췌장 콜레스테롤 에스터레이즈 저해제로서의 계피 추출물레 혈중 콜레스테롤 농도에 미치는 영향 Plasma Cholesterol-Lowering Effects of Cinnamomi cortex Extract as an Inhibitor of Pancreatic Cholesterol Esterase원문보기
췌장에서 분비되는 콜레스테롤 에스터레이즈(pCEase)와 소장의 acyl coenzyme A:cholesterol acyltransferase (ACAT)는 흡수된 콜레스테롤을 다시 ester화하는데 관여한다. 한방재료 중 순환촉진작용 및 건위작용 등을 가지는 계피(Cinnamomi cortex)의 에탄올 추출물이 in vitro에서 pCEase 활성에 대하여 강한 저해작용을 보였으며 에탄올 추출물의 용매분획 중 클로로포름분획이 다른 분획들, 즉 에틸 아세테이트분획, 부탄올분획 및 물 분획보다 저해활성이 강하였다. 계피의 클로로포름분획이 고콜레스테롤식 이를 섭취시킨 rat에서 혈중 콜레스테롤치를 저하시키는 효과가 있는지 측정한 실험에서 클로로포름분획을 150 mg/kg 섭취시켰을 경우 고콜레스테롤식이만은 투여한 대조군에 비하여 총cholesterol 함량이 25.1% 감소하였으며, HDL-cholesterol 함량도 33.4$\pm$1.82 g/dl로 정상군 수준으로 회복되었고 동맥경화지수 역시 현저하게 감소된 것으로 나타났다. 콜레스테롤 생합성에 관여하는 효소인 HMG-CoA reductase 활성을 측정한 결과, 고콜레스테롤 식이에 의해 감소되었던 활성이 계피 클로로포름분획의 투여량을 증가시킬수록 증가하였으나 150 mg/kg 투여군 에서도 정상군에 비하여 유의적인 감소를 보였다. 또한 계피 클로로포름분획의 독성검사 결과, mouse에서 LD$_{50}$ 은 1,300 mg/kg으로 산출되었다.
췌장에서 분비되는 콜레스테롤 에스터레이즈(pCEase)와 소장의 acyl coenzyme A:cholesterol acyltransferase (ACAT)는 흡수된 콜레스테롤을 다시 ester화하는데 관여한다. 한방재료 중 순환촉진작용 및 건위작용 등을 가지는 계피(Cinnamomi cortex)의 에탄올 추출물이 in vitro에서 pCEase 활성에 대하여 강한 저해작용을 보였으며 에탄올 추출물의 용매분획 중 클로로포름분획이 다른 분획들, 즉 에틸 아세테이트분획, 부탄올분획 및 물 분획보다 저해활성이 강하였다. 계피의 클로로포름분획이 고콜레스테롤식 이를 섭취시킨 rat에서 혈중 콜레스테롤치를 저하시키는 효과가 있는지 측정한 실험에서 클로로포름분획을 150 mg/kg 섭취시켰을 경우 고콜레스테롤식이만은 투여한 대조군에 비하여 총cholesterol 함량이 25.1% 감소하였으며, HDL-cholesterol 함량도 33.4$\pm$1.82 g/dl로 정상군 수준으로 회복되었고 동맥경화지수 역시 현저하게 감소된 것으로 나타났다. 콜레스테롤 생합성에 관여하는 효소인 HMG-CoA reductase 활성을 측정한 결과, 고콜레스테롤 식이에 의해 감소되었던 활성이 계피 클로로포름분획의 투여량을 증가시킬수록 증가하였으나 150 mg/kg 투여군 에서도 정상군에 비하여 유의적인 감소를 보였다. 또한 계피 클로로포름분획의 독성검사 결과, mouse에서 LD$_{50}$ 은 1,300 mg/kg으로 산출되었다.
