Bacillus pumilus TX703 유래 Xylanase 유전자(xynK)의 Cloning과 염기서열 분석 Molecular Cloning and Analysis of Nucleotide Sequence of Xylanase Gene (xynk) from Bacillus pumilus TX703원문보기
Xylanase를 생산하는 내열성 Bacillus pumilus TX703의 chromosomal DNA로부터 xylanase 유전자를 cloning하여 그 염기배열 순서를 결정한 다음 이로부터 유전자 발현에 관련된 구조를 분석하였다. Xylanase 유전자의 cloning을 위해 제한효소 HindIII로 절단한 B. pumilus TX703의 chromosomal DNA와 pUC19을 ligation시켜 E. coli DH5 $\alpha$에 형질전환시킨 후 형질전환체 중에서 xylanase 활성을 나타내는 재조합 plasmid pXES106을 분리하였다. 재조합 plasmid pXES106은 pUC19의 HindIII 부위 내에 2.24 kb의 외래 DNA가 삽입되었고, 이 plasmid DNA를 분리하여 E. coli DH5 $\alpha$에 재형질전환시킨 결과 vector 내에 xylanase 유전자가 cloning되었음을 확인하였다. Cloning된 유전자의 염기배열을 분석한 결과 이 유전자의 총 크기는 2,187 bp였고 이는 409개기 아미노산을 coding 하는 open reading frame 1,227 bp를 포함하고 있었다. 이 염기배열은 ATG개시 codon으로부터 각각 193과 216 base 상류에 TTTAAT의 -10 box와 TCGAAA인 -35 box로 추정되는 염기배열이 존재하였고 -10 box로부터 7 bp하류에 전사개시점인 A가 위치하고 있었다. 또한, 개시 codon으로부터 432 bp 상류에 공통염기배열과 14개의 염기 중 11개의 염기가 일치하는 TGATGGCGTCGGCA의 catabolite responsive element (CRE)가 존재하였다. B. pumilus TX703의 xylanase와 아미노산배열의 유사성이 가장 높은 xylanase는 Hordeum vulgare의 isozyme X-I이었고 본 xylanase는 208번째와 322번째에 glutamic acid 잔기를 가지고 있어 Clostridium thermocellum, Dictyoglomus thermophilum, Thermotoga neapolitana 등에서 밝혀진 바와 같이 glutamic acid 부위가 xylanase의 활성부위라 여겨진다.
Xylanase를 생산하는 내열성 Bacillus pumilus TX703의 chromosomal DNA로부터 xylanase 유전자를 cloning하여 그 염기배열 순서를 결정한 다음 이로부터 유전자 발현에 관련된 구조를 분석하였다. Xylanase 유전자의 cloning을 위해 제한효소 HindIII로 절단한 B. pumilus TX703의 chromosomal DNA와 pUC19을 ligation시켜 E. coli DH5 $\alpha$에 형질전환시킨 후 형질전환체 중에서 xylanase 활성을 나타내는 재조합 plasmid pXES106을 분리하였다. 재조합 plasmid pXES106은 pUC19의 HindIII 부위 내에 2.24 kb의 외래 DNA가 삽입되었고, 이 plasmid DNA를 분리하여 E. coli DH5 $\alpha$에 재형질전환시킨 결과 vector 내에 xylanase 유전자가 cloning되었음을 확인하였다. Cloning된 유전자의 염기배열을 분석한 결과 이 유전자의 총 크기는 2,187 bp였고 이는 409개기 아미노산을 coding 하는 open reading frame 1,227 bp를 포함하고 있었다. 이 염기배열은 ATG개시 codon으로부터 각각 193과 216 base 상류에 TTTAAT의 -10 box와 TCGAAA인 -35 box로 추정되는 염기배열이 존재하였고 -10 box로부터 7 bp하류에 전사개시점인 A가 위치하고 있었다. 또한, 개시 codon으로부터 432 bp 상류에 공통염기배열과 14개의 염기 중 11개의 염기가 일치하는 TGATGGCGTCGGCA의 catabolite responsive element (CRE)가 존재하였다. B. pumilus TX703의 xylanase와 아미노산배열의 유사성이 가장 높은 xylanase는 Hordeum vulgare의 isozyme X-I이었고 본 xylanase는 208번째와 322번째에 glutamic acid 잔기를 가지고 있어 Clostridium thermocellum, Dictyoglomus thermophilum, Thermotoga neapolitana 등에서 밝혀진 바와 같이 glutamic acid 부위가 xylanase의 활성부위라 여겨진다.
