흰쥐 발정주기와 난소절제에 따른 질상피의 glycoconjugates, estrogen receptor-α, c-fos 및 c-jun 분포변화 Differential expression of glycoconjugates, estrogen receptor-α, c-fos and c-jun in the vagina of normal and ovariectomized rat원문보기
흰쥐 발정주기와 난소절제에 따른 질의 GCs, ER-$\alpha$, c-fos 및 c-jun 변화를 조직화학적 및 면역조직화학적으로 관찰하였다. 질상피는 발정사이기와 발정전기로 이어 지는 점액세포화과정에서 현저한 GCs의 양적 증가를 관찰할 수 있으며 발정사이기의 SBA, 발정전기와 발정기의 Con A와 같이 발정주기에 따른 특이적 GCs가 관찰되었다. 난소절제시에는 매우 위축된 표면층 평평세포에서만 미량의 GCs가 관찰되었다. 질에서 ER-$\alpha$, c-fos, c-jun등은 주로 핵에서 반응을 나타내는데, ER- $\alpha$는 상피세포 중 바닥층에서 주로 관찰되며, 반응세포수로 보아 발정주기에 따른 변화는 없었으나 버팀질세포에서는 발정사이기부터 발정기사이에 가장 많이 관찰되었다. c-fos는 상피의 바닥층과 중간층세포 그리고 버팀질세포에서 발정전기와 발정기사이에 가장 많이 관찰되며 c-jun은 발정기의 상피 바닥층에서 가장 많이 관찰되나 버팀질세포에서는 발정기에만 관찰되었다. 난소절제시 ER-$\alpha$, c-fos, c-jun모두 상피의 적은 세포에서만 관찰되며 버팀질 세포에서는 관찰되지 않았다. 이상의 결과로 보아 발정주기와 난소절제에 따라 특이적인 GCs분포를 보일 뿐 아니라 ER-$\alpha$, c-fos, c-jun 같은 단백질의 상이한 분포를 보여 주고 있어 이들이 질상피세포의 증식과 분화에 관여함을 알 수 있다.
흰쥐 발정주기와 난소절제에 따른 질의 GCs, ER-$\alpha$, c-fos 및 c-jun 변화를 조직화학적 및 면역조직화학적으로 관찰하였다. 질상피는 발정사이기와 발정전기로 이어 지는 점액세포화과정에서 현저한 GCs의 양적 증가를 관찰할 수 있으며 발정사이기의 SBA, 발정전기와 발정기의 Con A와 같이 발정주기에 따른 특이적 GCs가 관찰되었다. 난소절제시에는 매우 위축된 표면층 평평세포에서만 미량의 GCs가 관찰되었다. 질에서 ER-$\alpha$, c-fos, c-jun등은 주로 핵에서 반응을 나타내는데, ER- $\alpha$는 상피세포 중 바닥층에서 주로 관찰되며, 반응세포수로 보아 발정주기에 따른 변화는 없었으나 버팀질세포에서는 발정사이기부터 발정기사이에 가장 많이 관찰되었다. c-fos는 상피의 바닥층과 중간층세포 그리고 버팀질세포에서 발정전기와 발정기사이에 가장 많이 관찰되며 c-jun은 발정기의 상피 바닥층에서 가장 많이 관찰되나 버팀질세포에서는 발정기에만 관찰되었다. 난소절제시 ER-$\alpha$, c-fos, c-jun모두 상피의 적은 세포에서만 관찰되며 버팀질 세포에서는 관찰되지 않았다. 이상의 결과로 보아 발정주기와 난소절제에 따라 특이적인 GCs분포를 보일 뿐 아니라 ER-$\alpha$, c-fos, c-jun 같은 단백질의 상이한 분포를 보여 주고 있어 이들이 질상피세포의 증식과 분화에 관여함을 알 수 있다.
We investigated the compositional changes of glycoconjugates (GCs) and expression of estrogen receptor (ER)-$\alpha$, c-fos and c-jun in the vagina of normal and ovariectomized rats by histochemical and immunohistochemical methods. The mucinous transformation of the superficial layer that...