Ethanol extract of Cinnamomi cortex inhibited potently cholesterol esterase activity in vitro. Chloroform fraction of ethanol extract showed the stronger inhibitory effect than other solvent fractions - ethylacetate fraction, butanol fraction, and aqueous fraction. The chloroform fraction of Cinnamo...
Ethanol extract of Cinnamomi cortex inhibited potently cholesterol esterase activity in vitro. Chloroform fraction of ethanol extract showed the stronger inhibitory effect than other solvent fractions - ethylacetate fraction, butanol fraction, and aqueous fraction. The chloroform fraction of Cinnamomi cortex was studied as a candidator of plasma cholesterol-lowering material using high cholesterol-fed rats. In high cholesterol-fed rats, the diet with chloroform fraction of 150 mg/kg lowered not only plasma neutral lipids contents 25.1% but also plasma total cholesterol level 49.6% than only high cholesterol diet. Plasma HDL-cholesterol level in Cinnamomi cortex chloroform fraction-fed rats was recovered as those level of normal rats. LD$_{50}$ of Cinnamomi chloroform extract was calculated as 1,300 mg/kg.
Ethanol extract of Cinnamomi cortex inhibited potently cholesterol esterase activity in vitro. Chloroform fraction of ethanol extract showed the stronger inhibitory effect than other solvent fractions - ethylacetate fraction, butanol fraction, and aqueous fraction. The chloroform fraction of Cinnamomi cortex was studied as a candidator of plasma cholesterol-lowering material using high cholesterol-fed rats. In high cholesterol-fed rats, the diet with chloroform fraction of 150 mg/kg lowered not only plasma neutral lipids contents 25.1% but also plasma total cholesterol level 49.6% than only high cholesterol diet. Plasma HDL-cholesterol level in Cinnamomi cortex chloroform fraction-fed rats was recovered as those level of normal rats. LD$_{50}$ of Cinnamomi chloroform extract was calculated as 1,300 mg/kg.
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제안 방법
저해효과를 실험하는 경우 반응 시험관에 미리 저해제를 넣어 질소가스로 건조시키고 완충용액을 넣어 초음파 파쇄기로 균질화시켜 반응시켰다. 37C에서 10분동안 반응시킨 후 1.625 ml의 methanol/chloroform/ heptane (1.41:1.25:1.00) 혼합액과 0.525 ml의 50 mM sodium carbonate/50 mM sodium borate용액 (pH 10.0)으로 반응을 멈추고 실온에서 원심분리한 다음 수용액층 0.75 ml가 포함하는 [14C-1] oleate의 방사능양을 베타선 방사능측정 장치 (TRI-CARB 2100TR, Pachard Instrument Neth- erland)로 측정하였다.
농축하였다. 감압 농축된 에탄올 추출물을 10% 메탄올로 현탁하고 클로로포름, 에틸아세테이트 및 n-부탄올로 단계별 추출하고 농축하여 클로로포름분획, 에틸아세테이트 분획, 부탄올분회 및 물분획을 얻었으며 각 용매 분획들이 pCEase 활성에 미치는 저해효과를 측정하였다.
계피로부터 pCEase활성을 저해하는 물질을 분획하기 위하여 잘게 부순 계피 1 kg을 500 g씩 2 L의 환저 플라스크에 넣고 95% 에탄올 1,000 ml를 가하여 환류 냉각장치를 설치한 후 플라스크내의 용액을 끓이면서 2시간 동안 환류 냉각시키고 여액을 거른 다음 잔사를 다시 에탄올로 2회 반복하여 가열추출하고 여액을 합하여 회전 증발 기로 감압 농축하였다. 감압 농축된 에탄올 추출물을 10% 메탄올로 현탁하고 클로로포름, 에틸아세테이트 및 n-부탄올로 단계별 추출하고 농축하여 클로로포름분획, 에틸아세테이트 분획, 부탄올분회 및 물분획을 얻었으며 각 용매 분획들이 pCEase 활성에 미치는 저해효과를 측정하였다.
