선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구는 전통발효식품인 김치로부터 단백질 분해 효소 생산성이 우수한 B. subtilis 균주를 분리하고 효소활성의 특성 및 균주의 성장특성을 조사하였다.
제안 방법
- 염색체 DNA를 주형으로 27F(5'-AGAATTTGATCMTGGCTCAG-3')와 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT3') 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행한 후 증폭한 16S rRNA 유전자의 염기서열을 확보하였다[32]. BLAST (NCBI, USA)를 이용하여 기존에 보고된 균주와의 상동성을 근거로 동정하였다[31].
- NaCl 농도에 따른 대조구와 KCCM43059 균주의 균체성장을 비교하여 내염성을 평가하였다(Fig. 4). KCCM43059 균주는 1%의 NaCl이 함유된 TSA 평판배지에서 가장 우수한 성장을 나타내었으며, 2%의 NaCl이 함유된 TSA 평판배지 에서도 성장이 확인되었다.
- 균주의 생육특성을 조사하기 위하여 TSB 배지에 초기 세포흡광도(OD600)가 0.1이 되도록 접종한 후 다양한 온도에서 배양하여 대수 증식기에서 비성장속도를 측정하였다. 배지의 pH 변화가 균체성장에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 완충용액을 사용하여 배지의 pH를 조정한 후 최적 배양온도에서 비성장속도를 측정하였다.
- 배양액을 원심분리(15,115 × g, 5분)하여 얻은 상등액은 단백질 농도 및 효소활성 측정을 위한 조효소액으로 사용하였다. 단백질 분해 효소활성의 정량적 측정은 Cupp-Enyard 등의 방법[29]을 일부 변형하여 사용하였다. 인산염 완충액 (50 mM, pH 7.
- 대조구 및 B. subtilis KCCM43059 균주의 탄소원 대사능 및 균주가 보유한 효소계의 특성을 조사하였다. 대조구 및 KCCM43059 균주 모두 ribose, glucose, fructose, esculine, maltose, saccharose, trehalose 등의 탄소원을 대사하는 것으로 나타났다(Table 1).
- 대조구 및 KCCM43059 균주를 37℃에서 24시간 동안 배양하여 원심분리한 후 얻은 상등액을 이용하여 다양한 반응 온도 및 pH에서 효소활성을 측정하였다. 완충용액의 pH를 7.
- 대조구 및 김치로부터 분리한 균주 8점을 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 원심분리(15,000 × g, 10분)하였으며 회수한 상등액을 이용하여 단백질 분해 효소활성을 측정하였다(Fig. 1).
- 반응조건에 따른 효소활성을 비교하기 위하여 반응온도를 25−70℃ 범위로 조정하였으며, 50 mM citric acid-sodium citrate buffer (pH 3.0), acetic acid-sodium acetate buffer (pH 4.0−5.0), phosphate buffer (pH 6.0−8.0), glycine-sodium hydroxide buffer (pH 9.0−10.0)로 반응 pH를 조절하여 효소 활성을 측정하였다[30].
- 강원도(평창, 진부, 대관령, 양구, 삼척, 동해), 경상도(예천, 대구, 부산, 울산, 영덕, 울진), 제주 및 충남 지역에서 김치를 비롯한 전통 발효식품을 수집하였다. 발효식품 1g과 9 ml의 펩톤수(BD Diagnostic, USA)를 혼합하여 적정 배수로 희석한 후 skim milk (1%, BD Diagnostic, USA)가 포함된 Tryptic Soy Agar (TSA; BD Diagnostic, USA) 평판배지에 도말하였다. 도말한 배지는 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 투명환(clear zone)을 형성하는 균주 8점을 확보하였다[1].
- 1이 되도록 접종한 후 다양한 온도에서 배양하여 대수 증식기에서 비성장속도를 측정하였다. 배지의 pH 변화가 균체성장에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 완충용액을 사용하여 배지의 pH를 조정한 후 최적 배양온도에서 비성장속도를 측정하였다.
