Protease inhibitors (PI) of trypsin and papain as target proteases from the roe of bastard halibut Paralichthys olivaceus were fractionated out using ammonium sulfate precipitation (A), DEAE 650M anion exchange chromatography (D), and Sephacryl S-300 gel filtration (S). The recovery percentages of t...
Protease inhibitors (PI) of trypsin and papain as target proteases from the roe of bastard halibut Paralichthys olivaceus were fractionated out using ammonium sulfate precipitation (A), DEAE 650M anion exchange chromatography (D), and Sephacryl S-300 gel filtration (S). The recovery percentages of the fractions with the strongest inhibitory activity for each fractionation method were 13% for the A4 fraction, 21.2% for the D3 fraction, and 21.3% for the S2 fraction, with specific inhibitory activities of the fractions toward trypsin and casein of 168, 139, and 218 U/mg, respectively, while no inhibition of papain was observed. The $IC_{50}$ for the trypsin-specific substrate $N{\alpha}$-benzoyl-$\small{L}$-arginine-p-nitroanilide (BAPNA) was 0.65, 1.55, 2.26, and 2.85 mg/mL for the A4, S2, A3, and D3 fractions, respectively. These results suggest that chromatographic fractionation methods (D and S) based on the molecular mass and charge of the protein were more effective at fractionating PI than was ammonium sulfate precipitation based on protein solubility, and that the bastard halibut roe extract acts as a serine protease inhibitor. Therefore, the PI fraction from fish roe might be useful for inhibiting proteases in foodstuffs, and could constitute an alternative food-grade inhibitor for the surimi industry.
Protease inhibitors (PI) of trypsin and papain as target proteases from the roe of bastard halibut Paralichthys olivaceus were fractionated out using ammonium sulfate precipitation (A), DEAE 650M anion exchange chromatography (D), and Sephacryl S-300 gel filtration (S). The recovery percentages of the fractions with the strongest inhibitory activity for each fractionation method were 13% for the A4 fraction, 21.2% for the D3 fraction, and 21.3% for the S2 fraction, with specific inhibitory activities of the fractions toward trypsin and casein of 168, 139, and 218 U/mg, respectively, while no inhibition of papain was observed. The $IC_{50}$ for the trypsin-specific substrate $N{\alpha}$-benzoyl-$\small{L}$-arginine-p-nitroanilide (BAPNA) was 0.65, 1.55, 2.26, and 2.85 mg/mL for the A4, S2, A3, and D3 fractions, respectively. These results suggest that chromatographic fractionation methods (D and S) based on the molecular mass and charge of the protein were more effective at fractionating PI than was ammonium sulfate precipitation based on protein solubility, and that the bastard halibut roe extract acts as a serine protease inhibitor. Therefore, the PI fraction from fish roe might be useful for inhibiting proteases in foodstuffs, and could constitute an alternative food-grade inhibitor for the surimi industry.
, 2011)를 통해 8종의 어류 알 모두에서 protease inhibitor의 분포가 확인된 바 있다. 본 연구에서는 생산량이 많아 폐기되는 가공부산물의 발생량 또한 많은 넙치를 대상으로, 가공부산물 중에서 쉽게 채취가 가능한 알로부터 단백질 유용성분으로 protease inhibitor를 이용하고자 crude extract를 추출하고, 이를 단백질의 성질(용해도, 하전, 분자량 차이)을 이용한 분획방법을 통하여 분획을 시도하고, 수율 및 총 저해활성을 통해 분획효과를 검토함으로써 protease inhibitor의 산업적 응용을 위한 기초자료를 제시하고, 버려지는 폐자원의 up-circling을 통한 고부가가치 창출과 surimi 산업에 기여하고자 한다.
제안 방법
넙치 알 CE는 Kim et al. (2013a)의 방법을 다소 수정하여 조제하였다. 즉, 냉동상태의 시료를 부분해동 및 마쇄한 다음, 마쇄한 어류 알(100 g)에 대하여 3배(w/v)의 탈 이온수를 가하여 혼합한 다음, 1시간 간격으로 교반 하면서 추출하였다(20℃, 6 h).