따라서 계피의 용매추출물들이 생체내에서 고지혈증 또는 동맥경화증의 억제에 기여할 수 있는지 검토하기 위하여 식이성 고콜레스테롤 혈증을 유발한 흰쥐에서 계피의 추출물 섭취시 혈중 cholesterol 함량, 인지질함량, 중성지질함량 및 HMG-CoA reductase활성을 측정하였으며 in uitro에서의 pCEase 활성저해를 측정하였다.
상등액을 105,000 xg에서 1 시간동안 초원심분리하여 cytosolic fraction과 microsomal fraction으로 나누어 HMG-CoA reductase 활성 측정에 사용하였다. 또한 계피 클로로포름분획의 독성검사를 위하여 30마리의 mouse들 각각에 kg 당 250-2,250 mg의 클로로포름분획을 복강으로 투여한 후 24시간 내에 죽은 개체수를 세어 LD50을 계산하였다.
사용하였다. 또한 고지혈증 유발은 1%의 cholesterol과 0.5% sodium cholate를 함유한 사료(Table 1)로 4주간 사육한 후 마지막 주 1주일간 계피 클로로포름분획을 50 ㎎/㎏, 100 ㎎/㎏ 및 150 ㎎/㎏을 needle zone을 사용하여 구강으로 투여하였다. 투여실험이 끝난 rat는 CO2로 마취시킨 후 복부대동맥으로부터 혈액을 채취한 뒤 원심분리하여 혈청을 얻었다.
5)를 가하여 균질액을 만들고 10, 000 Xg에서 20분 원심분리하였다. 상등액을 105,000 xg에서 1 시간동안 초원심분리하여 cytosolic fraction과 microsomal fraction으로 나누어 HMG-CoA reductase 활성 측정에 사용하였다. 또한 계피 클로로포름분획의 독성검사를 위하여 30마리의 mouse들 각각에 kg 당 250-2,250 mg의 클로로포름분획을 복강으로 투여한 후 24시간 내에 죽은 개체수를 세어 LD50을 계산하였다.
[18] 에 준하였다. 즉, 300 mM KC1, 6 mM EDTA 및 15 mM dithiothretol을 함유한 240 mM potassium phosphate buffer 에 2 mM NADPH 100 μ1, 1 mM HMG-CoA 100 및 100 μ1 효소액을 첨가하여 37℃, 240 run에서 흡광도의 변화를 읽고 분자흡광계수 6.22 mM/cm/L를 이용하여 활성도를 산정하였다. 효소활성의 단위는 1분당 1 mg protein이 분해하는 NADPH의 양을 pmol로 표시하였다.
따랐다. 즉, 소 췌장을 완충용액(50 mM Tris/HCl, pH 7.4, 5 mM EDTA, 2 mM EGTA, 2 mM PMSF 및 0.1 mM DTT)과 함께 균질화하고 13, 000xgoflz-j 원심분리한 후 아세트산으로 pH를 5로 조절하고 침전물을 제거한 후상층액에 (NHeSQ를 가하여 60%포화되게 하였다. 침전된 단백질을 완충용액(20 mM HEPES/NaOH, pH 7.
1 mM DTT)과 함께 균질화하고 13, 000xgoflz-j 원심분리한 후 아세트산으로 pH를 5로 조절하고 침전물을 제거한 후상층액에 (NHeSQ를 가하여 60%포화되게 하였다. 침전된 단백질을 완충용액(20 mM HEPES/NaOH, pH 7.0, 3M KC1, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA 및 0.1 mM DTT) 에 녹인 다음 TSKgel phenyl-5PW 컬럼 (21.5x150 mm, Toso, Japan) 및 TSKgel heparin-5PW 컬럼 (7.5x75 mm, Toso, Japan)으로 정제하여 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 단백질 band를 확인하고 농축한 다음 아래의 효소활성실험에 사용하였다.