- 숙성 김치의 염도를 고려하여 0, 1, 2, 3%의 NaCl이 함유 된 TSB 배지를 사용하여 균주를 배양하였다[33, 34]. 대수기로 성장하고 있는 균주 배양액을 적정배수로 희석한 후 TSA 평판배지에 10 μl를 점적하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.
- 연구에서는 김치 유래의 B. subtilis 균주의 단백질 분해 효소활성 및 균주의 성장특성을 구명하였다. 최근에도 고초균의 생육특성 및 단백질 분해 효소활성 특성에 관한 연 구가 지속적으로 보고되고 있으며[1, 41, 42], 추가연구를 통하여 산업적으로 활용이 가능한 균주로서 개발이 기대된다.
- 염색체 DNA를 주형으로 27F(5'-AGAATTTGATCMTGGCTCAG-3')와 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT3') 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행한 후 증폭한 16S rRNA 유전자의 염기서열을 확보하였다[32].
대상 데이터
- 도말한 배지는 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 투명환(clear zone)을 형성하는 균주 8점을 확보하였다[1]. B. subtilis KCTC13112 균주를 한국미생물자원센터(KCTC, Korea)로부터 분양받아 대조구 균주로 사용하였다.
- MBE/ L865 균주의 효소활성은 146.20 ± 3.09 U/mg protein으로 대조구로 사용한 B. subtilis KCTC13112 균주의 효소활성 (56.34 ± 7.18 U/mg protein)의 약 2.6배에 해당하는 높은 효소활성을 나타내어 최종 균주로 선정하였다.
- 전국에서 수집한 발효식품으로부터 단백질 분해 효소활성을 보유한 균주를 분리하였다. Skim milk를 첨가한 TSA 평판배지에서 투명환을 형성한 8점의 균주 중 김치에서 분리 된 MBE/L865 균주가 대조구인 KCTC13112 균주에 비하여 약 2.6배의 효소활성을 나타내었으며 Bacillus subtilis로 동정하여 한국미생물보존센터에 KCCM43059 균주로 기탁하였다. B.
- 강원도(평창, 진부, 대관령, 양구, 삼척, 동해), 경상도(예천, 대구, 부산, 울산, 영덕, 울진), 제주 및 충남 지역에서 김치를 비롯한 전통 발효식품을 수집하였다. 발효식품 1g과 9 ml의 펩톤수(BD Diagnostic, USA)를 혼합하여 적정 배수로 희석한 후 skim milk (1%, BD Diagnostic, USA)가 포함된 Tryptic Soy Agar (TSA; BD Diagnostic, USA) 평판배지에 도말하였다.
- 단백질 분해 효소활성의 정량적 측정은 Cupp-Enyard 등의 방법[29]을 일부 변형하여 사용하였다. 인산염 완충액 (50 mM, pH 7.5)에 casein (BD Diagnostic, USA)의 농도가 0.65% (w/v)가 되도록 용해한 것을 기질 용액으로 사용하였다. 1 ml의 기질용액에 200 μl의 조효소액을 혼합하여 37℃ 에서 10분간 반응한 후, 1 ml의 110 mM trichloroacetic acid 를 첨가하여 반응을 종료하였다.
- 전국에서 수집한 발효식품으로부터 단백질 분해 효소활성을 보유한 균주를 분리하였다. Skim milk를 첨가한 TSA 평판배지에서 투명환을 형성한 8점의 균주 중 김치에서 분리 된 MBE/L865 균주가 대조구인 KCTC13112 균주에 비하여 약 2.
데이터처리
- 모든 측정은 3회 반복하였으며 통계처리는 SPSS Statistics(v. 22, IBM, USA)를 사용하여 Duncan의 다중범위검정법으로 유의성을 검정하였다[35]
이론/모형
- 분리된 균주를 5 ml의 TSB 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후 Sim과 Kim [36] 방법으로 염색체 DNA를 추출하였다. 염색체 DNA를 주형으로 27F(5'-AGAATTTGATCMTGGCTCAG-3')와 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT3') 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행한 후 증폭한 16S rRNA 유전자의 염기서열을 확보하였다[32].