We investigated the compositional changes of glycoconjugates (GCs) and expression of estrogen receptor (ER)-$\alpha$, c-fos and c-jun in the vagina of normal and ovariectomized rats by histochemical and immunohistochemical methods. The mucinous transformation of the superficial layer that occurred from late diestrus to proestrus was accompanied with extensive enrichment of GCs. According to the cyclic changes of the vagina, distinct reactivity patterns such as SBA affinity in the diestrus and Con A affinity in the diestrus and estrus phase was observed. However, weak staining for GCs was detected in the atrophied vaginal epithelium of ovariectomized rats. ER-$\alpha$ immunoreaction was mainly demonstrated in the basal layer of epithelium and estrus cycle-related variation in the number of ER-$\alpha$ immunoreaction were not pronounced. But the stromal cells showing ER-$\alpha$ immunoreaction were abundantly observed from diestrus to estrus phase. The most numerous c-fos immunoreactive cells were observed in the basal and intermediate layer of epithelium and stromal fells from the proestrus to estrus phase and c-jun in the basal layer of epithelium during estrus phase. The c-jun immunoreaction of stromal cells expressed only in the estrus phase. In the ovariectomized rats, a few of ER-$\alpha$, c-fos and c-jun immunoreactive cells were observed in the vaginal epithelium and no immunoreaction were found in the stromal cells. ER-$\alpha$ and c-fos immunoreaction fully expressed in the proestrus coincident with the cell proliferation, mutinous transformation and cornification of vaginal epithelium. These data indicate that vagina epithelium and stromal reals express multiple protein such as ER-$\alpha$, c-fos and c-iun by estrogen that may function in process of cells proliferation and differentiation of vagina epithelium.
We investigated the compositional changes of glycoconjugates (GCs) and expression of estrogen receptor (ER)-$\alpha$, c-fos and c-jun in the vagina of normal and ovariectomized rats by histochemical and immunohistochemical methods. The mucinous transformation of the superficial layer that occurred from late diestrus to proestrus was accompanied with extensive enrichment of GCs. According to the cyclic changes of the vagina, distinct reactivity patterns such as SBA affinity in the diestrus and Con A affinity in the diestrus and estrus phase was observed. However, weak staining for GCs was detected in the atrophied vaginal epithelium of ovariectomized rats. ER-$\alpha$ immunoreaction was mainly demonstrated in the basal layer of epithelium and estrus cycle-related variation in the number of ER-$\alpha$ immunoreaction were not pronounced. But the stromal cells showing ER-$\alpha$ immunoreaction were abundantly observed from diestrus to estrus phase. The most numerous c-fos immunoreactive cells were observed in the basal and intermediate layer of epithelium and stromal fells from the proestrus to estrus phase and c-jun in the basal layer of epithelium during estrus phase. The c-jun immunoreaction of stromal cells expressed only in the estrus phase. In the ovariectomized rats, a few of ER-$\alpha$, c-fos and c-jun immunoreactive cells were observed in the vaginal epithelium and no immunoreaction were found in the stromal cells. ER-$\alpha$ and c-fos immunoreaction fully expressed in the proestrus coincident with the cell proliferation, mutinous transformation and cornification of vaginal epithelium. These data indicate that vagina epithelium and stromal reals express multiple protein such as ER-$\alpha$, c-fos and c-iun by estrogen that may function in process of cells proliferation and differentiation of vagina epithelium.
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제안 방법
ER~af c-fos, c-jun에 대한 면역조직화학적 관찰 면역조직화학적 관찰을 위해 탈파라핀 한 후 95℃ 10 mM sodium citrate buffer (pH 6.0)에 5분간 처리하였고 이를 3% methanolic hydrogen peroxide에 30분간 실온에서 처리하였다, PBS로 세척한 후 goat normal serum (Vector Labv PK-6101)으로 30분간 처리하였으며, Santa Cruz Biotechnology Inc, 의 ER- a (sc-542), c-fos (sc-253)z c-jun (sc-1694)을 모두 500 :1로 희석하여 4℃의 humidity chamber에서 16시간 동안 반응시켰다.
