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문제 정의
- Chitinase의 생산 미생물로는 곰팡이 등이 활성이 크지만, 대량생산을 위해서는 통기 및 교반이 용이한 세균이 적당하며, 또한 chitinase 유전자의 분리 및 조작 등에도 곰팡이보다는 세균이 유리하다. 따라서 본 연구에서는 지구상에서 풍부한 생물자원의 하나인 chitin의 이용을 위하여 chitinase를 생산하는 세균을 토양으로부터 분리 ‧ 동정하고, chitinase의 최적생산조건을 검토하였다. 또한 chitinase를 prep-cell system을 이용하여 정제하였으며, 정제된 효소의 물리학적 및 효소학적 특성을 검토하였다.
제안 방법
- Colloidal chitin을 만들기 위해서 Jeuniaux의 방법[8]을 따랐다. 1차로 순수 분리된 colony를 1% colloidal chitin, 0.5% yeast extract, 0.5% peptone, 0.2% beef extract, 0.1% K2HPO4, 0.1% KH2PO4, 0.05% MgSO4‧7HQ를 함유한 효소생산용 액체배지에서 37℃, 200rpm의 조건 하에서 2~3일간 진탕 배양한 후 chitinase 활성을 측정하여 활성이 높은 균주를 2차로 분리하였다.
- 농축된 단백질을 최소량의 100 mM phosphate buffer로 현탁하여 효소를 동일한 buffer로 투석한 후 native PAGE를 행하였다. 2개의 well에 동일한 sample을 loading하여 전기영동한 후 칼로 절단하여 하나는 colloidal chitin agar plate에 올려놓고 65℃에서 1시간 반응시키고 다른 하나는 Coo massie blue R-250으로 염색하여 어느 band가 활성 band 인지를 비교, 확인하였다. 그 결과 3개의 서로 다른 활성 band를 확인할 수 있었다.
- Bacillus subtilis JK-56이 생산하는 chitinase의 생성 최적 조건을 결정하기 위하여 탄소원, 질소원, 무기염, 금속이온의 영향 및 각각의 농도 그리고 초발 pH, 온도의 영향을 검토하여 배양시간 경과에 따른 균의 증식 및 효소 생산성을 검토하였다. 그 결과, Table 3에서 보는 바와 같이 효소 생산 최적 조건을 결정하였다.
- 효소의 반응 특이성을 알아보기 위하여 여러 종류의 chito 올리고당들을 기질로 하여 효소반응을 한 뒤 반응 산물을 HPLC를 통해 분석하였다. Columne carbohydrate analysis P/N84038 (Waters社)을 사용하였고 용매는 acetonitlile : water (70 : 30, v/v)를 사용하였으며, 유속은 0.5 ㎖/min으로 하여 RI(refractive index) 검출기를 이용해서 검출하였다.
- Sample을 loading한 gel 부분은 10% trichloroacetic acid 용액에 10분 담근 후, 1% trichloroacetic acid 용액에서 하룻밤 방치하였다. Coomassie blue R-250 용액에 염색한 후 탈색하여 정제된 효소의 band 위치를 확인하였다. 그 결과 본 효소의 등전점 은 Fig.
- 정제된 단백질의 순도를 검정하기 위하여 7%의 polyacrylamide gel을 사용하여 Laemmli의 방법[10]에 따라 native-PAGE를 실시하였다[4]. Native-PAGE로부터 확인된 band가 chitinase 활성 band인지 확인하기 위해서 petri dish에 효소의 기질인 colloidal chitin을 1% 함유한 고체 agar plate를 만들어서 전기영동을 실시한 acrylamide gel을 plate 위에 얹고 효소 반응 온도인 65℃ 에서 1시간 동안 반응시킨 후 투명환을 확인하였다. 활성 band와 비교하기 위해 동일한 조건으로 전기영동한 것을 Coomassie blue R-250으로 염색하여 서로의 band를 비교하였다.