- 탄소원 대사 및 균주가 보유한 효소계의 특성을 조사하기 위하여 API 50 CHB Kit (BioMérieux, France) 및 API ZYM kit (BioMérieux, France)를 제조사에서 제시한 방법 에 따라 사용하였다.
성능/효과
- 6배의 효소활성을 나타내었으며 Bacillus subtilis로 동정하여 한국미생물보존센터에 KCCM43059 균주로 기탁하였다. B. subtilis KCCM43059 균주의 최적 배양조건은 37℃, pH 8으로 대조구인 KCTC13112 균주의 비성장속도보다 우수하였다. 반응조건 60℃, pH 6에서 429.
- 4). KCCM43059 균주는 1%의 NaCl이 함유된 TSA 평판배지에서 가장 우수한 성장을 나타내었으며, 2%의 NaCl이 함유된 TSA 평판배지 에서도 성장이 확인되었다. 그러나 대조구 균주는 NaCl의 첨가에 의하여 성장이 현저히 감소하였으며, 3%의 NaCl이 함유된 배지에서는 두 균주 모두 성장이 어려운 것으로 나타났다.
- KCCM43059 균주는 alkaline phosphatase, crystine arylamidase 등의 효소활성을 보유하는 것으로 나타내었으며, 대조구 균주는 trypsin, β-glucosidase 등의 효소활성을 나타내어 두 균주가 서로 다른 특성을 나타내었다.
- stearothermophilus 균주에 비해 우수한 단백질 분해 효소활성을 나타내었다[36]. MBE/L865 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석한 결과 B. subtilis KFP17 (GenBank Accession No. KT380826.1) 균주와 가장 높은 상동성(99%)을 나타내어 한국미생물보존센터에 B. subtilis KCCM43059로 기탁하였다.
- 그러나 대조구 균주는 NaCl의 첨가에 의하여 성장이 현저히 감소하였으며, 3%의 NaCl이 함유된 배지에서는 두 균주 모두 성장이 어려운 것으로 나타났다. 결과적으로 KCCM43059 균주가 대조구 균주에 비하여 상대적으로 내염성이 우수한 것으로 판단하였다.
- 06(1/h)로 대조구 균주에 비하여 높은 비성장속도를 나타내었다. 결과적으로 KCCM43059 균주는 배양온도 37℃, pH 8에서 가장 높은 비성장속도를 나타내었다.
- KCCM43059 균주는 1%의 NaCl이 함유된 TSA 평판배지에서 가장 우수한 성장을 나타내었으며, 2%의 NaCl이 함유된 TSA 평판배지 에서도 성장이 확인되었다. 그러나 대조구 균주는 NaCl의 첨가에 의하여 성장이 현저히 감소하였으며, 3%의 NaCl이 함유된 배지에서는 두 균주 모두 성장이 어려운 것으로 나타났다. 결과적으로 KCCM43059 균주가 대조구 균주에 비하여 상대적으로 내염성이 우수한 것으로 판단하였다.
- 대조구 및 KCCM43059 균주 모두 ribose, glucose, fructose, esculine, maltose, saccharose, trehalose 등의 탄소원을 대사하는 것으로 나타났다(Table 1). 그러나 대조구 균주는 glycerol, arabinose, xylose, mannose, inositol, mannitol, sorbitol 등을 탄소원으로 이용할 수 있는 것으로 나타나 김치에서 분리된 KCCM43059 균주에 비해 상대적으로 더 많은 종류의 탄소원을 대사하는 것으로 판단되었다. 김치로부터 분리된 Bacillus sp.
- subtilis KCCM43059 균주의 탄소원 대사능 및 균주가 보유한 효소계의 특성을 조사하였다. 대조구 및 KCCM43059 균주 모두 ribose, glucose, fructose, esculine, maltose, saccharose, trehalose 등의 탄소원을 대사하는 것으로 나타났다(Table 1). 그러나 대조구 균주는 glycerol, arabinose, xylose, mannose, inositol, mannitol, sorbitol 등을 탄소원으로 이용할 수 있는 것으로 나타나 김치에서 분리된 KCCM43059 균주에 비해 상대적으로 더 많은 종류의 탄소원을 대사하는 것으로 판단되었다.
