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문제 정의
- 또 자유산소라디칼 등에 의하여 야기되는 통증 치료 등 소염 진통제나 피부보호를 위한 화장품 첨가제로 그 이용범위가 넓어 SOD 자체 뿐만 아니라 유사한 활성을 보이는 저분자 물질의 탐색(4, 11) 이나합성에 의한 활성 분자의 개발도 연구되고 있다(6). 본 연구에서는 해양 미생물을 대상으로 SOD의 생산을 효율적으로 탐색하는 방법을 사용하여 고역가 SOD 생산 균주를 획득하고 이로부터 분리정제 및 효소 특성 조사에 새로운 재료로 SOD의 이용 가능성을 연구하였다.
제안 방법
- Late exponential phase에 도달한 균주를 0.2 /jm pore size의 tangential flow filter (3, 500 cm2 surface, Amicon Co., Beverly, USA)를 이용하여 21로 농축시키고 High speed centrifuge (Vision Science Co., Seoul, Korea)로 15,000Xg에서 20 분간 원심분리하여 균체를 수확하였다. 100 g정도의 균체를 얻은 후 여기에 미리 4℃로 식혀둔 900 ml의 buffer (5 mM phosphate buffer, 10mM EDTA, pH 7.
- 2 ml polypropylene tube에 넣고 여기에 미리 준비된 멸균된 해수를 1 ml 씩 가하여 일회용 homogenizere- 잘게 분쇄한 뒤 상층액을 평판 배지에 순차적으로 도말하는 방법으로 해양생물 공생 미생물등 생물체내에 함유된 균주를 분리하였다. 균주를 분리하기 위한 배지로서는 세균의 경우는 주로 ZoBell 배지(0.5% peptone, 0.1% yeast extract, agar 15g//, 숙성해수 50%, pH 7.0) 및 Sea Water Complete 배지 (0.5% Bacto tryptone, 0.3% yeast extract, 0.3% (v/v) glycerol, agar 15 g/l, 숙성해수 75%, pH 7.0)를 사용하였다. 형성된 균체 집락들을 육안으로 그 집락 형태를 관찰하여 특성에 따라 새로운 고형 배지에 접종하여 동일 형태의 순수 집락을 형성하도록 3 일간 25℃에서 배양한 후 순수 분리하였다.
- 0) 을 가하여 잘 섞어준 후 25℃에서 형광등으로 빛을 쬐어 25 분간 방치한다. 반응물에 각각 1 ml에씩의 naphthyl amine 용액 (7 mM, 4.2 M acetic acid 함유)과 sulfanilic acid 용액 (20 mM, 4.2 M acetic acid 함유)을 가하고 20 분 후 spectrophotometer (Milton-Roy MR-3000, Rochester, USA)를 이용하여 530nm에서 흡광도를 측정한다. SOD activity=[A530nm (sample)「'-[A530nm (control)「'으로 결정하였다.
- 이는 해양조건이 대체로 낮은 온도를 유지하고 있고 이 온도에서는 산소의 용해도가 높아져 전반적으로 높은 산소 분압에 노출되어 있다는 사실과 연관이 있는 것으로 추정된다. 본 균주의 최적 배지 선정을 위하여 ZoBell, Sea water complete, 75% sea water LB 배지 등을 사용하여 성장과 단위 균체당 SOD 활성을 검사한 growth curve를 구한 결과 Sea water complete가 가장 우수한 배지로 밝혀져 이를 주 배양 배지로 사용하였다. 균체를 SWC 배지에서 배양한 결과 배양 20 시간에서 최대의 효소 활성도를 보였으며 이 때의 건조 균체량은 3.
- 우선 필요한 것이 지속적으로 superoxide radical을 형성하는 방법과 형성된 superoxide radical과 쉽게 반응하여 발색 등 검출을 쉽게 하는 물질이 필요한데 superoxide radical 형성을 위해서는 xanthine/xanthine oxidase (1), alkaline dimethyl sulfoxide (2) 등의 방법이 사용되고 superoxide radical과 반응하여 검출될 수 있는 물질로는 cytochrome C, nitro blue tetrazolium (NBT) 등이 사용된다. 본 연구에서는 superoxide radical 형성을 위하여 FMN 과 EDTA를 사용한 photochemical reduction을 사용하였고 superoxide radical과 반응하는 물질로는 hydroxyamine을 선택하였다. 반응의 원리는 다음과 같다.