대상 데이터
계피 에탄올추출물의 용매분획 중 cholesterol esterase활성을 가장 강하게 저해한 클로로포름분획을 동물실험에 사용하였다. 계피의 클로로포름 분획이 고 콜레스테롤 식이를 섭취한 실험동물에서 혈중 지질의 함량에 미치는 영향을 실험하기 위하여 시료를 섭취시킨 후 혈청중의 인지질, 중성지질 및 콜레스테롤 함량을 측정한 결과는 Table 2 및 3과 같았다.
실험동물로는 대한실험동물센터(충북 음성군 소재) 로부터분양받은 Sprague-Dawley계 rat(체중 210 g 내외)를 일정한 조건(온도 : 24±2℃, 습도 : 55~56%, 명암 : 12 시간 dark/light cycle)에서 적응시킨 후 본 실험에 사용하였다. 또한 고지혈증 유발은 1%의 cholesterol과 0.
2)Values sharing the same superscript letter are not significantly different each other (p<0.05) by Duncan's multiple range test.
실험동물은 한 group당 8마리씩으로 하였고, 본 실험에서 얻어진 결과는 평균치 ± 표준편차로 표시하였으며 통계적 유의성 검증은 Duncan's multiple range test를 이용하였다.
이론/모형
HMG-CoA reductase 활성의 측정은 Kleinsek 등의 방법 [18] 에 준하였다. 즉, 300 mM KC1, 6 mM EDTA 및 15 mM dithiothretol을 함유한 240 mM potassium phosphate buffer 에 2 mM NADPH 100 μ1, 1 mM HMG-CoA 100 및 100 μ1 효소액을 첨가하여 37℃, 240 run에서 흡광도의 변화를 읽고 분자흡광계수 6.
pCEase 효소활성 및 저해효과의 측정은 조 등[1]의 방법에 따랐다. 즉, 100 μ1 반응혼합물은 방사선동위원소로 표식 된 cholesteryl [14C-1] oleate 20, 000 cpm, 10 "M cholesteryl oleate, 10 "M phosphadidyl choline, 100 mM sodium cholate, 50 mM Tris/HCl, pH 8.
신선한 소 췌장으로부터 pCEase의 정제는 Lee의 방법 [13]에 따랐다. 즉, 소 췌장을 완충용액(50 mM Tris/HCl, pH 7.
혈청중 HDL-C (high density lipoprotein-cholesterol) 의함량은 Noma 등의 효소법 [17]에 의하여 조제된 kit (AM 203-K, Asan)를 사용하여 측정하였고 LDL-C (low density lipoprotein-cholesterol) 의 함량과 VLDL-C (very low density lipoprotein-cholesterol) 의 함량은 Friclewald 등의 방법 [3]에 따라 다음의 식에 의하여 산출하였다.
혈청중의 총 cholesterol 힘-량의 측정은 Richmond 등의 효소법 [18]에 의하여 조제된 kit (AM 202-K, Asan)를, 인지질 함량은 Goodwin의 방법[5]에 준하여 조제된 kit (latron Chem. Co.)를 사용하여 측정하였고 중성지질의 함량은 McGowan 등의 방법 [15]에 준하여 조제된 kit (AM 157S-K, Asan)를 사용하여 측정하였다. 모든 지질의 함량은 검량선에 준하여 mg/dl로 표시하였다.
성능/효과
1% 정도 감소하였으나 50 ㎎/㎏ 및 100 ㎎/㎏ 투여는 총 콜레스테롤 함량에 거의 영향을 주지 않았다. LDL-cholesterol + VLDLcholesterol의 함량도 식이성 고지혈증 유도시 약 65.2% 증가하였으나 계 피 클로로포름분획 을 100 ㎎/㎏, 150 mg/kg 투여시에 정상군 수준까지는 낮아지지 않았으나 고지혈증 유도군 대비 각각 34.3% 및 49.6%가 감소하였다. 또한 혈중 HDL-cholesterol의 함량도 33.
