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문제 정의
- 또한 methyl red(MR)와 "Voges-Proskauer(VP)에 대하여 해수와 불가사리 장내에서 분리된 일부 세균들이 양성 반응을 보이는 것으로 보아 장내 세균이 존재하는 것을 암시하고 있다. 그 밖에도 indole test, nitrate test, citrate, β-galactosidase, 탈탄산 효소시험(arginine, lysine, ornithine), phenylalanine deaminase, urease 등 장내세균의 존재를 파악하는 데 필요한 test에 대해 반응을 나타냄으로서 장내세균의 존재 가능성을 뒷받침해 주고 있다.
- 최근 불가사리는 연근해 패류 및 굴 양식장을 황폐화시키는 주범으로서 뿐만 아니라 신물질을 탐색하는 대상으로 국내에서도 주목을 받고 있다. 따라서 본 연구는 불가사리 장내에 서식하는 종속영양세균의 균체수와 탄소원의 이용특성을 살펴 보았다.
제안 방법
- 본 실험에서 사용된 아무르 불가사리는 2000년 7월 14일에 전라남도 장흥군 안양면 수문리 인근 연안에서 채집하였다. 또한 해수 시료는 불가사리가 채집된 주변 수역에서 Niskin 채수기로 채수하여 멸균된 채수병에 넣은 후 이를 유지하는 얼음상자에 보관하여 실험실로 운반하여 분석하였다.
- 0pt">℃에서 7일간 배양한 후 균체수를 계수하였다. 또한, 불가사리 장내에 분포하는 종속영양세균 수의 측정은 불가사리의 내장을 1g 채취하여 9ml의 생리식염수에 넣고 vortex로 교반하여 균질한 현탁액을 만들었다. 현탁액은 다시 멸균된 희석액에 1/10 단위로 희석한 다음 Bacto Marine Agar 2216(Difco, Detroit, USA) 배지에 도말하여 25±2 실험실로 옮겨진 해수 시료는 생리식염수(0.85% NaCl)로 희석한 다음 Bacto Marine Agar 2216(Difco, Detroit, USA) 배지에 도말하여 25土2℃에서 7일간 배양한 후 균체수를 계수하였다. 또한, 불가사리 장내에 분포하는 종속영양세균 수의 측정은 불가사리의 내장을 1g 채취하여 9ml의 생리식염수에 넣고 vortex로 교반하여 균질한 현탁액을 만들었다.
- 해수 및 불가사리의 장내에서 순수 분리된 세균은 형태학적(Gram 염색, 운동성) 및 생리(온도별 및 염분농도에 따른 생장 여부) 생화학적(oxidase 외 15종) 특성을 조사하였다.
- 해수와 불가사리의 장내에서 순수 분리된 세균은 BiOLOG GN2, GP2 (BiOLOG, MicroLog™ System, Release 4.0) Kit를 사용하여 동정하였으며, 동정된 그람음성균과 그람양성균을 대상으로 탄소원 이용에 대하여 알아보았다.
대상 데이터
- 불가사리와 해수에서 분리된 세균들 중 그람음성균이 탄소원에 대해 높은 이용률을 보였다. 그 중 glucose는 조사 균주 모두가 이용하였으며, sucrose, mannose, maltose, trehalose는 불가사리와 해수에서 분리한 세균의 70% 이상이 이용한 탄소원이었다. 하지만 adipate, phenyl acetate는 불가사리에서 분리된 그람음성균에서는 전혀 이용하지 못하였다(Fig.
- 본 실험에서 사용된 아무르 불가사리는 2000년 7월 14일에 전라남도 장흥군 안양면 수문리 인근 연안에서 채집하였다. 또한 해수 시료는 불가사리가 채집된 주변 수역에서 Niskin 채수기로 채수하여 멸균된 채수병에 넣은 후 이를 유지하는 얼음상자에 보관하여 실험실로 운반하여 분석하였다.
성능/효과
- 9%가 간균)(6)보다는 낮은 값이었다(Table 1). 그람염색법에 의한 균의 형태를 살펴보면, 본 조사 해역에서는 그람음성균이 43.2%로 측정되었는데 이는 본 연구에서 조사된 균수가 비교적 적어 그람음성균의 수가 일반적으로 해수에서 조사된 비율보다는 상대적으로 낮게 나타난 것으로 사료된다. 반면에 불가사리의 장내에서는 45.