- SDS-PAGE를 행하여 염색, 탈색을 행한 후 단백질의 Rf 값을 구하여 분자량을 측정하였다. Rf 값은 선단지시약(BPB)의 이동거리에 대한 단백질의 이동거리의 비를 나타낸 값이다.
- pH에 대한 정제 효소 Chi-56A의 안정성을 알아보기 위하여 pH 3 ~ 6은 citrate buffer, pH 6 ~ 8은 phosphate buffer, pH 8 ~ 10은 borate buffer, pH 10 ~ 11은 NaHCO3 ‧ NaOH buffer를 그리고 pH 11 ~ 12는 Na2HPO4 ‧ NaOH buffer에 각각 효소를 37℃에서 30분간 방치한 다음 효소의 잔류활성을 측정해 보았다. 그 결과 Fig.
- 15 W의 일정한 전력으로 전기영동을 실시한 다음 선단지 시약(bromophenol blue; BPB)이 바닥까지 모두 내려간 다음 이후에 용출되는 용출액을 fraction collector를 통해서 회수하였다. 각 fraction을 280 nm에서 흡광도를 측정하였고, chitinase 활성을 측정하였다.
- 각각의 온도와 각각의 pH 완충액에 정제 효소를 30분 동안 방치한 후에 잔존활성을 측정하여 상대활성으로 안정성을 검토하였고 각각의 효소 반응 온도, pH 별로 효소활성을 측정하여 최적온도와 pH를 검토하였다.
- 3에서 보는 바와 같이 21 번째 fraction에서 chitinase 활성 peak를 보였다. 따라서 21번 fraction을 전후로 각각 10개의 fraction에 대하여 mini gel을 이용한 native-PAGE를 실시한 후 band를 염색하여 확인한 결과, 16-25까지 1개의 band를 확인할 수 있었지만 전기영동 buffer에 상당히 희석이 되어 있었으므로 10개의 fraction을 농축하여 band를 확인하기 위하여 centrifugal vaporizer CVE-200(EYELA)으로 10배 농축한 후 다시 mini gel로 native-PAGE를 실시하여 1개의 band를 확인하였다. 단백질량은 1~10번 fraction까지 상당히 높은 값을 나타내었는데, 이것은 Prep Cell에 sample을 loading한 다음 전기영동을 하고 BPB가 원통의 gel 끝까지 내려갔을 때부터 fraction을 받기 시작했기 때문에 앞의 fraction에는 BPB가 많이 포함되어 있어 BPB의 색소에 의해서 높은 값을 나타낸 것으로 생각된다.
- Chitinase 효소생산 측면에서는 약 15시간까지 거의 효소생산이 없다가 15시간 이후에 효소생산이 급격하게 이루어지면서 40시간 때에 최고의 효소생산을 나타내었다. 따라서 배양 40시간을 효소생산 최적 시간으로 결정하였다(Table 3). 배양액 내의 단백질량을 보면 균체가 성장하기 전까지 감소를 보이다가 균체가 성장하면서 전반적으로 증가하였다.
- 보고된 바에 의하면 몇몇의 세균이 chitinase isozyme을 생산한다고 한다[2,3,5]. 따라서 이 3개의 isozyme을 정제하기 위하여 Prep Cell을 이용하여 동일 조건으로 효소정제를 실시하였다.
- 따라서 본 연구에서는 지구상에서 풍부한 생물자원의 하나인 chitin의 이용을 위하여 chitinase를 생산하는 세균을 토양으로부터 분리 ‧ 동정하고, chitinase의 최적생산조건을 검토하였다. 또한 chitinase를 prep-cell system을 이용하여 정제하였으며, 정제된 효소의 물리학적 및 효소학적 특성을 검토하였다.