Target protease (0.1% trypsin 및 papain을 각각 30 μL 및 100 μL씩)에 대하여 넙치 알로부터 추출한 100 μL의 CE를 각각 가하여 전 단계 반응(40℃, 30 min)을 실시한 후, 여기에 기질의 최종농도가 일정하게 되도록 첨가(BAPNA 기질의 경우 0.6 mM 및 casein 기질의 경우 0.3%)하여, 최적 효소활성조건(pH 9.0, 40℃, 1 h)에서 반응시켜, 앞서 서술한 효소활성 측정 방법에 따라 반응액의 흡광도를 측정하였다. CE 및 각 fractions의 target protease에 대한 상대 저해활성(relative inhibitory activity, RIA)은 CE 및 각 fractions을 첨가하지 않은 대조구로서 효소활성(C)에 대하여 저해제(CE 및 각 fractions)를 첨가한 저해활성(A)을 이용하여 다음과 같은 식으로 산출하였다.
그러나 casein 기질에 대한 papain 저해활성은 4개의 fractions 모두에서 9% 미만의 활성을 보여 cysteine protease inhibitor의 분포는 확인되지 않았다. 단백질의 하전세기로 분획한 이들 fractions (D1-4)은 농축 및 투석과정을 거친 다음, trypsin 및 papain의 저해활성을 측정하여 분획효율에 대해 살펴보았다. Table 2는 음이온교환 수지를 통하여 분획된 4개의 fractions의 casein 및 BAPNA 기질에 대한 trypsin 저해활성(TIA, U)과 recovery (%)에 대한 결과를 나타낸것이다.
6 mM BAPNA 기질과 혼합한 다음, 앞서 서술한 효소활성 측정 조건에서 반응시켜 반응액의 흡광도(410 nm)를 측정하였다. 이때의 각 농도별 저해활성(RIA, %) 결과를 토대로 회귀방정식을 구하고, trypsin 활성의 50%를 감소시키는 저해제의 농도(IC50, mg/mL)를 환산하여 나타내었다.
즉, CE에 대하여 ammonium sulfate를 첨가(ammonium sulfate의 농도를 20%씩 증가시키면서 포화농도가 될 때까지 첨가)하여 순차적으로 4개(A1, 0-20%; A2, 20-40%; A3, 40-60% 및 A4, 60-80% 포화농도)의 fraction으로 분획하였다. 이어서 포화농도 별로 분획한 ammonium sulfate fractions을 원심분 리(12,000 g, 20 min) 한 다음, 그 잔사를 최소량의 탈 이온수로 용해 및 투석하여 fraction별 특성을 조사하기 위한 시료로 사용하였다.
CE로부터 protease inhibitor의 분획은 단백질 용해성(solubility)을 이용한 ammonium sulfate 분획법으로 실시하였다. 즉, CE에 대하여 ammonium sulfate를 첨가(ammonium sulfate의 농도를 20%씩 증가시키면서 포화농도가 될 때까지 첨가)하여 순차적으로 4개(A1, 0-20%; A2, 20-40%; A3, 40-60% 및 A4, 60-80% 포화농도)의 fraction으로 분획하였다. 이어서 포화농도 별로 분획한 ammonium sulfate fractions을 원심분 리(12,000 g, 20 min) 한 다음, 그 잔사를 최소량의 탈 이온수로 용해 및 투석하여 fraction별 특성을 조사하기 위한 시료로 사용하였다.
대상 데이터
넙치(Bastard halibut, Paralichthys olivaceus) 알은 통영시 소재 수산시장에서 활어상태로 구입하여, 실험실에서 알을 분리하여 초저온 냉동고(−70℃)에 보관하여 두고 실험에 사용하였다.
이론/모형
넙치 알 CE 및 fractions의 단백질 농도는 Lowry et al. (1951)의 비색법에 따라 bovine serum albumin을 표준 단백질로 하여 구한 검량곡선으로부터 측정하였다.
0)는 Dawson et al. (1986)의 방법에 따라 조제하였다.
(1966)의 방법을 다소 수정한 Ji et al. (2011) 방법에 따라 측정하였다. 즉, casein 기질에 대해서는 50 μL의 0.
CE로부터 protease inhibitor의 분획은 단백질 용해성(solubility)을 이용한 ammonium sulfate 분획법으로 실시하였다. 즉, CE에 대하여 ammonium sulfate를 첨가(ammonium sulfate의 농도를 20%씩 증가시키면서 포화농도가 될 때까지 첨가)하여 순차적으로 4개(A1, 0-20%; A2, 20-40%; A3, 40-60% 및 A4, 60-80% 포화농도)의 fraction으로 분획하였다.
CE로부터 크로마토그래피법에 의한 protease inhibitor의 분획은 anion exchange chromatography 및 gel filtration chromatography에 따라 실시하였다. 먼저, 이온강도 차이에 의한 분획은 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.