A gene coding for xylanase from thermo-tolerant Bacillus pumilus TX703 was cloned into Escherichia coli DH5 $\alpha$ using pUC19. Among 7,400 transformants, four transformants showed clear zones on the detection agar plates containing oat-spells xylan. One of them which showed highest xyl...
A gene coding for xylanase from thermo-tolerant Bacillus pumilus TX703 was cloned into Escherichia coli DH5 $\alpha$ using pUC19. Among 7,400 transformants, four transformants showed clear zones on the detection agar plates containing oat-spells xylan. One of them which showed highest xylanase activity was selected and its recombinant plasmid, named pXES106, was found to carry 2.24 kb insert DNA fragment. When the nucleotide sequence of the cloned xylanase gene (xynK) was determined, xynK gene was found to consist of 1,227 base-pair open reading frame coding for a polypeptide of 409 amino acids with a deduced molecular weight of 48 kDa. The coding sequence was preceded by a putative ribosome binding site, the transcription initiation signals, and cia-acting catabolite responsive element. The deduced amino acids sequence of xylanase is similar to those of the xylanases from Hordeum vulgare (barley) and Clostridium thermocellum, with 39 and 31% identical residues, respectively. The amino acids sequence of this xylanase was quite different from those of the xylanases from other Bacillus species.
A gene coding for xylanase from thermo-tolerant Bacillus pumilus TX703 was cloned into Escherichia coli DH5 $\alpha$ using pUC19. Among 7,400 transformants, four transformants showed clear zones on the detection agar plates containing oat-spells xylan. One of them which showed highest xylanase activity was selected and its recombinant plasmid, named pXES106, was found to carry 2.24 kb insert DNA fragment. When the nucleotide sequence of the cloned xylanase gene (xynK) was determined, xynK gene was found to consist of 1,227 base-pair open reading frame coding for a polypeptide of 409 amino acids with a deduced molecular weight of 48 kDa. The coding sequence was preceded by a putative ribosome binding site, the transcription initiation signals, and cia-acting catabolite responsive element. The deduced amino acids sequence of xylanase is similar to those of the xylanases from Hordeum vulgare (barley) and Clostridium thermocellum, with 39 and 31% identical residues, respectively. The amino acids sequence of this xylanase was quite different from those of the xylanases from other Bacillus species.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 토양으로부터 분리한 xylanase 생산 내열성 Bacillus 균주의 chromosomal DNA로부터 xylanase 유전자를 cloning하여 그 염기배열순서를 결정한 후 이로부터 전사, 번역 등 유전자 발현에 관련된 구조를 분석하여 xylanase 유전자의 구조와 발현과의 관계를 해석하고자 하였다.
coli 세포로부터 재조합 DNA를 분리한 다음 여러 가지 제한효소로 절단하여 전기영동을 실시함으로써 xylanase 유전자의 제한효소지도를 작성하였다. 이 결과에 근거하여 제한효소로 절단한 여러가지 유전자 단편을 pUC19 plasmid vector에 ligation시 켜 재조합 plasmid DNA를 제조한 후 각 subclone에 대한 염기배열순서를 결정하기 위한 실험을 행하였다. Xylanase 유전자의 염기 배열 순서 결정 은 한국과학기 술연구원 생 명 공학연구소 게 놈사업 단에 의뢰하여 ABI 자동염 기분석 기로 수행하였으며 Mac Molly DNA 분석 program을 사용하여 분석하였다.