- 부산, 경남 일원의 논밭의 흙, 퇴비 및 바닷가 근처의 흙 등을 채집하여 시료로 사용하였다. 멸균수에 적당히 희석한 시료를 colloidal chitin을 함유한 고체배지에 도말한 후 37℃에서 2~3일간 배양한 다음 colloidal chitin을 분해해서 투명환을 생성하는 colony를 순수 분리하였다. Colloidal chitin을 만들기 위해서 Jeuniaux의 방법[8]을 따랐다.
- 분리 균주의 chitinase 생산을 위한 최적조건을 검토하기 위하여 탄소원, 유기질소원, 무기질소원, 무기염, 금속이온의 영향 및 각각의 농도와 초발 pH, 배양온도의 영향을 검토하고 최적조건에서 배양시간에 따른 균의 증식 및 효소 생산성을 검토하였다.
- 분리 균주의 분류학적인 위치를 검토하기 위하여 형태학적, 배양학적, 생화학적인 제반 특성을 조사하였으며[15], 16S rDNA의 염기서열을 통해 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 gene bank database와 비교 분석하여 동정하였다.
- 온도에 대한 정제 효소 Chi-56A의 안정성을 알아보기 위하여 효소액을 각각의 온도에서 30분간 방치한 후 잔존 활성을 측정하였다. 그 결과, Fig.
- 정제된 효소에 대한 colloidal chitin의 농도에 대한 영향을 Lineweaver Burk plot으로부터 측정하여 Km값을 구하였다. 그 결과 Fig.
-
Isoelectric point(pl) 측정
정제효소의 pl(isoelectric point)는 isoelectric focusing(IEF)에 따라 ampholyte(pH 3.5~10)의 pH 구배로 실험하였다[4].
- 65℃ 이상의 온도에서 급격히 효소의 활성의 감소하는 결과를 보였다. 정제효소의 활성 최적 온도에 대한 효소의 영향을 알아보기 위하여 각각의 온도에서 효소반응을 측정하였다. 그 결과 Fig.
- 0)에 24시간 투석 후 다시 EDTA가 없는 동일 완충액에 24시간 투석 처리하였다. 처리된 효소에 각각의 금속이온을 10 mM되게 첨가한 후 효소활성을 측정하여 상대적인 효소활성을 측정하였다.
- 최적 생산 배지조건하에서 Bacillus subtilis JK-56의 진탕 배양 시간에 따른 균의 생육도와 효소생산량, 단백질량, pH 변화 등을 관찰하였다. 그 결과, Fig.
- Native-PAGE로부터 확인된 band가 chitinase 활성 band인지 확인하기 위해서 petri dish에 효소의 기질인 colloidal chitin을 1% 함유한 고체 agar plate를 만들어서 전기영동을 실시한 acrylamide gel을 plate 위에 얹고 효소 반응 온도인 65℃ 에서 1시간 동안 반응시킨 후 투명환을 확인하였다. 활성 band와 비교하기 위해 동일한 조건으로 전기영동한 것을 Coomassie blue R-250으로 염색하여 서로의 band를 비교하였다.
- 효소의 반응 특이성을 알아보기 위하여 여러 종류의 chito 올리고당들을 기질로 하여 효소반응을 한 뒤 반응 산물을 HPLC를 통해 분석하였다. Columne carbohydrate analysis P/N84038 (Waters社)을 사용하였고 용매는 acetonitlile : water (70 : 30, v/v)를 사용하였으며, 유속은 0.
- 효소활성에 대한 금속이온의 영향을 검토하기 위하여 조효소액에 각각의 금속이온을 1 mM되게 첨가하여 전술한 활성 측정법으로 비교하였다. 효소액은 20 mM EDTA가 포함된 50 mM potassium phosphate buffer(pH 7)에 효소를 4℃에서 24시간 투석한 후, EDTA가 없는 동일한 완충액에 24시간 투석하였다.