8)를 혼합하여 전기영동용 시료로 사용하였다. Walker(2002)의 방법에 따라, 10% Mini-PROTEANⓇTGXTM precast gel을 Mini-PROTEAN Tetra cell (Bio-Rad Lab. Inc.
성능/효과
단백질 하전의 차이(D1-4) 및 분자량 크기(S1-4)에 의한 분획효과는 각 fraction별 protein band의 분포가 다르게 나타났을 뿐만 아니라(Fig. 3), 저해활성(Table 2 및 3)에 있어서도 D3 (0.24-0.29 M NaCl) 및 S2 (분자량 55-35 K) fraction 만이 현저한 저해활성 강도를 나타냄으로써 그 분획효과가 인정되었다.
그리고 4개의 fractions의 casein 기질에 대한 papain 저해활성은 보이지 않았다(데이터 미제시). BAPNA 기질에 대하여는, CE의 TIA 및 recovery는 42,862.4 U 및 100%로서, D3는 각각 23,175.6 U 및 54.1%이었으나, 나머지 fractions에서는 저해활성을 나타내지 않았다. 또한 SIA (U/mg)에 있어서도 D3는 1,355.
54-63)에서 casein 기질에 대한 trypsin 저해활성을 나타내는 fractions이 용출되었다. Chromatogram 상의 trypsin 저해활성(RIA, %)은 비흡착 획분인 D1이 약 5-59%의 저해활성 분포를 보였으며, D2는 11-62%, D3는 3-61% 그리고 D4는 17-62%에 해당하는 저해활성을 나타내어, serine protease inhibitor가 분포하는 것이 확인되었다. 그러나 casein 기질에 대한 papain 저해활성은 4개의 fractions 모두에서 9% 미만의 활성을 보여 cysteine protease inhibitor의 분포는 확인되지 않았다.
65 mg/mL로서 가장 저해활성이 강한 것으로 나타났으며, S2, A3 그리고 D3의 순이었다. IC50의 결과로만 국한하여 분획방법에 따른 효과를 판단한다면, ammonium sulfate를 이용한 분획이 넙치 알 CE로부터 protease inhibitor를 효율적으로 얻을 수 있는 방법이라 판단되었다. 그러나 BAPNA 기질 대한 trypsin 저해활성으로 살펴 본(Table 1-3) 분획방법간의 recovery(%)와 purity (fold)를 고려한 분획효율(recovery×purity) 측면에서는 D3 (259.
Chromatogram 상의 trypsin 저해활성(RIA, %)은 비흡착 획분인 D1이 약 5-59%의 저해활성 분포를 보였으며, D2는 11-62%, D3는 3-61% 그리고 D4는 17-62%에 해당하는 저해활성을 나타내어, serine protease inhibitor가 분포하는 것이 확인되었다. 그러나 casein 기질에 대한 papain 저해활성은 4개의 fractions 모두에서 9% 미만의 활성을 보여 cysteine protease inhibitor의 분포는 확인되지 않았다. 단백질의 하전세기로 분획한 이들 fractions (D1-4)은 농축 및 투석과정을 거친 다음, trypsin 및 papain의 저해활성을 측정하여 분획효율에 대해 살펴보았다.
S2의 경우, weakly cationic과 anionic protein band가 각각 관찰되었다. 단백질 용해도 차이에 의한 분획효과(A1-4)는 전기영동 결과에서도 나타났듯이 각 포화농도별 protein band의 분포가 각기 다르게 나타남으로써 그 분획효과가 인지되었으며, A fractions의 저해활성 비교(Table 1)에서도 40-60% 및 60-80% 포화농도 fractions (A3 및 A4)이 trypsin 저해활성이 강한 것으로 확인됨에 따라, 목적하는 protease inhibitor를 얻기 위해서는 비교적 고포화농도의 ammonium sulfate를 사용하여야 분획 가능할 것으로 판단되었다. 단백질 하전의 차이(D1-4) 및 분자량 크기(S1-4)에 의한 분획효과는 각 fraction별 protein band의 분포가 다르게 나타났을 뿐만 아니라(Fig.
2%를 차지하였다. 따라서, casein 및 BAPNA에 대한 trypsin 저해활성으로 살펴 본, 넙치 알 CE로부터 ammonium sulfate를 이용한 분획은 40-60% 및 60-80% 포화농도에서 protease inhibitor가 분획되는 것이 확인되었다. 한편, 넙치 알 CE 및 A fractions의 casein 기질에 대한 papain 저해활성(데이터 미제시)은 나타나지 않았다.