GCs 잔기에 특이적 인 lectin 조직화학을 위하여 탈파라핀 한 조직을 3% methanolic hydrogen peroxide에 실온에서 30분간 처리하고, PBS로 10분간 3회 세척한 후 1% bovine serum albumin용액에 실온에서 30분간 두었다. 이를 biotinylated lectin (Vector Lab.
Neutral GCs 에 대한 관찰은 periodic acid Schiff반응법 을, acid GCs는 alcian blue pH 2.5 염스객을 실시하였다. acid GCs 중 sulfated GCs는 alcian blue pH L0염 색을, sulfated 와 nonsulfated GCs 구별은 aldehyde fuchsin pH 1.
01 mM의 M*) i? 에 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS로 세척 후 상용화된 ABC kit (Vector Lab., PK-4000)에 60분간 반응시키고 DAB substrate kit (Vector Lab.z SK-4100)로 실온에서 5분간 발색시켜 Mayer's hematoxylin으로 대조염색하였다. 각 kit의 사용법은 제조회사의 매뉴얼에 근거하여 실시하였다.
4)에 4℃ 16시간 동안 고정하였다. PBS로 수세 후 순차적인 탈수 및 투명화를 거쳐 paraffin에 포매하여 5㎛ 연 속절편을 만들었다.
발정주기에 따른 질상 피의 변화를 보면 표면층 세포의 점액세 포화와 각질 세포화가 뚜렷이 관찰되었다. 발정 사이기의 질상피는 8-12층의 중충편평상 피로 표면층 세포에 미약한 GCs에 대한 반응을 보이나 발정 전기에 이르면 표면층세 포가 많은 GCs를 함유한 중층 입방형의 점액세포로 변하였다. 발정기에는 점액세포 아래에서 형성된 각질 세포가 점액 세포를 질 내강으로 밀어내어 표면층은 중층 편평형의 각질 세포로 대치되었다.
설치류의 생식기계는 세포성장과 분화에 대한 성호르몬 효과 연구에 매우 뛰어난 모델로서 특히 자궁점막의 증식, 분화에 대한 다양한 연구가 있으나 그에 따른 질 점막 단백질발현에 대한 연구는 많지 않다. 본 실험은 발정 주기와 난소절제시 성호르몬 변화에 의한 질의 GCs 성상 그리고 ERtf, oncogene product 인 c-fos와 c-jun 분포를 관찰하였다.
각 kit의 사용법은 제조회사의 매뉴얼에 근거하여 실시하였다. 상기 실험 방법 중 일차항체 대신 10% BSA/PBS을 처리하고 동일한 과정으로 염색한 것을 대조군으로 삼았다.
대상 데이터
10주된 건강한 Sprague-Dawley계 암컷 흰 쥐를 2주간 자유급식법으로 실험실 환경 (23±1℃)에 순화시키며 질도 말 표본을 통해 생리주기가 일정한 개체를 실험에 사용하였다. 난소는 sodium pentobarbital (Entobalz한림제약) 3 mg/ 100 g를 복강 내 주사하여 마취시킨 후 복부를 절개하여 난소를 절제하였으며 절제 10주 후 실험에 사용하였다.
10주된 건강한 Sprague-Dawley계 암컷 흰 쥐를 2주간 자유급식법으로 실험실 환경 (23±1℃)에 순화시키며 질도 말 표본을 통해 생리주기가 일정한 개체를 실험에 사용하였다. 난소는 sodium pentobarbital (Entobalz한림제약) 3 mg/ 100 g를 복강 내 주사하여 마취시킨 후 복부를 절개하여 난소를 절제하였으며 절제 10주 후 실험에 사용하였다.
성능/효과
Lectin조직화학에 의한 변화를 보면 sWGA와 BSL-1에 반응하는 GCs는 상피의 중간층에서 주토관찰되며 발정 주기 에 따른 변화는 없었으나 BSL-Le 점 액 세포와 각질 세포에 서도 관찰되었다. SBA와 Con A는 모든 상피층에서 관찰되며 SBA는 발정 사이기의 모든 층에서, Con A는 발정전기의 바닥층 및 발정기의 중간층에서 다른 기에 비해 강한 반응을 보였다.