- 효소활성에 미치는 금속이온의 영향을 검토하기 위하여 효소액을 20 mM EDTA가 포함된 phosphate 완충액(pH 7.0)에 24시간 투석 후 다시 EDTA가 없는 동일 완충액에 24시간 투석 처리하였다. 처리된 효소에 각각의 금속이온을 10 mM되게 첨가한 후 효소활성을 측정하여 상대적인 효소활성을 측정하였다.
대상 데이터
- strain 09와 가장 유사한 것으로 판명되었다. 따라서 본 균주를 Bacillus subtilis로 동정하고 편의상 Bacillus subtilis JK-56으로 명명하고 이후의 실험에 사용하였다.
- 부산 경남 일원에서 채집한 토양 시료를 증류수에 현탁하여 적당히 희석한 다음 colloidal chitin이 함유된 분리용 배지에 도말하여 투명환을 생성한 균주를 1차로 100여 균주를 분리하였다. 그 중에서 chitinase 활성을 측정한 결과, 활성이 가장 높은 56번 균주를 2차로 선별하여 편의상 JK-56이라 명명하였다.
- 부산, 경남 일원의 논밭의 흙, 퇴비 및 바닷가 근처의 흙 등을 채집하여 시료로 사용하였다. 멸균수에 적당히 희석한 시료를 colloidal chitin을 함유한 고체배지에 도말한 후 37℃에서 2~3일간 배양한 다음 colloidal chitin을 분해해서 투명환을 생성하는 colony를 순수 분리하였다.
이론/모형
- 멸균수에 적당히 희석한 시료를 colloidal chitin을 함유한 고체배지에 도말한 후 37℃에서 2~3일간 배양한 다음 colloidal chitin을 분해해서 투명환을 생성하는 colony를 순수 분리하였다. Colloidal chitin을 만들기 위해서 Jeuniaux의 방법[8]을 따랐다. 1차로 순수 분리된 colony를 1% colloidal chitin, 0.
- 효소 1 unit는 1시간 동안 1 ㎛의 N-acetyl-D-glucosamine을 상산하는 효소의 양으로 정하였다. 단백질량은 bovine serum albumin을 표준 단백질로 하여 Lowry 법[12]으로 정량하였다.
- 등전점 측정은 polyacrylamide gel isoelectric focusing(IEF)의 방법에 따라 증류수에 ultrapure urea를 녹인 후 ampholyte(pH 3.5~10)를 첨가하여 poly-acrylamide gel을 만들었다. 그 다음 gel을 150 V에서 30분간 prerunning시킨 후에, 200 V에서 2시간 30분 동안 전기영동을 실시하였다.
- 5%가 되도록 하여 37℃에서 1시간 동안 150 rpm으로 진탕하면서 효소 반응을 시킨 후 끓는 물에 5분간 처리하여 반응을 정지시켰다. 반응 후 남아 있는 colloidal chitin을 제거하기 위히서 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 DNS (dinitrosalicylic acid) 법[13]으로 유리된 환원당을 정량하였다. 효소 1 unit는 1시간 동안 1 ㎛의 N-acetyl-D-glucosamine을 상산하는 효소의 양으로 정하였다.
-
Native-PAGE와 활성 band 측정
정제된 단백질의 순도를 검정하기 위하여 7%의 polyacrylamide gel을 사용하여 Laemmli의 방법[10]에 따라 native-PAGE를 실시하였다[4]. Native-PAGE로부터 확인된 band가 chitinase 활성 band인지 확인하기 위해서 petri dish에 효소의 기질인 colloidal chitin을 1% 함유한 고체 agar plate를 만들어서 전기영동을 실시한 acrylamide gel을 plate 위에 얹고 효소 반응 온도인 65℃ 에서 1시간 동안 반응시킨 후 투명환을 확인하였다.
- 정제된 효소의 분자량을 측정하기 위하여 Laemmli의 방법[10]에 따라 SDS-PAGE로 측정하였으며, 10% polyacrylamide gel과 Tris-glycine 완충액(25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3)을 사용하였다.