3과 같다. 먼저, 넙치 알 CE에는 gel 상단에 2-3개의 전기적으로 cationic protein band, 이 보다 아래쪽에 전기적으로 weakly cationic protein band 및 weakly anionic protein band가 분포하는 것이 확인되었다. CE를 포함한 분획방법별 fractions는 공통적으로 cationic protein band가 관찰되었으며, trypsin 저해활성을 나타낸 fractions 중에서, A3는 weakly cationic과 anionic protein band 분포하는 반면에 A4는 weakly anionic protein band가 두드러진 것으로 나타났다.
4는 분획 방법에 대한 최적 fractions (A3, A4, D3 및 S2)의 BAPNA 기질 대한 trypsin 저해활성을 IC50 (mg/mL)으로 나타낸 것이다. 본 실험조건에서 IC50은 trypsin의 BAPNA에 대한 효소활성을 50% 수준으로 감소시키는 저해제의 농도로서, A4가 0.65 mg/mL로서 가장 저해활성이 강한 것으로 나타났으며, S2, A3 그리고 D3의 순이었다. IC50의 결과로만 국한하여 분획방법에 따른 효과를 판단한다면, ammonium sulfate를 이용한 분획이 넙치 알 CE로부터 protease inhibitor를 효율적으로 얻을 수 있는 방법이라 판단되었다.
, 2013b). 본 연구결과에서 추출물로부터 ammonium sulfate 분획법(A4 및 A3)의 1회 처리량(285 mL)이 chromatography 분획법의 처리량(7 mL)에 비해 월등히 많아 회수율 또한 높은 것으로 나타났으나, 회수율과 정제도를 고려한 분획효율에서는 연속처리가 가능한 chromatography 분획법(D3 및 S2)이 우수한 것으로 확인되어, 넙치 알 CE로부터 protease inhibitor의 산업적 이용을 고려한 효율적 분획을 위해서는 대량처리 및 연속처리가 가능한 방안을 마련해야 할 것으로 판단되었다.
, 2013b). 이상의 결과와 보고를 통해, 최적 획분은 회수율과 정제도를 고려한 획분을 선정하여야 할 것으로 판단되며, trypsin 저해활성에 있어 casein 기질에 대하여는 총 저해활성에서는 각 획분간에 차이가 두드러지지 않았지만, BAPNA 기질에는 D3만이 저해활성이 인정됨으로써, 음이온 교환수지를 이용한 넙치 알의 protease inhibitor의 분획은 0.24-0.29 M NaCl 농도에서 용출되는 fraction을 얻는 것이 효율적이었다.
5배 강한 저해활성을 나타내었다고 보고한 바 있다. 이상의 결과와 보고에서, 강한 저해활성을 나타내는 분획농도에서의 차이는 본 연구의 넙치 알 CE의 단백질농도(21.5 mg/mL)가 어류 알(Kim et al., 2013a)의 단백 질농도(5.3-9.2 mg/mL)에 비하여 최소 2배 이상 높아, 단백질과 ammonium sulfate의 상호 용해도에 영향을 미쳐 나타난 결과로 초기 crude extract의 단백질 농도와 분획 농도간에 상호관련이 있는 것으로 추정되었다.
후속연구
, 2013a), 단백질의 하전세기에 따른 분획방법 (ion exchange chromatography)은 회분식(batch식)으로 분획할 경우, 상온에서 비교적 단시간에 이용 가능하며, 용해도 차이에 의한 분획방법 보다 분획효과가 좋은 점 등이 있지만, 탈염 및 농축을 위한 방안이 반드시 마련되어야 한다(Roe, 1989). 또한 단백질의 분자량 크기에 따른 분획방법(gel filtration)은 재현성과 연속처리가 가능한 점, 분획 후 별도의 처리(탈염 및 농축)가 최소화되는 점에서 단백질 유용자원의 분획에 효과적이라고 할 수 있으나, 대량처리를 위한 산업화 공정의 개발이 필요할 것으로 생각된다(Preneta, 1989; Kim et al., 2013b). 본 연구결과에서 추출물로부터 ammonium sulfate 분획법(A4 및 A3)의 1회 처리량(285 mL)이 chromatography 분획법의 처리량(7 mL)에 비해 월등히 많아 회수율 또한 높은 것으로 나타났으나, 회수율과 정제도를 고려한 분획효율에서는 연속처리가 가능한 chromatography 분획법(D3 및 S2)이 우수한 것으로 확인되어, 넙치 알 CE로부터 protease inhibitor의 산업적 이용을 고려한 효율적 분획을 위해서는 대량처리 및 연속처리가 가능한 방안을 마련해야 할 것으로 판단되었다.
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