서 ICa)의 농도는 약 40 lig/m止에 해당되므로, 본 연구는 돌나물에 도라지 butanol 분획층의 IC50의농도 40 Ug/mL를 각각 첨가하여 돌나물의 추출물에 미치는 도라지 추출물의 상승효과를 측정하여 Fig.
- Ta ble 2는 도라지 의 butanol 분획 층인 PGMB를 3종의 인체 암 세포주(HepG2, HeLa, MCF-7) 에 20, 40, 60, 80 및 100 Ug/mL 첨 가시 농도별 증가에 의 한 암세포 증식 억 제 효과를 나타낸 결과로서, 이 결과에서 ICa)의 농도는 약 40 lig/m止에 해당되므로, 본 연구는 돌나물에 도라지 butanol 분획층의 IC50의농도 40 Ug/mL를 각각 첨가하여 돌나물의 추출물에 미치는 도라지 추출물의 상승효과를 측정하여 Fig. 5, 6 및 7에 그 결과를 나타내었다.
대상 데이터
- 본 실험 에 사용된 돌나물(Sedum sarmentosum Bunge, SS) 은 2000년 5월 부산 엄궁 농수산물시장에서 구입 하여 음건하였다. 이 시료를 추출 .
- 암세 포 증식 억제 실험 에 사용된 시약 중 NP-40과 menad- ione은 Sigma사(St. Louis, USA) 제품을 사용하였고 flavin adenine di nucleotide (FAD), dicumarol 및 glucose-6-phos- phate dehydrogenase는 Amresco사(USA) 제품을 구입하였으며, minimum essential medium(MEM), Dulbeco's Eagle modified medium(DMEM)과 phosphate buffered saline (PBS) 등은 Gibco-BRL(Grand Island Biologic Co., USA)에서 구입하였으며 , 그 외 연구에 사용된 용매 및 시 약은 특급을 사용하였다.
- 분말로 만들어 시료로 사용하였다. 첨가시료인 도라지의 butanol 분획 물(PGMB)도 위 와 같은 조작으로 제조하여 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 암세포주는 인체 간암 세포인 HepG2 (human hepatocellular carcinoma), 자궁 경 부암 세포인 HeLa (human cervices adenocarcinoma) 및 유방암 세포인 MCF 7(human breast adenocarcinoma pleural effusion)로서 2000 년 5월 한국세포주은행 任forean Cell Line Bank, KCLB) 에서구입 하였다. HepG2, HeLa 및 MCF-7세포주는 DMEM me- dium에 10% fetal bovine serum(FBS) 100 rnL와 1% 100 units/mL의 penicillin streptomycin lOmL이 함유된 배지를 사용하여 .
데이터처리
- Standard deviations have been omitted for simplicity. All data were significantly different aV ^<0.05 by Duncan's multiple range test.
- Standard deviations have been omitted for simplicity. All data were significantly different at p<0.05 by Duncan's multiple range test.
이론/모형
- 돌나물 추출 분획 물의 암세 포 증식 억 제 효과는 MTT assay 를 사용하여 행하였다(21, 22).
- 4) 혼합액을 250 uL씩 첨가하여 효소 반응을 정 지 시 키 고, UV-visible spectrophotometer를 이 용하여 610 nm에서 흡광도를 측정 하여 계산하였다. 그리 고 단백질량은 동일한 set의 well plate에 대 한 crystal violet 염 색 방법으로 정량하였다.
성능/효과
- 보기 위하여 실시하였다. 돌나물의 암세포 증식 억제 효과를MTT assay로실험한 결과, 3종의 암세포주(HepG2, HeLa, MCF-7) 모두 돌나물의 ethylether 분획층(SSMEE)에서 아주 높은 암세포 증식 억 제 효과를 보였으며, ethylacetate 분획 층(SSMEA)에서도 유의적인 암세포 증식억제 효과를 나타내 었다. 또한, 돌나물 분획 물의 암예방 QR유도 활성 을 Hep- G2세포주를 이용하여 실험한 결고" 다른 분획층에 비해 비극성 용매층인 ethylether 분획층(SSMEE)과 hexane 분획층 (SSMH) 에서 유의 적으로 QR유도 활성을 층가시 키는 것으로 나타났다.