- 대조구 및 KCCM43059 균주가 보유한 효소활성을 조사한 결과 esterase, lipase, acid phosphatase, α-glucosidase 등의 효소활성을 보유하고 있는 것으로 나타났다(Table 2).
- KCCM43059 균주는 alkaline phosphatase, crystine arylamidase 등의 효소활성을 보유하는 것으로 나타내었으며, 대조구 균주는 trypsin, β-glucosidase 등의 효소활성을 나타내어 두 균주가 서로 다른 특성을 나타내었다. 따라서 김치에서 분리된 KCCM43059 균주는 16S rRNA 유전자의 염기서열은 B. subtilis 균주와 높은 상동성을 나타내었으나 탄소원 대사특성과 균주가 보유한 효소계는 상이한 것으로 판단되었다.
- 65 U/mg protein의 최적 효소활성을 나타내었으며 동일조건에서 대조구 균주보다 효소활성이 우수하였다. 또한 B. subtilis KCCM43059 균주는 대조구 균주에 비하여 NaCl에 상대적으로 높은 내성을 나타내었다.
- 반응온도 60℃에서 pH에 따른 효소활성의 변화를 측정한 결과 KCCM43059 균주의 효소활성은 pH 6 에서 429.37 ± 18.65 U/mg protein로 대조구 균주(313.74 ± 11.41 U/mg protein)보다 높은 효소활성을 나타내었다(Fig. 2B).
- 반응온도가 증가할수록 KCCM43059 균주의 효소활성이 유의적으로 증가하였으며 60℃에서 가장 높은 효소활성(367.64 ± 33.07 U/mg protein)을 나타내었다.
- 반응조건 60℃, pH 6에서 429.37 ± 18.65 U/mg protein의 최적 효소활성을 나타내었으며 동일조건에서 대조구 균주보다 효소활성이 우수하였다.
- 배양온도 40℃부터 KCCM43059 균주의 비성장 속도가 감소하였으며 55℃에서의 비성장속도는 1.42 ± 0.10 (1/h)로 대조구인 KCTC13112 균주(1.63 ± 0.03 (1/h))보다 낮은 비성장속도를 나타내었다.
- 배지 pH 7.3에서 배양온도를 달리하여 대조구 및 KCCM43059 균주의 비성장속도를 측정한 결과, KCCM43059 균주의 비성장속도는 2.00 ± 0.02(1/h) 로 대조구인 KCTC13112 균주(1.74 ± 0.04(1/h))보다 높은 비성장속도를 나타내었다 (Fig. 3A).
- 완충용액의 pH를 7.5로 고정하고 반응온도를 달리하여 효소활성을 측정한 결과 대조구 및 KCCM43059 균주는 25℃에서 각각 33.41 ± 8.38, 58.61 ± 9.80 U/mg protein 으로 가장 낮은 단백질 분해 효소활성을 나타내었다(Fig. 2A).
- 이 생산하는 단백질 분해 효소들의 온도에 대한 활성은 알칼리 효소가 60℃, 중성 효소는 30−37℃에서 최적 활성을 나타낸다고 보고되어[38], 본 연구에서 분리한 KCCM43059 균주가 생산하는 단백질 분해효소 경우 60℃에서 최적 활성을 나타내는 알칼리 효소라고 판단하였다.
- 56 U/mg protein)보다 유의적으로 낮은 효소 활성을 나타내었다. 이러한 결과로부터 B. subtilis KCCM43059 균주는 반응온도 60℃, pH 6 조건에서 가장 높은 단백질 분해 효소활성을 나타내는 것으로 판단되었다.
후속연구
- subtilis 균주의 단백질 분해 효소활성 및 균주의 성장특성을 구명하였다. 최근에도 고초균의 생육특성 및 단백질 분해 효소활성 특성에 관한 연 구가 지속적으로 보고되고 있으며[1, 41, 42], 추가연구를 통하여 산업적으로 활용이 가능한 균주로서 개발이 기대된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.