성능/효과
- 6 (B)에서 보는 바와 같이 55℃까지는 거의 100%의 활성을 유지하였고, 65℃에서도 약 90%의 활성을 유지하였다. 65℃ 이상의 온도에서 급격히 효소의 활성의 감소하는 결과를 보였다. 정제효소의 활성 최적 온도에 대한 효소의 영향을 알아보기 위하여 각각의 온도에서 효소반응을 측정하였다.
- B. subtilis JK-56의 chitinase 생산 최적 조건을 검토한 결과 1% chitin, 0.5% polypeptone, 0.1% KCl, 0.05% MnSO4‧H2O이며 초발 pH 7.0, 배양온도 37℃에서 가장 많은 효소를 생산하였다. 본 균주가 생산하는 chitinase를 정제하기 위해서 native-PAGE를 이용해 효소활성 band를 확인한 결과, 1개의 강한 활성 band와 2개의 약한 활성 band를 가지는 isozyme으로 확인되었다.
- 확인된 isozyme을 정제한 결과, isozyme 중 1개의 강한 활성 band를 정제하였고 정제된 효소를 Chi-56A라고 명명하였다. Chi-56A의 효소 특성에 관해서 실험한 결과 분자량은 약 53kDa, pl는 4.3으로 확인되었다. 본 효소는 65℃까지 상당히 안정하였으며, 효소의 최대활성 온도도 65℃로 확인되는 등 열에 대해 상당히 안정한 효소로 확인되었다.
- 또한 Mn2+ 존재 하에서 높은 활성을 나타내었고 Co2+와 Mg2+ 존재 하에서도 활성이 약간 증가한 반면에 Hg2+ 존재 하에서는 상당한 저해를 받았다. Chito 올리고당에 대한 분해 산물을 HPLC로 확인해 본 결과, 짝수개의 올리고당의 분해산물은 (GlcNAc)2만을 생산하였고 홀수개의 올리고당에 대해서는 GlcNAc와 (GlcNAc)2를 생산하는 것으로 비환원성 말단으로부터 이당체인 diacetyl chitobiose((GlcNAc)2)를 생산하는 exo형 chitinase로 추정된다.
- JK-56 균주의 형태학적, 배양학적, 생화학적 특징 및 partial 16S rDNA sequencing 결과 등의 제반 분류학적 특징들을 비교해 볼 때 Bacillus subtilis strain 09와 가장 유사한 것으로 판명되었다. 따라서 본 균주를 Bacillus subtilis로 동정하고 편의상 Bacillus subtilis JK-56으로 명명하고 이후의 실험에 사용하였다.
- 값을 구하였다. 그 결과 Fig. 7에서 보는 바와 같이 본 효소에 colloidal chitin에 대한 Km값은 17.33g/L로 확인되었다.
- 효소액은 20 mM EDTA가 포함된 50 mM potassium phosphate buffer(pH 7)에 효소를 4℃에서 24시간 투석한 후, EDTA가 없는 동일한 완충액에 24시간 투석하였다. 그 결과 Table 5에 나타난 것 처럼 Co2+, Mg2+에서 비교적 높은 활성을 보였으며 Mn2+에서 가장 높은 활성을 보였고 Hg2+에서는 활성에 상당한 저해를 받는 것으로 확인되었다.
- JK-56의 진탕 배양 시간에 따른 균의 생육도와 효소생산량, 단백질량, pH 변화 등을 관찰하였다. 그 결과, Fig. 2에서 보는 바와 같이 배양 시간은 약 10시간에서 30시간까지 대수증식기를 보였으며, 30시간 이후에 정지기를 거쳐 약 40시간 정도에 사멸기에 이르러 비교적 생장이 빠르다는 것을 알 수 있었다. Chitinase 효소생산 측면에서는 약 15시간까지 거의 효소생산이 없다가 15시간 이후에 효소생산이 급격하게 이루어지면서 40시간 때에 최고의 효소생산을 나타내었다.