- 1%로 나타나 대부분 호기성이거나, 통성혐기성 세균이 존재하는 것을 보여주고 있다(Table 1). 또한 oxidase에 대한 양성반응은 불가사리와 해수에서 각각 20.8%, 54.1%로 나타나 해수보다 불가사리 장내에서 호기성 세균이 더 적음을 알 수 있다. 또한 methyl red(MR)와 "Voges-Proskauer(VP)에 대하여 해수와 불가사리 장내에서 분리된 일부 세균들이 양성 반응을 보이는 것으로 보아 장내 세균이 존재하는 것을 암시하고 있다.
- 하지만 이러한 해양척추동물과 무척추동물의 표피와 장내에 분포하는 미생물의 수와 형태는 측정방법에 따라 많은 차이를 보여 아직까지 논란의 여지가 있다. 본 실험의 경우, 불가사리 장내에 분포하는 균체수는 해수에 분포하는 균체수보다는 대체로 더 높은 값을 보여주는데 이는 위에서 언급한 것과 같이 측정단위가 달라 균체수를 비교하는 것은 다소 무리가 있지만 미생물의 생존에 영향을 주는 환경요인의 변화가 해수보다 불가사리 장내가 낮기 때문인 것으로 사료된다.
- 조사기간 중 순수 분리한 종속영양세균은 해수에서는 37균주(그람음성균 16균주, 그람양성균 21균주), 불가사리 장내에서는 24균주(그람음성균 11균주, 그람양성균 13 균주)였다. 본 연구에서 분리 동정된 균들의 형태학적 특성을 살펴보면, 해수에서 분리된 균들의 86.5%가, 불가사리의 장내에서는 70.8%가 간균으로 나타났는데, 이는 서천 인근 퇴적토에서 분리한 결과(90.1 〜95.9%가 간균)(6)보다는 낮은 값이었다(Table 1). 그람염색법에 의한 균의 형태를 살펴보면, 본 조사 해역에서는 그람음성균이 43.
- 불가사리와 해수에서 분리된 세균들 중 그람음성균이 탄소원에 대해 높은 이용률을 보였다. 그 중 glucose는 조사 균주 모두가 이용하였으며, sucrose, mannose, maltose, trehalose는 불가사리와 해수에서 분리한 세균의 70% 이상이 이용한 탄소원이었다.
- 조사기간 중 분리한 종속영양세균은 불가사리 장내에서는 동정된 균체수는 24균주로 이들 중 그람음성균이 11균주, 그람양성균이 13균주였다. 불가사리의 장내에서 출현한 속은 Rahnella, Francisella, Pasteurella, Vibrio, Acinetobacter, Actino bacillus, Haemophilus, Erwinia, Tsukamurella, Staphylococcus, Corynebacterium, Aureobacterium, Micrococcus, Bacillus, Alloio- coccus, Microbacterium, Lactococcus로 5과 17속으로 동정되었다(Table 2). 이들 중 Vibrio, Staphylococcus, Corynebacterium은 2균주 이상 동정되었다.
- 생리학적 특성을 살펴보면, 해수와 불가사리의 장내에서 분리된 균이 모두 4~37℃에서 75-100% 성장하여 중온성(meso phile) 세균의 특성을 보여준다. 염분에 대한 적응성은 대체로 높았고 염의 농도가 2〜5%에서 잘 자라는 것으로 보아 본 연구에 서 분리된 세균들은 약한 호염성에 속한다고 볼 수 있다(17).
- 생화학적 특성을 살펴보면, catalase에 대한 양성반응은 불가사리와 해수에서 각각 54.2%, 54.1%로 나타나 대부분 호기성이거나, 통성혐기성 세균이 존재하는 것을 보여주고 있다(Table 1). 또한 oxidase에 대한 양성반응은 불가사리와 해수에서 각각 20.
- 0pt">℃에서 75-100% 성장하여 중온성(meso phile) 세균의 특성을 보여준다. 염분에 대한 적응성은 대체로 높았고 염의 농도가 2〜5%에서 잘 자라는 것으로 보아 본 연구에 서 분리된 세균들은 약한 호염성에 속한다고 볼 수 있다(17).