제안 방법
25% xylene cyanol FF, 40% (w/v) sucrose)을 가한 DNA 용액을 100 V에서 40분간 전기영동한 후 254 nm의 자외선 조명하에서 관찰하였다. Agarose gel로부터 DNA 단편의 회수는 BiolOl사의 Geneclean Kit을 사용하여 수행하였다. DNA 단편을 함유하고 있는 agarose gel로부터 원하는 크기의 DNA 단편을 잘라내고 6 M의 sodium iodide를 DNA 단편의 3배량을 넣고 gel이 녹을 때까지 50℃에서 방치하였다.
E. c로부터 plasmid DNA를 신속분리하기 위하여 miniscreen법 [28]을 변형하여 사용하였다. 하룻밤 배양한 LB 배양액 1.
PXES106 재조합 DNA의 제한효소지도를 작성하기 위하여 xylanase 유전자가 함유된 형질전환체로부터 재조합 plasmid DNA인 pXES106을 분리한 후 여러 가지 제한효소로 절단한 다음 agarose gel 전기영동에 의해 DNA 단편의 크기를 분석하였다. 그 결과 삽입 DNA에는 BamH I, Bgl II, Kpn I, Pst I, Pvu I, Sa/1, Sma I, Xba I, Xho I 절단부위가 존재하지 않았고 Hindffl 절단부위가 4개 존재하였으며 EcoRI, PvuU 절단부위가 각각 1개씩 존재함을 알 수 있었다.
Xylanase를 생산하는 내열성 Bacillus pumilus TX703 의사 iromosomal DNA로부터 xylanase 유전자를 cloning하여 그 염기배열 순서를 결정한 다음 이로부터 유전자 발현에 관련된 구조를 분석하였다, Xylanase 유전자의 cloning을 위해 제한효소 Hindin로 절단한 B. pumilus TX703의 chro mosomal DNA 와 pUC19을 liation시 켜 E, coli DH5 a 에 형질전환시킨 후 형질전환체 중에서 xylanase 활성을 나타내는 재조합 plasmid pXES106 분리하였다. 재조합 plas mid pXES106은 pUC19의 Hindin 부위 내에 2.
예는 30여종이 있다. 본 xylanase 유전자의 발현 산물인 단백질의 아미노산 서열이 다른 생물 유래의 xylanase 아미노산 서열과 얼마나 유사성이 있는지 알아보기 위하여 Gen-Bank d* atabase 검색한 후 CLUSTALW program을 이용하여 homology alignment를 작성 한 결과를 Fig. 4에 나타내었다. 여러 xylanase 중에서 본 연구에 사용된 B.
Competent cell 100 에 200 ng 의 ligated DNA> 포함하고 있는 ligation mixture를 혼합하여 섞어준 후 0℃에서 40분간 방치하였다 42℃에서 2분 간 heat shock를 가한 후 LB 배지를 1 ml 넣고 37℃에서 90 분간 250 rpm으로 배양시켜 유전자를 발현시킨 뒤 LB/ Ap/X-Gal/IPTG 배지에 도말하여 37℃에서 하룻밤동안 배양시켰다. 생성된 white colony를 재조합체로 선정하여 분석하였다.
선별한 재조합 E. coli 세포로부터 재조합 DNA를 분리한 다음 여러 가지 제한효소로 절단하여 전기영동을 실시함으로써 xylanase 유전자의 제한효소지도를 작성하였다. 이 결과에 근거하여 제한효소로 절단한 여러가지 유전자 단편을 pUC19 plasmid vector에 ligation시 켜 재조합 plasmid DNA를 제조한 후 각 subclone에 대한 염기배열순서를 결정하기 위한 실험을 행하였다.
E.의 형질전환을 위한 competent cell은 Hanahan의 방법 [13]을 변형하여 조제하였다. LB 한천 평판 배지에 보존된 E.