- Fig. 1은 인체 간암세포주인 HepG2에 용매별 각 시료 분획 물을 100, 200, 300, 400 및 500 Ug/mL씩 농도를 증가시키며 첨가하였을 때의 암세포 증식억제 효과를 나타낸 것이며, 다른 용매 분획층에 비 해 ethylether층인 SSMEE에서 그 효괴-가 아주 뛰 어 났다一 즉, SSMEE의 시 료 농도 200 卩g/mL을 첨가했을 때 다른 분획 물보다 약 70.1%의 높은 암세포 증식 억 제 효과를 보였고, 계속 농도 의 존적 으로 암세포 증식 억제 효과가 증가하여 300 Ug/mL를 첨 가했을 때 는 94.7%의 아주 높은 암세포 억제 효과가 나타났다. 자궁경부암세포주인 He-La에 대한 암세포 증식 억 제 실험 결과는 Fig.
- 1의 HepG2 세포주에 대한 암세포 증식억제 효과와 유사한 결과를 나타내었다. 즉, 시료농도 200 Ug/mL을 첨가했을 때 SSMEE분획 물은 다른 분획 물의 경 우보다 월등히 암세포 증식 저해 효과가 커서 75.1%의 높은 수치를 보였오며 , 300 Ug/mL을 첨 가했을 때는 97.6%의 아주 높은 암세포증식 억 제 효과를 나타내 었디-. Fig.
- 6%의 아주 높은 암세포증식 억 제 효과를 나타내 었디-. Fig. 3은 유방암세포주인 MCF 7의 결과이 며 , 이 경 우에서 도 HepG2와 HeLa세포■주의 결과와 비 슷하게 나타났으며 , SSMEE를 200 Ug/mL을 첨가했을 때 이 미 94.7%의 아주 높은 암세포 증식 억 제 효과를 나타내었고, 300 Hg/mL 첨가의 경우 92.6% 억제효과를 나타내었다. 이 상의 결과에서 볼 때, 3종의 암세포주 모두 비극성 용매 부분인 ethylether 분획 층(SSMEE)에서 다른 분획 층보다 높은 암세포 증식 억제 효과(cytotoxicity)를 나타내었고, 3종의 암세포주 모두 ethylacetate층인 SSMEA에서도 다른 분획물에 비해 유의적인 효과를 나타내었디-.
- 6% 억제효과를 나타내었다. 이 상의 결과에서 볼 때, 3종의 암세포주 모두 비극성 용매 부분인 ethylether 분획 층(SSMEE)에서 다른 분획 층보다 높은 암세포 증식 억제 효과(cytotoxicity)를 나타내었고, 3종의 암세포주 모두 ethylacetate층인 SSMEA에서도 다른 분획물에 비해 유의적인 효과를 나타내었디-.
- 이 에 본 연구는 돌나물 추출물 및 분획물의 암예방 효소유도여 부를 조사하기 위 하여 암세포 증식 억 제 효과에 사용된 3종의 인체 암세포주 중 유일하게 quinone reductase를 가지 고 있는 간암세포주 HepG2를 사용하여 QR유도 활성 효과를 측정 하였으며, 그 결과는 Fig. 4에 나타내 었匸h 즉, HepG2 세포주에 각각의 시 료 분획 물을 40, 60, 80 및 100 Jig/mL의 농도로 첨가했을 때 돌나물의 ethylether 분획 층(SSMEE)과 hexane 분획층(SSMH)이 QR효소 활성을 월등히 증가시키는 것으로 나타났으며, 그 외의 분획층은 큰 영향을 미치지 않았다. SSMEE의 경 우 용매 대조군을 1.