- 온도에 대한 정제 효소 Chi-56A의 안정성을 알아보기 위하여 효소액을 각각의 온도에서 30분간 방치한 후 잔존 활성을 측정하였다. 그 결과, Fig. 6 (B)에서 보는 바와 같이 55℃까지는 거의 100%의 활성을 유지하였고, 65℃에서도 약 90%의 활성을 유지하였다. 65℃ 이상의 온도에서 급격히 효소의 활성의 감소하는 결과를 보였다.
- 그 결과 3개의 서로 다른 활성 band를 확인할 수 있었다. 그 중 하나의 band는 아주 강한 활성을 보였고, 나머지 두 개의 band는 비교적 약한 활성을 보여 Bacillus subtilis JK-56은 chitinase isozyme을 생산하는 것으로 확인되었다. 보고된 바에 의하면 몇몇의 세균이 chitinase isozyme을 생산한다고 한다[2,3,5].
- 부산 경남 일원에서 채집한 토양 시료를 증류수에 현탁하여 적당히 희석한 다음 colloidal chitin이 함유된 분리용 배지에 도말하여 투명환을 생성한 균주를 1차로 100여 균주를 분리하였다. 그 중에서 chitinase 활성을 측정한 결과, 활성이 가장 높은 56번 균주를 2차로 선별하여 편의상 JK-56이라 명명하였다. Fig.
- 8에서 보는 바와 같이 (GlcNAc)2는 거의 분해하지 않았다. 그리고 (G1cNAc)4와 (GlcNAc)6의 경우에도 Fig. 8 (D)와 (F)의 결과로 보아 분해산물로(GlcNAc)2만이 생성되는 것을 확인하였다. 또한 Fig.
- 33g/L였다. 그리고 pH 6.0에서 최대의 활성을 나타내었고, 산성 범 위보다 알칼리 범위 에서 안정한 것으로 나타났다. 또한 Mn2+ 존재 하에서 높은 활성을 나타내었고 Co2+와 Mg2+ 존재 하에서도 활성이 약간 증가한 반면에 Hg2+ 존재 하에서는 상당한 저해를 받았다.
- 특이한 것은 pH 11~12에서 상당히 안정함을 보였는데 이것은 아마도 phosphate의 영향이 아닌가 생각된다. 그리고 대체적으로 산성 쪽에서보다는 염기성 쪽에서 더 안정한 것으로 확인되었다. 효소 활성 최적 pH에 대한 결과는 Fig.
- 0에서 최대의 활성을 나타내었고, 산성 범 위보다 알칼리 범위 에서 안정한 것으로 나타났다. 또한 Mn2+ 존재 하에서 높은 활성을 나타내었고 Co2+와 Mg2+ 존재 하에서도 활성이 약간 증가한 반면에 Hg2+ 존재 하에서는 상당한 저해를 받았다. Chito 올리고당에 대한 분해 산물을 HPLC로 확인해 본 결과, 짝수개의 올리고당의 분해산물은 (GlcNAc)2만을 생산하였고 홀수개의 올리고당에 대해서는 GlcNAc와 (GlcNAc)2를 생산하는 것으로 비환원성 말단으로부터 이당체인 diacetyl chitobiose((GlcNAc)2)를 생산하는 exo형 chitinase로 추정된다.
- 0, 배양온도 37℃에서 가장 많은 효소를 생산하였다. 본 균주가 생산하는 chitinase를 정제하기 위해서 native-PAGE를 이용해 효소활성 band를 확인한 결과, 1개의 강한 활성 band와 2개의 약한 활성 band를 가지는 isozyme으로 확인되었다. 확인된 isozyme을 정제한 결과, isozyme 중 1개의 강한 활성 band를 정제하였고 정제된 효소를 Chi-56A라고 명명하였다.