전기영동 완충용액으로는 TAE 완충용액 (40 mM Tris acetate, pH 8.0, 1 mM EDTA)을 사용하였으며 0.5 g/ml의 ethidium bromide를 첨가한 0.8% (w/v)의 agarose 수평 gel을 사용하여 1/5배량의 5x gel loading 완충용액 (0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF, 40% (w/v) sucrose)을 가한 DNA 용액을 100 V에서 40분간 전기영동한 후 254 nm의 자외선 조명하에서 관찰하였다. Agarose gel로부터 DNA 단편의 회수는 BiolOl사의 Geneclean Kit을 사용하여 수행하였다.
표준곡선은 D-xylose를 0.1 jimol 사용하였고, 효소 1 U는 주어진 조건에서 분당 1 nmol의 D-xylose를 생성할 수 있는 효소의 양으로 정하였다.
coli DH5a 에 형질전환 시켰다. 형질전환체들 중에서 외래 DNA가 삽입된 white colony를 0.5% oat-spelts xylan이 함유된 LB 한천배지에 replica 한 후 Dvycloserine (X10, 240 mg/40 ml in 10 mM Tris-HCl, pH 8.0) 0.5 ml를 4.5 ml의 top agarose (1% bacto-tryptone, 0.8% NaCl, 0.8% agarose)와 혼합하여 plate 에 overlay한 후 6시간 동안 37℃ 에 배양하여 세포를 용균 시킴으로써 세포내 효소를 방출시킨 다음 형질전환체 주위에 투명환을 생성하는 colony를 xylanase 유전자가 삽입된 형질전환체로 선별하였다.
대상 데이터
coli 형질전환을 위한 액체배양에는 LB 배지[3이를 사용하였다. E. coli 형질전환체의 선별에는 LB/Ap/X-Gal/IPTG 배지[3이를 사용하였고 xylanase 유전자를 함유한 E. coli 재조합체의 검색에는 LB 한천 평판배지에 0.5%의 oat-spelts xylan이 첨가된 xylanase 탐색 배지를 사용하였다. 배지에 첨가한 ampicillin은 최종농도가 100/ml가 되도록 첨가하였다.
Plasmid DNA의 분리와 E. coli 형질전환을 위한 액체배양에는 LB 배지[3이를 사용하였다. E.
Bio.Rad사 제품, 1 kb DNA laddei는 Life Technologies 사 제품을 사용하였다. 또한 가iromosomal DNA 분리는 Promega사.
본 연구에 사용된 xylanase 유전자의 공여균주로는 토양으로부터 분리한 내 열성 Bacillus pumilus TX703 [2기을 사용하였고 형질전환을 위한 숙주균주로는 E. coli DH5q 이를 사용하였으며 cloning을 위 한 vector DNA로는 pUC19 [40]을 사용하였다.
또한 가iromosomal DNA 분리는 Promega사.의 Wizard Genomic DNA Purification System을 구입하여 사용하였으며 agarose gel로부터 DNA의 용출에는 Biol이사의 GenedeanII Kit을 사용하였다.
데이터처리
이 결과에 근거하여 제한효소로 절단한 여러가지 유전자 단편을 pUC19 plasmid vector에 ligation시 켜 재조합 plasmid DNA를 제조한 후 각 subclone에 대한 염기배열순서를 결정하기 위한 실험을 행하였다. Xylanase 유전자의 염기 배열 순서 결정 은 한국과학기 술연구원 생 명 공학연구소 게 놈사업 단에 의뢰하여 ABI 자동염 기분석 기로 수행하였으며 Mac Molly DNA 분석 program을 사용하여 분석하였다.
이론/모형
효소의 활성 측정은 Somogyi-Nelson의 환원당 정량법 [34]에 의하여 수행하였다. 1%의 xylan 용액 (oat-spelts xylan in 10 mM Tris-HCl, pH 8.