- 4에 나타내 었匸h 즉, HepG2 세포주에 각각의 시 료 분획 물을 40, 60, 80 및 100 Jig/mL의 농도로 첨가했을 때 돌나물의 ethylether 분획 층(SSMEE)과 hexane 분획층(SSMH)이 QR효소 활성을 월등히 증가시키는 것으로 나타났으며, 그 외의 분획층은 큰 영향을 미치지 않았다. SSMEE의 경 우 용매 대조군을 1.0으로 하여 비교한결고}, 40.60, 80 및 100 Ug/mL의 시료첨가 농도에서 각각 1.72, 2.35, 2.91 및 3.21 로 농도 의존적 인 아주 높은 QR유도 활성효과를 나타내 었으며, SSMH의 경 우에서도 SSMEE으] 경 우와 유사하게 각각 1.67, 2.11, 2.31 및 3一05의 높은 QR 유도 활성효과를 나타내었다.
- 이상의 결과로서 암예방 효과의 척 도로 사용되 는 QR 유도 활성 효과는 특히, 돌나물 성분 중 친유성 성분이 녹아있는 ethylether 분획 층과 hexane 분획 층에 quinone reductase의 유도물질이 존재함으로서 돌나물 분획물 성분 중에 높은 생리활성 물질 존재를 추정할 수 있었다.
- 5는 인체 간암세포주인 HepG2에 돌나물 methanol 추출물과 각 5종류의 분획 물에 도라지 butanol 분획 물(PGMB) 40 Ug/mL을 첨가헸을 때의 암세포 증식 억제 상승효과를 얻은 결과로서, 돌나물의 모든 분획층에서 아주 높은 암세포 증식억제 상승 효과를 보였다. 특히 돌나물의 ethylether 분획 층인 SSMEE의 경우, SSMEE를 단독으로 100 pg/mL 첨가했을 때 암세포 증식억제 효과는 2.3%였으나, 같은 농도의 SSMEE에 PGMB 40 卩g/mL를 첨가했을 때에는 88.1%의 높은 암세포 억 제 상승효과를 보였으며, SSMEE를 200 lig/mL 증량시 켜 PGMB를 일정동량 첨가했을 경우, 첨가하지 않았을 때의 70.1% 억제에 반해, 첨가시 에는 95.9%의 아주 높은 암세포 증식 억 제 효과를 나타내 었고, 농도를 증량시 킴 에 따라 억제효과도 그대로 유지되었다. HeLa와 MCF 7의 결과를 나타낸 Fig.
- 5의 HepG2세포주의 결과와 유사한 높은 암세포 억 제 상승효과가 나타났다. 즉 Fig. 6에서는 SSMEE만의 경우 200 叩/mL일 때 75.1%이 었으나 도라지 첨가시에는높은농도에서 이미 97.0%의 암세포증식 억제 효과가 나타났으며 돌나불의 농도 증가에 따라 그 효과가 상승 유지되 었다. Fig.
- 0%의 암세포증식 억제 효과가 나타났으며 돌나불의 농도 증가에 따라 그 효과가 상승 유지되 었다. Fig. 6에서 보듯이 SSMEE에 비 해 효과가 미약했던 SSMEA, SSMH, SSMB, SSMA 및 SSM은 도라지추출물 첨가로 암세포 성장 억제효과가 메우 상승되었다. Fig.
- 8에 나타내었다. 즉, 돌나물 단독의 각각 시료 농도 40, 60, 80 및 100 Ug/mL를 가했을 때 QR 활성은 1.72, 2.35, 2.91 및 3.21.로 나타났으며 , 도라지 butanol 분획층인 PGMB를 10 Ug/mL을 각각 첨가한 결과 2.2, 2, 8, 3.6 및 4.8의 높은 QR 유도 상승효과를 나타내었다. 이 효과는 도라지 분획물 첨가 전보다 첨가시 훨씬 높은 QR 유도효과가 나타났으므로, 돌나물에 도라지의 butanol 일정량 첨가시의 항발암 상승 효과는, 우리 의 식 탁에서 거 의 같은 부재료를 사용해서 조리하는 돌나물과 도라지를 함께 조합하여 섭 취 했을 때 나타나는 여러 생리 활성 효과가 더욱 상승되 어질 것이라고 생각되며, 식품 속에 들어있는 기능성 믈질들의 조합이 항발암 건강 증진에 더욱 유익한 지표가 되리라 사료된다.