- 0)를 가하여 VC에서 1 시간동안 교반 시킨다. 세포파괴를 보다 확실히 하기 위하여 초음파분쇄기 (VCX-500, Sonic and Material, Danbury, USA)를 이용하여 얼음물에 담근 상태에서 1분간 초음파를 가하고 1분간 교반 시키는 과정을 5 회 반복한다. 세포 내 추출물을 분리하고 파괴된 세포 부스러기를 제거하기 위하여 25,000Xg에서 30 분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다.
- 해양생물을 채집한 현장에서 내장 및 조직 생물 시료를 약 1 g 씩 취한 후 2.2 ml polypropylene tube에 넣고 여기에 미리 준비된 멸균된 해수를 1 ml 씩 가하여 일회용 homogenizere- 잘게 분쇄한 뒤 상층액을 평판 배지에 순차적으로 도말하는 방법으로 해양생물 공생 미생물등 생물체내에 함유된 균주를 분리하였다. 균주를 분리하기 위한 배지로서는 세균의 경우는 주로 ZoBell 배지(0.
- 0)를 사용하였다. 형성된 균체 집락들을 육안으로 그 집락 형태를 관찰하여 특성에 따라 새로운 고형 배지에 접종하여 동일 형태의 순수 집락을 형성하도록 3 일간 25℃에서 배양한 후 순수 분리하였다.
대상 데이터
- FMN, hydroxyl amine, Tris base, Tris , HC1, EDTA, sulfanilic acid, acetic acid, 1-naphthyl amine 등은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA)에서 구입하였으며 FMNe DEAE-cellulose ion exchange column chromatography를 이용하여 주가 정제한 후 5 mM 농도로 제조하여 1 ml 씩 나누어 냉동고에 보관하며 사용하였다.
- 분리장소는 거문도, 삼부도, 백도, 거제도, 남해도등 남해 일원을 중심으로 동해안과 서해안을 포함하고 아울러 태평양 심해저 시료와 남극 세종기기 근처 해역의 시료를 대상으로 해양 세균과 방선균을 중심으로 수집하였으며 분리된 균주는 glycerol을 20% 함유한 멸균 해수에 현탁하여 -7(TC에 보관하였다.
- 145 균주였다. 이들 중 가장 효소활성이 우수한 균주는 균주번호 B446과 B328로 이들 중 B446 균주를 본 연구의 일차대상으로 선정하였다. 전반적으로 해양성 세균에서는 SOD의 활성이 거의 보편적인 현상으로 여겨질 만큼 일반적으로 검출된다.
성능/효과
- HPLC-GPC 에서는 분자량 75kD에 해당되는 위치에 SOD peak가 나타나는데 정제된 SOD의 sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis 결과 43 kD과 30kD에서 2 개의 band를 확인할 수 있어 (결과는 명시하지 않음) 본 SOD는 43kD과 30kD의 분자량을 갖는 2개의 subunit으로 구성된 heterodimer로 주정되었다.
- NaNg는 azide ion 그자체로서 nitrogen radical 이고 乌。?는 Fenton 반응 등을 통해 복잡한 oxygen radical을 형성시켜 Cu/ Zn-SOD와 Fe-SOD에 특이적인 저해제로 작용하며 NaCNe CW Zn-SOD나 cyto-chrom oxidase의 저해제로 알려져있어 본 결과만로는 본 효소의 cofactor를 결론내리기는 어렵다. Transition metal ion과의 반응성이 비교적 낮은 NaF에 의해서는 오히려 효소 활성이 다소 증가하는 결과가 나타났다(Fig. 5).