성능/효과
B. pumilus TX703의 chromosomal DNA로부터 xylanase 유전자를 cloning하기 위하여 약 7, 400 주의 E. coli 형질전환체를 0.5% xylan이 함유된 LB 한천배지에 배양시킨 결과 colony 주위에 투명환을 생성하는 4 균주를 얻었고 각각 No. 1, No. 2, No. 4, No. 9로 명명하였다 (data not shown). 이들 4 균주로부터 plasmid DNA를 분리한 후 Hdm로 절단하여 전기영동에 의하여 삽입된 DNA의 크기를 분석한 결과 No.
또한, 개시 codon으로부터 432 bp 상류에 공통염기배열과 14개의 염기 중 11개의 염기가 일치하는 TGATGGCGTCGGCA 의 catabolite responsive dement (CRE)가 존재하였다. B. pumilus TX703의 xylanase 와 아미노산배열의 유사성이 가장 높은 xylanase는 Hordeum의 isozyme X-I 이었고 본 xylanase는 208번째와 322번째에 glutamic acid 잔기를 가지고 있어 Clostridium thermocellum, Diciyoglomus thermophilum, Themwtoga neapolitana 등에서 밝혀진 바와 같이 glutamic acid 부위가 xylanase의 활성부위라 여겨진다.
ClorWng된 DNA 단편 내에 존재하는 xylanase 유전자의 open reading frame을 검색하기 위하여 DNA 단편상의 염기 배열순서를 분석한 결과 이 DNA 단편에는 ATG 개시 codon으로 시작되는 1, 227 bp의 open reading frame 한 개가 존재함을 알 수 있었다. 일반적으로 xylanase의 분자량은 평균 40 kDa으로 알려져 있고 이를 유전자의 크기로 환산하면 대략 1 kb 정도가 되기 때문에 이 open reading frame 이 xylanase를 coding하는 frame으로 결론지 었고 1, 227 bp 의 크기를 갖는 이 xylanase 유전자를 iK라 명명하였다
circulansv} 생산하는 xylanase의 활성부위에는 Glu과 Gh?72가 관여한다고 보고하였고 Clostridium thermocellum [46], Dictyoglomus thermophilum [23], Thermotoga neapolitana [39] 둥에서도 glutamic acid 부위가 xylanase의 활성부위에 존재한다고 보고된 바 있다. Fig. 4에서 비교한 xylanase 모두 B. pumilus TX703의 xylanase의 208번째와 322번째 위치에 glutamic acid를 지니고 있어 이 부위가 현재까지 보고된 xylanase의 활성부위와 일치함을 알 수 있었다.
Xylanase는 대부분의 Bacillus 세포이서 영양세포 단계에서 생합성되어 분비되므로 영양세포단계의 유전자 발현에 관계하는 인자가 관여하는 것으로 알려져 있다 [33], 본 xylanase 유전자의 염기배열에서 <rA 인자가 인식하는 pro-moter 구역을 Mac Molly DNA 분석 프로그램을 이용해 검색해 본 결과 Fig. 2에서와 같이 ATG 개시 codon으로부터 각각 193과 216 base 상류에 -10 box와 -35 box로 추정되는 공통염기 배열의 존재를 확인하였으며 또한 -10 box로부터 7 bp 하류에 전사개시점인 A가 위치함을 알 수 있었다. TTTAAT의 염기서열을.
분석하였다. 그 결과 삽입 DNA에는 BamH I, Bgl II, Kpn I, Pst I, Pvu I, Sa/1, Sma I, Xba I, Xho I 절단부위가 존재하지 않았고 Hindffl 절단부위가 4개 존재하였으며 EcoRI, PvuU 절단부위가 각각 1개씩 존재함을 알 수 있었다. pXES106 DNA의 제한효소지도는 Fig.