- 돌나물의 암세포 증식 억제 효과를MTT assay로실험한 결과, 3종의 암세포주(HepG2, HeLa, MCF-7) 모두 돌나물의 ethylether 분획층(SSMEE)에서 아주 높은 암세포 증식 억 제 효과를 보였으며, ethylacetate 분획 층(SSMEA)에서도 유의적인 암세포 증식억제 효과를 나타내 었다. 또한, 돌나물 분획 물의 암예방 QR유도 활성 을 Hep- G2세포주를 이용하여 실험한 결고" 다른 분획층에 비해 비극성 용매층인 ethylether 분획층(SSMEE)과 hexane 분획층 (SSMH) 에서 유의 적으로 QR유도 활성을 층가시 키는 것으로 나타났다. 한편, 돌나물과 도라지 와의 일정 비 조합을 통해 상승효과를 본 결과 IGo이 되 는 도라지의 butanol층(PGMB) 을 일정량 첨가했을 때 용매별 돌나물의 분획층 모두에서 암세포 증식억제를 상승시키는 효과를 나타내었고, 암예방 QR 유도활성 효과도 훨씬 상승하였으므로, 돌나물 조리시 유사한 부재료를 사용하는 도라지의 성분을 일정 량 첨가하여 겉절이 무침이나 김치로 이용될 때 똘나물 성분의 생리활성 효과가 더 욱 상승될 것 으로 사료되 며 , 이 후 돌나물의 생 리 활성 물질 구조 및 기 전 규명 에 유익 한 자료가 될 것으로 사료된다.
후속연구
- 8의 높은 QR 유도 상승효과를 나타내었다. 이 효과는 도라지 분획물 첨가 전보다 첨가시 훨씬 높은 QR 유도효과가 나타났으므로, 돌나물에 도라지의 butanol 일정량 첨가시의 항발암 상승 효과는, 우리 의 식 탁에서 거 의 같은 부재료를 사용해서 조리하는 돌나물과 도라지를 함께 조합하여 섭 취 했을 때 나타나는 여러 생리 활성 효과가 더욱 상승되 어질 것이라고 생각되며, 식품 속에 들어있는 기능성 믈질들의 조합이 항발암 건강 증진에 더욱 유익한 지표가 되리라 사료된다.
- 또한, 돌나물 분획 물의 암예방 QR유도 활성 을 Hep- G2세포주를 이용하여 실험한 결고" 다른 분획층에 비해 비극성 용매층인 ethylether 분획층(SSMEE)과 hexane 분획층 (SSMH) 에서 유의 적으로 QR유도 활성을 층가시 키는 것으로 나타났다. 한편, 돌나물과 도라지 와의 일정 비 조합을 통해 상승효과를 본 결과 IGo이 되 는 도라지의 butanol층(PGMB) 을 일정량 첨가했을 때 용매별 돌나물의 분획층 모두에서 암세포 증식억제를 상승시키는 효과를 나타내었고, 암예방 QR 유도활성 효과도 훨씬 상승하였으므로, 돌나물 조리시 유사한 부재료를 사용하는 도라지의 성분을 일정 량 첨가하여 겉절이 무침이나 김치로 이용될 때 똘나물 성분의 생리활성 효과가 더 욱 상승될 것 으로 사료되 며 , 이 후 돌나물의 생 리 활성 물질 구조 및 기 전 규명 에 유익 한 자료가 될 것으로 사료된다.
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