- 본 균주의 최적 배지 선정을 위하여 ZoBell, Sea water complete, 75% sea water LB 배지 등을 사용하여 성장과 단위 균체당 SOD 활성을 검사한 growth curve를 구한 결과 Sea water complete가 가장 우수한 배지로 밝혀져 이를 주 배양 배지로 사용하였다. 균체를 SWC 배지에서 배양한 결과 배양 20 시간에서 최대의 효소 활성도를 보였으며 이 때의 건조 균체량은 3.5 g/l였으며 활성은 428 Unit/g dry cell 이었다. 본 SOD는 cell mass에 따라 그 함량이 비례하여 증가하는 양상을 보였으며 stationary phase에 도달하면 급속히 활성이 낮아지는 현상을 보였다.
- 이러한 경향은 Mn(II)나 Cu(II)에서도 유사하게 나타나 이들 2 금속이온은 SOD 반응의 증대효과가 거의 없었다. 금속 이온의 chealator인 EDTA의 경우는 낮은 농도에서는 chealation 효과보다 전자공여체로서의 역할이 커서 10mM까지는 저해 현상 대신 약간의 증진효과를 보였으나 50mM이상의 농도에서는 저해 현상을 보였다. Fe(II) ion의 특이적인 chealator인 1, 10-phenathroline 은 10mM에서 90 %정도의 효소활성을 저해하였다.
- 금속이온의 영향에서 Fe(II)와 Mg(II)의 경우 효소의 활성을 증가시키는 경향을 보였는데 Fe(II)는 1 mM 농도에서는 약간의 활성 감소를 보이고 있으나 10 mM 에서는 4 unit의 활성을 보이고 있으며 50mM에서는 12.5 Unit의 활성을 나타내는 등 매우 뚜렷한 활성 증가 효과를 보이고 있어 본 효소가 Fe-SOD로 추정되었다. 그러나 SOD 반응의 결과 형성되는 일차 산물이 hydrogen peroxide임을 고려하면 형성된 hydrogen peroxide가 Fe(U)와 반응(Fenton reaction)하여 hydroxide ion과 hydroxyl radical 을 형성하므로 이렇게 형성된 hydroxyl radical 이 superoxide radical과 반응하여 superoxide radical과 hydroxyl amine의 반응을 저해하여 결과적으로 SOD 반응성이 높아진 것처럼 보일 가능성도 있다.
- 2). 또 반응의 최적 pH는 pH 8로 나타났으나 여러 pH에서의 효소의 안정성은 최적활성이 pH 8에서 나타난 것과는 달리 pH 6에서 최적으로 나타났으며 pH 8에서는 pH 6에 비하여 약 85% 정도의 활성이 24시간 후 남아있었다 (Fig. 3, 4).
- 5 g/l였으며 활성은 428 Unit/g dry cell 이었다. 본 SOD는 cell mass에 따라 그 함량이 비례하여 증가하는 양상을 보였으며 stationary phase에 도달하면 급속히 활성이 낮아지는 현상을 보였다. 이에 따라 효소생산을 위한 균주회수의 시기는 초기 stationary phase에서 수행하였다.
- 해양미생물로부터 유용효소 검색을 위하여 분리된 균주는 본 기간 중 모두 2, 500 여 균주였으며 여기서 고역가의 SOD 생산 균주는 145 균주였다. 이들 중 가장 효소활성이 우수한 균주는 균주번호 B446과 B328로 이들 중 B446 균주를 본 연구의 일차대상으로 선정하였다.
- 해양세균 B446에서 분리된 SOD의 일반적인 특성을 알기 위한 실험에서 최적반응 온도는 본 효소는 35℃로 나타났으며 25 에서는 35℃에 비해 약 85% 정도의 활성을 보이고 있어 비교적 최적 온도 범위가 넓은 것으로 나타난다(Fig. 1). 또 pH 8에서 열에 대한 안정성은 4℃에서는 24시간 동안 활성의 손실이 거의 없었으나 35℃에서는 24시간 후 거의 모든 활성이 사라짐을 볼 수 있었다(Fig.
후속연구
- 본 고에서 보고한 균주 탐색과 효소 정제 그리고 기초적인 효소 특성 조사 등에 사용된 FMN의 광환원에 의한 SOD assay 방법은 본 연구와 같은 SOD 효소뿐만 아니라 SOD 활성을 보이는 저분자 물질(항산화제)의 탐색이나 분석(6, 11)에도 잘 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
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