본 xylanase 유전자의 염기배열을 기초로 작성된 hydrop athy plot을 살펴본 결과 Fig. 3에 나타난 바와 같이 본 유전자로부터 생합성되는 단백질은 친수성 부분이 월등히 많은 경향을 나타내고 있으며 말단 부분에 소수성 부분이 없는 것으로 확인되었다. 이것은 Lee 등[2이이 실험한 B.
본 연구에서 분석한 xynK 유전자의 염기배열에서는 ATG 개시 codon으로부터 432 bp 상류에 존재하는 TGATGGCG- TCGGCA 배열이 CRE로 추정되었는데 공통염기배열과는 14개의 염기중 11개의 염기가 일치되고 있었다. 본 실험에 사용된 B.
4에 나타내었다. 여러 xylanase 중에서 본 연구에 사용된 B. pumilus TX703의 xylana&e 와 가장 유사성 이 높은 xylanwse는 Hordeum vulgare 유래의 xylanase isozyme X-1 으로 39%의 아미노산이 동일하였다. Wakarchuk 둥 [41]은 B.
4를 선택하여 본 연구에 사용하였다. 이 균주로부터 plasmid DNA를 분리하여 E. coli DH5a 에 재형질전환시킨 결과 모든 형질전환체가 투명환을 나타내어 vector 내에 xylanase 유전자가 cloning되었음을 확인하였고 이 재조합 plasmid DNA를 pXES106으로 명명하였다.
9로 명명하였다 (data not shown). 이들 4 균주로부터 plasmid DNA를 분리한 후 Hdm로 절단하여 전기영동에 의하여 삽입된 DNA의 크기를 분석한 결과 No. 1과 No. 2의 삽입 DNA 단편은 각각 6 kb와 12 kb였고 No. 4와 No. 9은 삽입 DNA의 크기가 2.3 kb였으며 제한효소 절단 형태도 동일하여 No. 4와 No. 9은 동일 DNA 단편이 삽입된 것으로 판단되었다. 이들 재조합 균주의 xylanase 효소활성을 측정한 결과 No.
pumilus TX703의 chro mosomal DNA 와 pUC19을 liation시 켜 E, coli DH5 a 에 형질전환시킨 후 형질전환체 중에서 xylanase 활성을 나타내는 재조합 plasmid pXES106 분리하였다. 재조합 plas mid pXES106은 pUC19의 Hindin 부위 내에 2.24 kb의 외래 DNA가 삽입되었고, 이 plasmid DNA를 분리하여 E. coli DH5 a 에 재 형 질전환시 킨 결과 vector 내에 xylanase 유전자가 cloning되었음을 확인하였다.
제한효소지도 작성 후 cloning된 xylanase 유전자가 함유된 DNA 단편의 염기배열순서를 결정하기 위하여 여러 가지 제한효소로 절단한 DNA 단편들을 pUC19에 subcloning 한 후 제조한 subclone들의 염기배열순서결정을 수행한 결과 Fig. 2에 나타낸 바와 같이 xylanase 유전자를 함유한 삽입 DNA의 크기는 2, 187 bp로 확인되었다.
후속연구
XA는 위에 설명한 분비단백질들이 지니고 있는 C말단 targeting sinal을 가지고 있지 않으나 C-말단에 a-helical 구조를 지니고 있다. 본 xynK 유전자의 공여 균주인 B. pumilus TX703은 xylanase를 균체 외로 분비하지만 [27] xylanse의 C-말단에 targeting sig1을 지니고 있지 않은 것으로 확인되어 본 효소가 어떤 기작에 의해 분비되는지 연구할 필요성이 있다고 사료된다.
염기중 11개의 염기가 일치되고 있었다. 본 실험에 사용된 B. pumilus TX703의 xylanase 효소에 대한 catabolite repression 기작을 연구하기 위해서는 site-directed mutag enesis 등의 연구방법을 통해 cis-acting 부위를 조사하는 것이 필요하며 본 균주로부터 catabolite repression에 관여하는 frans-acting 조절단백질을 생합성하는 유전자의 분리가 요구된다.
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