- 3으로 확인되었다. 본 효소는 65℃까지 상당히 안정하였으며, 효소의 최대활성 온도도 65℃로 확인되는 등 열에 대해 상당히 안정한 효소로 확인되었다. Collidal chitin에 대한 정제효소 Chi-56A 의 Km값은 17.
- 분리 균주 JK-56으로부터 genomic DNA를 분리하여 27f-1492r primer를 사용하여 16S rDNA 부위를 PCR로 증폭 시킨 후 auto-sequence를 이용해 염기서열을 결정하고 균주의 결정된 425개의 염기서열을 Gene bank database와 비교한 결과, Bacillus subtilis strain 09와 100%의 상동성을 보였다.
- 1(B)의 전자현미경(transmission electron microscope ; TEM)상의 사진으로 볼 때, 그람양성균의 전형적인 막대 모양으로 포자는 한쪽으로 치우쳐 있었다. 세포의 크기는 JK-56 균주가 Bacillus subtilis에 비해서 조금 작은 것으로 나타났다. Table 2에서 보는 바와 같이 citrate 이용능과 gelatin 가수분해 외에 나머지 특성은 Bacillus subtilis와 거의 흡사한 결과를 보였다.
- 14배의 정제도로서 약 40% 가량의 높은 수율로 정제가 이루어졌다. 이와 같이 높은 수율로 정제가 가능한 것은 ammonium sulfate로 침전시킨 후 Prep Cell을 이용한 두 단계의 정제로 단백질의 손실을 최소화할 수 있었고, 또한 염석, 투석 후의 sample에 Chi-56A의 band가 다른 효소의 band에 비해 상당히 진하게 나타나는 것으로 보아 원래 상층액 자체에서 Chi-56A가 차지하는 비율이 상당히 높은 것으로 생각되어진다. 따라서 본 균주로 정제 효소를 생산한다면 지금 시판되고 있는 고가의 chitinase를 대체하여 저렴하게 공급할 수 있을 것으로 기대된다.
- 토양으로부터 chitinase를 생성하는 균주를 분리하여 동정한 결과 Bacillus subtilis로 판명되었으며, 분리한 균주를 Bacillus subtilis JK-56이라 명명하였다. B.
- 본 균주가 생산하는 chitinase를 정제하기 위해서 native-PAGE를 이용해 효소활성 band를 확인한 결과, 1개의 강한 활성 band와 2개의 약한 활성 band를 가지는 isozyme으로 확인되었다. 확인된 isozyme을 정제한 결과, isozyme 중 1개의 강한 활성 band를 정제하였고 정제된 효소를 Chi-56A라고 명명하였다. Chi-56A의 효소 특성에 관해서 실험한 결과 분자량은 약 53kDa, pl는 4.
- 그리고 대체적으로 산성 쪽에서보다는 염기성 쪽에서 더 안정한 것으로 확인되었다. 효소 활성 최적 pH에 대한 결과는 Fig. 6 (C)에서 보는 바와 같이 pH 6의 phosphate buffer에서 가장 높은 활성을 보였다. 효소활성에서도 pH 안정성과 마찬가지로 염기성 쪽에서 더욱 높은 활성을 보였다.
후속연구
- 이와 같이 높은 수율로 정제가 가능한 것은 ammonium sulfate로 침전시킨 후 Prep Cell을 이용한 두 단계의 정제로 단백질의 손실을 최소화할 수 있었고, 또한 염석, 투석 후의 sample에 Chi-56A의 band가 다른 효소의 band에 비해 상당히 진하게 나타나는 것으로 보아 원래 상층액 자체에서 Chi-56A가 차지하는 비율이 상당히 높은 것으로 생각되어진다. 따라서 본 균주로 정제 효소를 생산한다면 지금 시판되고 있는 고가의 chitinase를 대체하여 저렴하게 공급할 수 있을 것으로 기대된다.
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