개발된 phenoxyphenyl c*?a] rbamate WAY-121, 898를 0.04% 식이성 콜레스테롤을 섭취시킨 rat에게 섭취시켰을 때 혈중 콜레스테롤이 10% 감소하였으며, ACAT 저해제인 CI-976을 0.025% 함께 섭취시킨 경우 45%의 감소를 보여 cholesterol esterase 저해제 및 ACAT 저해제를 혼합하여 섭취시키면 혈중 콜레스테롤의 저해효능이 우수하여진다고 하였다.
1과 같았다. 각 분획 10 ㎍이 200 ng의 pCEase의 활성을 저해한 정도는 클로로포름 분획은 78%, 에틸아세테이트 분획은 27%, 부탄올 분획은 29%이었으며 물 분획의 경우 거의 저해하지 않는 것으로 나타났다. 김 등[9]은 초 두 구의 클로로포름 분획 및 에틸아세테이트 분획이 같은 농도의 pCEase활성을 각각 91% 및 80% 저해한다고 하였으며 전 등[2이은 빈랑자의 경우 n-부탄올 분획 및 물 분획 이 pCEase활성을 가장 강하게 저해하였다고 하였다.
계피 클로로포름추출물의 독성시험을 행한 결과는 Table 5와 같으며 250 ㎎/㎏에서는 mouse 30마리 모두 이상이 없었으나 500 ㎎/㎏에서 6마리가 죽었으며 1,000 ㎎/㎏ 과 1,500 ㎎/㎏ 투여하였을 때는 각각 12마리 및 18마리가 죽었고 1, 750 ㎎/㎏ 투여군에서는 30마리 모두 죽었으므로 LD50은 1, 300 ㎎/㎏인 것으로 산출되었다. 독성이 없는 수준인 150 ㎎/㎏의 계피 클로로포름분획이 고콜레스테롤혈증을 유발시킨 쥐의 혈중 콜레스테롤 및 중성지질의 함량을 감소시켰으므로 계피의 추출물은 고지혈증 또는 동맥경화증의 억제에 기여할 수 있을 것으로 사료된다.
같았다. 고콜레스테롤 식이를 섭취한 실험군 의 HMG-CoA redu- ctase활성이 정상군에 비하여 약 24.2% 정도 감소된 것으로 나타났다. 계피 클로로포름분획을 50 ㎎/㎏, 100 ㎎/㎏ 및 150 ㎎/㎏ 처리한 군에서도 정상군에 비하여 유의적인 감소를 보이기는 하였지만 계피 클로로포름분획의 투여량을 증가시킬수록 HMG-CoA reductase 활성이 증가하는 것은 초두구의 경우와 비슷하였다.
65 mg/dl로 많은 증가를 보였으나 계피 클로로포름분획 처리군에서는 투여량이 증가할수록 감소하는 경향을 보였다. 고콜레스테롤식이를 섭취한 실험군에서는 총 콜레스테롤의 함량이 정상군에 비해 약 58.5% 증가하였고 계피 클로로포름분획을 150 ㎎/㎏ 투여시 고지혈증 유도군에 비하여 25.1% 정도 감소하였으나 50 ㎎/㎏ 및 100 ㎎/㎏ 투여는 총 콜레스테롤 함량에 거의 영향을 주지 않았다. LDL-cholesterol + VLDLcholesterol의 함량도 식이성 고지혈증 유도시 약 65.
이와 같은 결과는 계피 클로로포름분획에 의한 혈중 콜레스테롤의 저하가 콜레스테롤 생합성의 율속효소인 HMG-CoA reductase 활성저해에 의한 것은 아니라고 추정할 수 있다. 또한 in uitro에서 pCEase 저해 활성을 가진 계피의 클로로포름분획이 고콜레스테롤식이를 섭취시킨 rat의 혈중 지질 및 총 cholesterol 함량을 감소시켰으므로 이러한 결과들로부터 우리는 소장에서의 pCEase 활성저해, 콜레스테롤의 re- esterification의 저해 또는 ACAT 의 활성 저해 등에 의한 콜레스테롤 흡수 저하가 혈중 콜레스테롤 농도 저하의 원인이 될 수 있다는 가정을 할 수 있었다.