- 조사기간 중 분리한 종속영양세균은 불가사리 장내에서는 동정된 균체수는 24균주로 이들 중 그람음성균이 11균주, 그람양성균이 13균주였다. 불가사리의 장내에서 출현한 속은 Rahnella, Francisella, Pasteurella, Vibrio, Acinetobacter, Actino bacillus, Haemophilus, Erwinia, Tsukamurella, Staphylococcus, Corynebacterium, Aureobacterium, Micrococcus, Bacillus, Alloio- coccus, Microbacterium, Lactococcus로 5과 17속으로 동정되었다(Table 2).
- 조사기간 중 순수 분리한 종속영양세균은 해수에서는 37균주(그람음성균 16균주, 그람양성균 21균주), 불가사리 장내에서는 24균주(그람음성균 11균주, 그람양성균 13 균주)였다. 본 연구에서 분리 동정된 균들의 형태학적 특성을 살펴보면, 해수에서 분리된 균들의 86.
- 이러한 세균 군집의 탄소원에 대한 이용능의 차이는 주로 개체군의 수와 종 조성의 구별을 나타내는 지표로 사용된다(14, 23). 한편 그람양성균에 의한 탄소원의 이용률을 살펴보면, glucose가 가장 높은 이용률을 나타냈고, 그 다음 fructose, trehalose, manitol 등이 높게 나타났으며, arabinose, raffinose, melibiose, lactose 등은 불가사리에서는 15.4-23.1%, 해수에서는 14.3-42.9%로 비교적 낮은 이용률을 보였다(Fig. 3). 따라서 그람음성균과 양성균은 glucose를 제외하고는 서로 다른 형태의 탄소원을 이용하고 있는 것을 알 수 있다.
- 한편 불가사리의 장내에 분포하는 종속영양세균의 평균 균체수는 8.65土0.65 X 103 cfu•g-1로 측정단위가 달라 해수에 분포하는 균체수와 비교하기는 어려우나 대체로 주변 해수에서 분포하는 균체수보다는 다소 높은 값을 보였다(Fig. 1). 하지만 이 러한 측정값은 혀가자미(Dover sole) 미성어의 내장에서 측정된 5.
- 8%로 나타나 주변 해수보다는 다소 높은 값을 보였다. 한편 운동성은 해수와 불가사리에서 분리된 균들 중 각각 29.7%, 20.8%로 해수에 존재하는 세균들이 불가사리에 존재하는 세균들보다 운동성이 더 높게 나타났다. 하지만 이러한 비율은 대산 연안에서 분리한 균들에 비해 낮은 값이었다(2).
후속연구
- BiOLOG MicroPlate를 이용한 세균 군집의 탄소원 이용능 분석은 군집간의 대사적 다양성의 비교분석과 한 생태계 내에서의 환경 요인의 변화에 따른 미생물 군집의 생리대사적 변화 양상을 분석하는데 매우 유용한 방법이라 사료되고(5), 이 방법을 통하여 토양, 육수 및 해양 등의 많은 특정 생태계를 대상으로 미생물 군집 수준의 구조적 특성을 파악하는데 이용할 수 있다(21, 22). 이러한 연구는 앞으로 불가사리에 천적으로 이용될 수 있는 세균을 탐색하는데 필요한 기초자료로 사용할 예정이다.
- 따라서 그람음성균과 양성균은 glucose를 제외하고는 서로 다른 형태의 탄소원을 이용하고 있는 것을 알 수 있다. 이와 같이 그람음성균과 양성균에 따라 탄소원 이용에 대한 차이를 보이는 원인에 대하여서는 앞으로 좀 더 연구할 과제이다. BiOLOG MicroPlate를 이용한 세균 군집의 탄소원 이용능 분석은 군집간의 대사적 다양성의 비교분석과 한 생태계 내에서의 환경 요인의 변화에 따른 미생물 군집의 생리대사적 변화 양상을 분석하는데 매우 유용한 방법이라 사료되고(5), 이 방법을 통하여 토양, 육수 및 해양 등의 많은 특정 생태계를 대상으로 미생물 군집 수준의 구조적 특성을 파악하는데 이용할 수 있다(21, 22).
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