본 실험 결과에서 ER-a는 질상 피에서 생식주기에 따른 현저한 변화가 없었으나 버팀질세포는 세포 증식이 활발하며 점액세포와 각질 세포가 형성되는 발정사이 기부터 발정기로 감에 따라 반응 수가 현저히 증가하여 버팀질세포의 ER-a활성이 질상피의 세포 증식과 분화에 중요한 기능을 가짐을 알 수 있다. 그리고 c-fos반응세포수는 세포의 증식과 각질 세포가 분화되기 시작하는 발정 전기에 가장 많으며 각질 세포화가 마무리되는 발정기부터 감소하며 c-june 상 피에서 발정기에 가장 강한 반응을, 버팀질세포에서는 발정기에만 관찰되어 발정주기에 따른 상이한 변화를 보였다. 난소 절제에 의해서는 c-fos와 c-june 상피세포에서 반응세 포수가 매우 적게 관찰되며 상피세포의 질상피증식과 분화에 영향을 주는 버팀질세포에서는 ER-a, c-fos, c-jun이 관찰되지 않았다.
SBA와 Con A는 모든 상피층에서 관찰되며 SBA는 발정 사이기의 모든 층에서, Con A는 발정전기의 바닥층 및 발정기의 중간층에서 다른 기에 비해 강한 반응을 보였다. 난소 절제 흰 쥐 질에서 sWGA와 BSL-1에 대한 반응은 나타나지 않으며 SBA와 Con A는 표면층의 점 액세포 에서만약한 반응을 보였다 (Fig. 2).
고전적 방법에 의한 질상 피의 GCs성상을 보면 neutral GCs와 acid GCs의 혼합성이며 acid GCs 성상으로 보아 nonsulfated GCs가 대부분이었다. 발정주기에 따른 GCs변화를 보면 늦은 발정 사이기와 발정 전기에 이르는 점액세포에 가장 풍부한 GCs가 관찰되었다. 난소가 절제된 흰 쥐 질 상피는 표면층 세포 1-2층에서만 미약한 GCs에 대한 반응이 관찰되었다 (Fig.
본 실험 결과에서 ER-a는 질상 피에서 생식주기에 따른 현저한 변화가 없었으나 버팀질세포는 세포 증식이 활발하며 점액세포와 각질 세포가 형성되는 발정사이 기부터 발정기로 감에 따라 반응 수가 현저히 증가하여 버팀질세포의 ER-a활성이 질상피의 세포 증식과 분화에 중요한 기능을 가짐을 알 수 있다. 그리고 c-fos반응세포수는 세포의 증식과 각질 세포가 분화되기 시작하는 발정 전기에 가장 많으며 각질 세포화가 마무리되는 발정기부터 감소하며 c-june 상 피에서 발정기에 가장 강한 반응을, 버팀질세포에서는 발정기에만 관찰되어 발정주기에 따른 상이한 변화를 보였다.
본 실험에서도 발 정주기에 따라 독특한 GCs성상과 양의 변화를 볼 수 있으며 특히 발정 사이기와 발정 전기에 나타나는 점액세포에 가장 풍부한 GCs양과 성상의 다양성을 보여주었다. 난소 절제시에는 매우 위축된 상피 표면층의 세포에만 매우 약한 GCs반응을 보여주어 성호르몬은 질상 피의 증식과 GCs형성에 영향을 주는 것을 알 수 있다.
이상의 결과로 보아 발 정주기와 난소 절제에 따른 estrogen 변화는 ER-a활성 뿐 아니라 즉시 발현되는 oncogene product 인 c-fos와 c-jun 같은 단백질 등과 연관된 auto- crine/paracrine에 의해 질상피의 세포 성장, 분화, 발생에 중요한 인자로 작용할 수 있음을 알 수 있었다.
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