6%가 감소하였다. 또한 혈중 HDL-cholesterol의 함량도 33.4±1.82 mg/dl로 정상군 수준으로 회복되었으며 동맥경화지수도 고지혈증 유도로 정상군에 비하여 약 2.7배 증가되던 것이 계피 클로로포름분 획을 처리함으로써 현저하게 감소되었다.
본 실험에서는 166종의 한방재료를 에탄올로 추출하여 pCEase 활성 저해제를 screening하던 중 이미 보고한 빈랑자[6], 마황[1], 초두구[9] 등과 함께 계수나무과(Gn-namomum cassia Blume) 또는 그 밖의 동속식물(녹나무과 Lauraceae)S] 수피 인 계피 (Gnwmomi cortex) 의 추출물에 췌장 cholesterol esterase를 저해하는 물질이 존재함을 발견하였다. 따라서 계피의 용매추출물들이 생체내에서 고지혈증 또는 동맥경화증의 억제에 기여할 수 있는지 검토하기 위하여 식이성 고콜레스테롤 혈증을 유발한 흰쥐에서 계피의 추출물 섭취시 혈중 cholesterol 함량, 인지질함량, 중성지질함량 및 HMG-CoA reductase활성을 측정하였으며 in uitro에서의 pCEase 활성저해를 측정하였다.
계피의 클로로포름 분획이 고 콜레스테롤 식이를 섭취한 실험동물에서 혈중 지질의 함량에 미치는 영향을 실험하기 위하여 시료를 섭취시킨 후 혈청중의 인지질, 중성지질 및 콜레스테롤 함량을 측정한 결과는 Table 2 및 3과 같았다. 혈중 인지질의 함량은 계피 클로로포름분획 처리군에서 별다른 영향이 없었고, 중성지질의 경우, 정상군에서는 75.4 ±5.07 mg/dl 이었으며 고콜레스테롤식이를 섭취한 실험군에서는 111.5±4.65 mg/dl로 많은 증가를 보였으나 계피 클로로포름분획 처리군에서는 투여량이 증가할수록 감소하는 경향을 보였다. 고콜레스테롤식이를 섭취한 실험군에서는 총 콜레스테롤의 함량이 정상군에 비해 약 58.
후속연구
독성이 없는 수준인 150 ㎎/㎏의 계피 클로로포름분획이 고콜레스테롤혈증을 유발시킨 쥐의 혈중 콜레스테롤 및 중성지질의 함량을 감소시켰으므로 계피의 추출물은 고지혈증 또는 동맥경화증의 억제에 기여할 수 있을 것으로 사료된다.
최근 개발된 WAY-121, 751과 WAY-121, 898은 pCEase를 효과적으로 저해하여 콜레스테롤을 급여한 동물들의 고 콜레스테롤혈증 유발을 억제하고 간의 콜레스테롤 에스터 레이즈(hCEase)까지도 저해한다고 하였으며[16] 전 등[6]은 빈랑 자의 에탄올 추출물 및 용매분획들은 in uitro에서 콜레스테롤 에스터레이즈 활성을 저해하였을 뿐 아니라 고콜레스테롤식이와 함께 흰쥐에게 섭취시켰을 때 소장에서의 콜레스테롤 흡수를 저해하였고 혈중 콜레스테롤 농도를 감소시켰다고 보고하였다. 이와 같이 pCEase의 약리학적 저해는 cholesterol 흡수의 저해를 가져오고 그로 인한 plasma cholesterol 농도의 감소를 초래하므로 콜레스테롤의 섭취가 증가하는 현대인에게 있어서 콜레스테롤 에스터 레이즈 활성을 저해하는 약물 또는 기능성 식품의 개발은 고콜레스테롤혈증을 예방하는데 크게 기여하리라 사료된다.
참고문헌 (9)
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